蠶絲磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)的抗真菌功能研究

蠶絲磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)的抗真菌功能研究家蠶屬于鱗翅目昆蟲,是一類典型的泌絲昆蟲,每當家蠶化蛹之時都會吐絲結(jié)繭。在家蠶由蛹化蛾的這十天時間之中,蠶繭作為重要的防御屏障,在應(yīng)對外界微生物入侵時發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用。那么蠶繭中到底有哪些組分能夠抵御外界微生物的入侵呢?2013年,本實驗室利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對蠶絲中的蛋白組分進行了鑒定,發(fā)現(xiàn)蠶絲中除了有絲素和絲膠外,還存在很多蛋白酶抑制劑、酶和未知功能蛋白。之前的研究已經(jīng)證明了蠶絲中的蛋白酶抑制劑和seroin蛋白具有抑制微生物生長的活性。蠶絲中是否還存在有其他類型的抗菌蛋白質(zhì)呢?蠶絲中抗菌蛋白的研究對于闡明昆蟲防御病原微生物的系統(tǒng)以及開發(fā)具有抗菌功能的蠶絲都有著非常重要的意義。我們前期的研究中從蠶繭中鑒定到一個磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-bindingprotein,PEBP),發(fā)現(xiàn)其在蠶絲中的含量非常高,果蠅中的同源蛋白可以通過激活免疫途徑來發(fā)揮功能。果蠅中PEBP的過表達可以幫助幼蟲抵御細菌的感染,提高幼蟲的成活率。然而,目前沒有證據(jù)表明果蠅的PEBP可以直接抑制微生物的生長,且果蠅中PEBP參與免疫的具體機制仍不清楚。本研究期望闡明家蠶PEBP(BmPEBP)蛋白的生物學(xué)功能,解析BmPEBP蛋白在蠶絲中發(fā)揮功能的具體機制。我們從序列與進化、表達與分布特征、抗菌活性與機制等幾個方面對BmPEBP進行了研究。主要研究結(jié)果如下:1、BmPEBP的基本信息分析我們從silkDB中獲取得到BmPEBP蛋白的氨基酸序列并在NCBI中進行檢索。利用生物信息學(xué)分析方法對昆蟲、植物、哺乳動物中PEBP蛋白進行了系統(tǒng)進化及序列比對分析。發(fā)現(xiàn)昆蟲、植物和哺乳動物的PEBP蛋白明顯聚類為三支,昆蟲中PEBP蛋白在序列組成上高度保守;與植物和哺乳動物中的PEBP蛋白明顯的不同之處主要體現(xiàn)在很多昆蟲的PEBP含有信號肽,而植物和哺乳動物的PEBP蛋白都不含有信號肽,表明昆蟲的PEBP蛋白在進化過程中獲得了分泌到細胞外的能力。2、BmPEBP的原核表達、純化及生化分析根據(jù)BmPEBP的ORF序列設(shè)計引物并進行PCR擴增,把擴增得到的片段連接到原核表達載體pET-28a上,獲得重組表達質(zhì)粒pET28a-PEBP。隨后轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3),經(jīng)過誘導(dǎo)表達,在16℃上清中獲得了含His標簽的可溶性蛋白。經(jīng)過鎳柱親和層析以及凝膠過濾層析獲得純度達到95%以上的重組BmPEBP蛋白。利用圓二色譜分析BmPEBP蛋白的二級結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示在常溫狀態(tài)下BmPEBP蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以β折疊為主,為了驗證BmPEBP酸堿穩(wěn)定性,我們利用圓二色譜光譜對BmPEBP蛋白在pH值3到11這個范圍內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)進行分析,發(fā)現(xiàn)在此區(qū)間BmPEBP的結(jié)構(gòu)也處于一個較為穩(wěn)定的狀態(tài)。溫度穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)當溫度升高到60℃時,BmPEBP蛋白開始發(fā)生降解。3、BmPEBP的表達特征研究我們利用熒光定量PCR對BmPEBP基因的表達模式進行了檢測。組織表達譜發(fā)現(xiàn)BmPEBP基因在5齡第3天的絲腺中大量表達。時期表達譜進行分析發(fā)現(xiàn)BmPEBP基因在5齡第5天和5齡第7天高量表達。利用Westernblot的方法,發(fā)現(xiàn)5齡第7天BmPEBP蛋白主要存在于家蠶絲腺的中部;對蠶繭進行分層處理后,發(fā)現(xiàn)BmPEBP蛋白從蠶繭的外層到內(nèi)層含量逐漸減少。利用免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn)BmPEBP蛋白分布于單根蠶絲的最外層。因此,我們推測BmPEBP蛋白主要在家蠶5齡期的中部絲腺中合成,分泌到蠶絲的絲膠層中。4、BmPEBP的抗菌機制研究為了檢測BmPEBP蛋白是否具有抑菌活性。我們選取了兩種細菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)和四種真菌(白色念珠菌、釀酒酵母、球孢白僵菌、煙曲霉菌),對BmPEBP的抑菌能力進行了研究。熒光定量PCR和Westernblot結(jié)果表明BmPEBP在微生物誘導(dǎo)后會在脂肪體和血淋巴中有部分的上調(diào)。抑菌動力學(xué)曲線表明BmPEBP對白色念珠菌、釀酒酵母、球孢白僵菌和煙曲霉菌這四種真菌有較好的抑制作用,而對細菌基本沒有抑制活性。圓二色譜結(jié)果顯示磷脂酰乙醇胺(PE)能夠影響B(tài)mPEBP的二級結(jié)構(gòu),使得其由β折疊向α螺旋轉(zhuǎn)變。結(jié)合實驗表明BmPEBP能夠和磷脂酰乙醇胺(PE)發(fā)生特異性結(jié)合。通過進一步的研究分析,我們發(fā)現(xiàn)BmPEBP與白色念珠菌或釀酒酵母進行孵育后,