分子生物學(xué)基本技術(shù)

分子生物學(xué)根本技術(shù)—PCR(PolymeraseChainReaction)huahua2125@163PCR(PolymeraseChainReaction)一、歷史及其開(kāi)展二、PCR的根本原理三、Primerdesign引物常規(guī)設(shè)計(jì)原那么四、PCR反響體系五、PCR反響條件優(yōu)化〔PCRoptimization)六、PCR反響特點(diǎn)七、PCR產(chǎn)物的分析八、Molecularmarker九、PCR技術(shù)的運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)體系根本技術(shù)基因及產(chǎn)物分子檢測(cè)技術(shù)基因及產(chǎn)物獲取技術(shù)基因功能研討技術(shù)根本技術(shù)1.瓊脂糖凝膠電泳2.SDS電泳3.PCR技術(shù)4.細(xì)菌轉(zhuǎn)化聚合酶鏈?zhǔn)椒错?/p>

PCR(PolymeraseChainReaction)一、歷史及其開(kāi)展：1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與適宜引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷反復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為能夠，所以，Khorana的想象被人們遺忘了……1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反響〔PCR〕根本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)展PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的運(yùn)用使得PCR能高效率的進(jìn)展，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)展PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只需所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需參與新酶。1988年Saiki等從溫泉中分別的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。1993年：Mullis與開(kāi)創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變〞加拿大籍英國(guó)科學(xué)家MichaelSmith共獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)KaryMullis&MichaelSmith穆利斯〔KaryMullis〕美國(guó)化學(xué)家1944～史密斯〔MichaelSmith〕加拿大化學(xué)家1932～二、PCR的根本原理?PCR的根本原理：變性、復(fù)性、半保管復(fù)制?PCR三步曲Threesteps：Denaturation變性90～97℃Primerannealing退火45～55℃Polymerization延伸72℃原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反響混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在適宜條件下的這種循環(huán)的不斷反復(fù)?；叵耄篋NA的復(fù)制……

DNA解旋解鏈合成引物子鏈延伸ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶回想：DNA的復(fù)制……RNA引物RNA引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’引物酶引物酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延伸回想：DNA的復(fù)制……ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延伸TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3’DNA聚合酶DNA聚合酶回想：DNA的復(fù)制……PCR簡(jiǎn)要過(guò)程圖解PCR詳細(xì)過(guò)程圖解1234522557294時(shí)間〔min〕溫度〔℃〕適溫延伸3高溫變性1低溫退火2反復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性構(gòu)成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍模板DNA95℃150℃引物1引物2DNA引物2引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶3第1輪終了95℃第2輪開(kāi)場(chǎng)472℃TaqTaqTaqTaq5PCR的根本原理PCR反響條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增三、Primerdesign引物常規(guī)設(shè)計(jì)原那么1.長(zhǎng)度：15-37nt,普通20nt左右;(僅binding,不含接頭)2.G+C含量40％～60％，而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。3.防止聚嘌呤或聚嘧啶或有回文對(duì)稱構(gòu)造；4.引物本身不能互補(bǔ)〔<3個(gè)〕5.引物之間不能互補(bǔ)〔<5

個(gè)〕6.引物３端不能錯(cuò)配,不能修飾，盡量不用T,不能超越３個(gè)延續(xù)的G或C；7.５端可變化修飾，附加酶切位點(diǎn)；8.兩引物的Tm值應(yīng)比較接近；9.正鏈引物：mRNA序列照抄；負(fù)鏈引物：先寫(xiě)出mRNA序列的互補(bǔ)序列，然后翻轉(zhuǎn)重寫(xiě)。10．解鏈溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)[=<20nt]Tm=81.5+0.41*(GC%)-600/L[>20nt]Tm普通５５℃～８０℃［５５℃～５８℃最正確］PCR反響中結(jié)合溫度〔anneaningtemperature〕T=Tm-5℃P+、P-的設(shè)計(jì)方法四、PCR反響體系規(guī)范的PCR反響體系：

10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ulTemplate〔模板〕：ssDNA,dsDNAmRNAneededtobeRTascDNA模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。Primes〔引物〕：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需求的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，添加二聚體的時(shí)機(jī)。純化引物在25％乙腈溶液中4℃；凍干引物于-20℃可保管1-2年，液體形狀于-20℃可保管6個(gè)月。不用時(shí)應(yīng)-20℃保管。dNTPs：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有親密關(guān)系，多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反響中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是留意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

Mg2+：forTaqpolymeraseactivityMg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在普通的PCR反響中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反響特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反響產(chǎn)物減少。Buffer：10-50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20℃)。TaqDNApolymerase〔TaqDNA聚合酶〕：濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低那么合成產(chǎn)物量減少。分別:1969年，美國(guó)黃石國(guó)家公園溫泉分子量:94KDa活性：在幾種水生棲熱菌中活性最高，200000U/mg離子需求：對(duì)Mg2+、單價(jià)離子性質(zhì)和濃度較敏感。最適濃度50mmol/L。忠實(shí)性:沒(méi)有校正單核苷酸錯(cuò)配功能--致命弱點(diǎn)。普通出錯(cuò)率為2×10-4核苷酸/每輪循環(huán)，利用PCR克隆、測(cè)序時(shí)尤應(yīng)留意。TaqDNA聚合酶酶活性(%)40506070809010010080604020五、PCR反響條件優(yōu)化〔PCRoptimization)1、變性溫度和時(shí)間普通情況下，92℃～95℃l-5min足以使模板DNA變性，假設(shè)低于93℃那么需延伸時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，由于高溫環(huán)境對(duì)酶的活性有影響。富含G和C的序列，可適當(dāng)提高，但過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性損失。2、退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間引物中G、C含量高、長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常37-55℃、1-2分鐘。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合時(shí)機(jī)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。?退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。引物的復(fù)性溫度可經(jīng)過(guò)以下公式協(xié)助選擇適宜的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

3、延伸溫度和時(shí)間?溫度：72℃，接近Taq酶的最適75℃，高于90℃時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)展?TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

?時(shí)間：過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性添加。但對(duì)低濃度的目的序列，那么可適當(dāng)添加時(shí)間。普通：1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的3～4kb的靶序列需3～4min10Kb需延伸至15min。?延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。4、循環(huán)次數(shù)PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。普通的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)過(guò)多，非特異性產(chǎn)物大量添加，循環(huán)次數(shù)決議PCR擴(kuò)增程度。六、PCR反響特點(diǎn)1.特異性強(qiáng)：①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對(duì)原那么；

③TaqDNA聚合酶合成反響的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。2.靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量以指數(shù)方式添加3.簡(jiǎn)便、快速：PCR反響普通在2～4小時(shí)完成擴(kuò)增反響。擴(kuò)增產(chǎn)物普通用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推行。4.對(duì)標(biāo)本的純度要求低：DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)。七、PCR產(chǎn)物的分析?1、凝膠電泳分析通常運(yùn)用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分別效果比瓊脂糖好，條帶比較集中。?2、PCR產(chǎn)物電泳EB溴乙錠染色紫外儀下察看，初步判別產(chǎn)物的特異性。目前可用SYBR的新型熒光染料來(lái)替代EB，從而減少了對(duì)環(huán)境的污染，并可有效維護(hù)實(shí)驗(yàn)操作者。?3、酶切分析根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分別后，獲得符合實(shí)際的片段，此法既能進(jìn)展產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)展變異性研討。?4、分子雜交分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法。在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)志后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶外形。?5、核酸序列分析是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。

八、Molecularmarker1、傳統(tǒng)程度：形狀標(biāo)志、細(xì)胞學(xué)標(biāo)志、生化標(biāo)志2、分子程度：?第一類：電泳、分子雜交為中心代表：RFLP?第二類：電泳、PCR為中心代表：RAPD、SSR、AFLP?第三類：DNA序列為中心代表：?jiǎn)螇A基多態(tài)性〔SNP〕，DNA序列的單個(gè)核苷酸的差別3、運(yùn)用種質(zhì)資源研討質(zhì)量純度鑒定〔包括DNA指紋鑒定〕構(gòu)建遺傳連鎖圖基因定位〔QTL〕標(biāo)志輔助選擇比較基因組研討基因克隆〔圖位克隆〕生物來(lái)源、進(jìn)化、醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué)〔一〕RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)

物種的基因組DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的片段，用放射性同位素標(biāo)志的DNA作探針，把與被標(biāo)志DNA相關(guān)的片段檢測(cè)出來(lái)，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜。自從人的RFLP圖譜構(gòu)建后，又分別構(gòu)建了果蠅、牛、大豆、小麥、水稻等多種生物的RFLP圖譜。優(yōu)點(diǎn):共顯性，非常穩(wěn)定缺陷：檢測(cè)步驟多，周期長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢；用作探針的DNA克隆制備、保管不方便；放射性同位素〔二〕RAPD〔RandomAmplifiedPolymorphismDNA)RAPD隨機(jī)多態(tài)性