DB22-T 3289-2021 玉木耳液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

65.020CCS

B

0522 DB22/T

3289—2021玉木耳液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程A

code

of

production

of

吉林省市場監(jiān)督管理廳 發(fā)

布DB22/T

3289—2021 本文件按照GB/T

—《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本文件由吉林省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、黑龍江黑臻生物科技有限公司。本文件主要起草人：李曉、張波、徐安然、錢可晴、楊迪、劉宗、Samwel、馬世玉。DB22/T

3289—20211 范圍錄與檔案。描述了生產(chǎn)記錄等追溯方法。本文件適用于玉木耳液體菌種的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件文件。GB/T

150.4 壓力容器

第四部分：制造、檢驗和驗收GB

4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB

5749 生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T

食用菌術(shù)語GB

50073 潔凈廠房設(shè)計規(guī)范NY/T

綠色食品

產(chǎn)地環(huán)境質(zhì)量NY/T

食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T

1846 食用菌菌種檢驗規(guī)程DB22/T

2603 玉木耳菌種3 術(shù)語和定義GB/T

12728

界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1玉木耳 white

wood

earAuricularia

cornea20160023.2液體菌種liquid

spawn培養(yǎng)基為液體狀態(tài)的菌種。[來源：GB/T

12728—2006，2.5.30]。3.3液體菌種發(fā)酵罐

apparatus

for

spawn食用菌液體菌種培養(yǎng)專用設(shè)備，要求不銹鋼材質(zhì)，并符合

GB/T

150.4

的要求。3.4接種量

DB22/T

3289—2021接入發(fā)酵罐中的食用菌菌種數(shù)量，用菌種體積與培養(yǎng)基體積的百分比表示。3.5發(fā)酵罐空消 empty

fermenter

對尚未加水投料的空發(fā)酵罐進行高壓蒸汽滅菌。3.6發(fā)酵罐實消 full

對投料后的發(fā)酵罐進行高壓蒸汽滅菌。4 生產(chǎn)流程玉木耳液體菌種生產(chǎn)流程見圖

1。圖1

液體菌種生產(chǎn)流程圖5 生產(chǎn)要求5.1 生產(chǎn)條件5.1.1 人員要求從事液體菌種生產(chǎn)的各級操作人員應(yīng)具有食用菌菌種生產(chǎn)或檢驗人員從業(yè)資格證方可上崗。5.1.2 環(huán)境衛(wèi)生5.1.2.1 場地地勢平坦且干燥、空氣優(yōu)良、通風(fēng)好，排水順暢，交通便利，水源電源充足，水質(zhì)應(yīng)符合

GB

5749

要求。5.1.2.2 附近

3000

m

無廢水、廢氣、廢渣、粉塵、煙塵和垃圾場、畜禽場等污染源，環(huán)境衛(wèi)生指標(biāo)應(yīng)符合

NY/T

的規(guī)定。5.1.3 生產(chǎn)車間DB22/T

3289—2021地面防水、防腐蝕、防滲漏、防滑、易清洗，應(yīng)有

1.0°～1.5°的排水坡度和排水系統(tǒng)，排水溝應(yīng)是圓弧式的明溝；墻壁和天花板能防潮、防霉、防水、易清洗。5.1.4 接種車間應(yīng)按照

GB

50073

規(guī)定執(zhí)行。5.1.5 液體菌種生產(chǎn)車間5.1.5.1 水、電（停電需配備發(fā)電機）、蒸汽、空氣循環(huán)四大系統(tǒng)配備完善保證生產(chǎn)需求。5.1.5.2 液體菌種生產(chǎn)車間應(yīng)按照

GB

50073

規(guī)定執(zhí)行。5.1.6 生產(chǎn)設(shè)施養(yǎng)室、化驗室和菌種保藏室，且布局合理，規(guī)模配套。其中部分場所應(yīng)達到如下要求：a)

搖瓶培養(yǎng)室和發(fā)酵罐培養(yǎng)室應(yīng)配備調(diào)溫設(shè)施，空間潔凈度達到十萬級；b)

無菌接種室潔凈度達到萬級，接種機位置空氣潔凈度達到百級；c)

化驗室和菌種保藏室有相應(yīng)實驗檢測設(shè)備和滅菌設(shè)施及常規(guī)用具。5.1.7 生產(chǎn)設(shè)備子稱、電子天平、pH

5.1.8培養(yǎng)原料所用原料應(yīng)符合

NY/T

的要求，生物制劑和天然材料的水不溶性固體物料應(yīng)小于

40

目。5.1.9 生產(chǎn)品種省級以上農(nóng)作物品種審定委員會審（認）定或登記（備案）的品種，并符合

DB22/T

2603

的要求。5.2 生產(chǎn)技術(shù)5.2.1 母種制備使用母種固體培養(yǎng)基，配方參見附錄

A.1，生產(chǎn)應(yīng)符合

NY/T

528

的要求。5.2.2 搖瓶菌種制備5.2.2.1 培養(yǎng)基配方配方按照附錄

。5.2.2.2 培養(yǎng)基制備

200

g

15

min，用

4

層濕紗布過濾得濾液，再加入其余原料至溶解，定容至

1000

mL。DB22/T

3289—20215.2.2.3 分裝使用

mL～1000

mL

121

℃

高溫的無色玻璃三角瓶，裝液量為三角瓶容積的

1/3～3/5，在三角瓶中放入兩粒轉(zhuǎn)子，使用棉塞封瓶口，棉塞外加蓋四層紗布，滅菌時棉塞外加蓋牛皮紙防潮。5.2.2.4 高壓滅菌將分裝好的三角瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)進行高壓滅菌，121

℃

滅菌

30

壓待溫度降至

℃

以下，打開滅菌鍋將裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶取出放入接種室。5.2.2.5 冷卻接種三角瓶液體培養(yǎng)基自然冷卻至

25

℃

的接種針挑取

8

塊

～

塊（2～3）mm

×（2～3）mm

母種菌塊迅速轉(zhuǎn)接于待接種搖瓶培養(yǎng)基內(nèi)，封瓶口，接種完成后貼好標(biāo)簽。5.2.2.6 恒溫培養(yǎng)具體操作與要求如下：a)

培養(yǎng)室消毒：培養(yǎng)室使用前

2

d

采用臭氧發(fā)生器消毒，并用

的新潔爾滅溶液或

75%

擦拭消毒恒溫培養(yǎng)箱和恒溫振蕩搖床；b)

培養(yǎng)條件：將三角瓶放入

25

℃

恒溫箱中靜置培養(yǎng)

1

d，然后置于磁力攪拌器或恒溫搖床上培養(yǎng)，溫度控制在

℃

±

1

℃，轉(zhuǎn)速

140

rpm～160

，培養(yǎng)時間

7

d～9

d。5.2.2.7 菌種標(biāo)準(zhǔn)檢驗具體操作與要求如下：a)

菌絲形態(tài)：靜止

10

min

后觀察，菌球下沉（占

以上）且呈白色，上清液澄清透明，表面無或有少量泡沫，菌球顆粒大小均勻一致，菌球表面菌絲呈刺球狀；b)

酸堿度：

～

之間；c)

鏡檢：平皿顯微鏡下觀察無雜菌。5.2.3 發(fā)酵罐液體菌種制備5.2.3.1 發(fā)酵罐檢查及發(fā)酵罐空消具體操作與要求如下：a)

檢查液體菌種發(fā)酵罐上全部閥門及壓力表，要求無損壞并能正常工作；b)

清洗待用發(fā)酵罐內(nèi)壁、用水沖洗安全閥、壓力表、罐蓋，確保無雜物、無菌皮；c)

發(fā)酵罐初次使用、出現(xiàn)雜菌、長期放置或更換品種等情況出現(xiàn)其一時應(yīng)進行發(fā)酵罐空消，空消要求蒸汽壓力

0.12

、溫度為

℃、滅菌

min。5.2.3.2 液體培養(yǎng)基制備按照附錄

配方稱取原料，原料應(yīng)符合

GB

中的規(guī)定，用水符合

5749

中的要求。5.2.3.3投料定容DB22/T

3289—2021

～70%

0.03%

空氣攪拌

1

min～2

min

混合均勻，將液體菌種發(fā)酵罐口擦干后蓋上罐蓋，擰緊螺絲，再次檢查發(fā)酵罐各部位安裝是否合格。5.2.3.4 發(fā)酵罐實消

121

℃

80

min，溫度不應(yīng)低于

121

5.2.3.5 冷卻和調(diào)壓

110

0Mpa

時，打開空氣壓縮機開關(guān)，給發(fā)酵罐通入無菌空氣，當(dāng)溫度降至

℃

時關(guān)閉冷卻水。5.2.3.6 接種具體操作步驟與要求如下：a)

接種前，接種人員清洗雙手，然后再用

酒精消毒；b)

關(guān)閉通風(fēng)系統(tǒng)，接種結(jié)束后再開啟；c)

調(diào)整發(fā)酵罐微量進氣，保持正壓；d)

用酒精棉擦拭接種口附近，并用酒精噴燈消毒；e)

接種口周圍放置酒精棉并點燃，關(guān)閉排氣閥，打開接種口，拿取搖瓶菌種在火焰上方拔掉瓶塞，灼燒瓶口

s～13

s

后將菌種倒入發(fā)酵罐中，接種量為

；f)

灼燒接種口蓋子

8

s～10

s

后蓋好接種口；g)

打開排氣閥，調(diào)整進氣量。5.2.3.7 培養(yǎng)具體操作與要求如下：a)

罐內(nèi)換氣量

1:

～

V/V（料液體積/空氣體積），即接種完畢

1

d～2

d

3

d

后逐漸加大進氣量，5

d～6

d

后大進氣量進氣，6

d～7

d

b)

溫度始終控制在

25

℃±2

℃；c)

罐內(nèi)壓保持在

0.05

MPa。5.2.4 罐內(nèi)液體菌種純度檢測發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng)至

h～72

h，應(yīng)對罐內(nèi)菌種進行一次雜菌檢測，具體檢測內(nèi)容及要求見附錄

B。5.2.5 罐內(nèi)液體菌種質(zhì)量檢測8

d

后達到放罐質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)即可放罐,

發(fā)酵罐液體菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參見附錄

C度均保持在

25

℃

±2

℃，應(yīng)在

4

h

內(nèi)完成接種。5.2.6 放罐接種放罐接種應(yīng)按下列步驟進行：a)

連接接種管道，通蒸汽消毒

30

min，待管道冷卻后連接至菌種罐；DB22/T

3289—2021b)

調(diào)整菌種罐壓力穩(wěn)定后打開閥門送菌種，開始接種，接種量為

25

mL

～

30

mL；c)

；d)

排掉用完的菌種罐剩余菌種，清洗菌種罐。6 貯存

于

10

℃。發(fā)酵罐內(nèi)液體菌種應(yīng)持續(xù)通入無菌空氣，保持罐壓

0.01

～

MPa，可存放

2

d。7 記錄與檔案母種、搖瓶液體菌種和發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)的每個環(huán)節(jié)都要有詳實的記錄，記錄內(nèi)容按附錄

D

執(zhí)行。由具體操作人員現(xiàn)場填寫記錄，定期由主管領(lǐng)導(dǎo)審核，簽字后歸檔保存，檔案應(yīng)保存

3

年以上。DB22/T

3289—2021

附 錄 A（資料性）玉木耳菌種培養(yǎng)基配方A.1 母種固體培養(yǎng)基配方馬鈴薯

200

g，葡萄糖

g，瓊脂

18

g，磷酸二氫鉀

1

g，硫酸鎂

g，水定容至

1000

mL，pH

自然。A.2 母種液體菌種培養(yǎng)基配方馬鈴薯

200

g，葡萄糖

g，蛋白胨

3

g，磷酸二氫鉀

1

g，硫酸鎂

0.5

g，水定容至

1000

mL，pH

自然。A.3 發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基配方玉米粉

2.25

kg，黃豆粉

2.25

，葡萄糖

3.75

，白砂糖

3.75

kg，磷酸二氫鉀

0.75

kg，硫酸鎂0.375

kg，消泡劑

，水定容至

600

L。檢測內(nèi)容要

求

按照無菌操作從取樣閥取少量培養(yǎng)液，接種于

GB/T

中規(guī)定的

PDA

培養(yǎng)基中，置于28

48

，采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長狀況和有無雜菌污染；若出現(xiàn)白色以外

NY/T

GB/T

28

NY/T

1846

pH

pH

pH

pH

DB22/T

3289—2021

附 錄B（規(guī)范性）發(fā)酵罐液體菌種檢測發(fā)酵罐液體菌種檢測見表

B.1。表B.1

表B.1

發(fā)酵罐液體菌種檢測檢測