核酸的生物合成

第九章核酸的生物合成中心法那么生物的遺傳信息從DNA傳送給mRNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。根據(jù)mRNA鏈上的遺傳信息合成蛋白質(zhì)的過程，被稱為翻譯和表達(dá)。1958年Crick將生物遺傳信息的這種傳送方式稱為中心法那么。Reversetranscription第一節(jié)DNA的生物合成一、DNA的半保管復(fù)制復(fù)制時期

1.半保管復(fù)制的證明2.DNA生物合成的根本問題模板引物dNTPDNA聚合酶Mg2＋在5’-3’方向延伸二、原核細(xì)胞DNA的復(fù)制合成1.原核DNA聚合酶2.復(fù)制的復(fù)雜性5’5’3’3’酶作用DNA聚合酶Ⅰ5‘－3’聚合酶及外切酶作用，3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修復(fù)DNA鏈，還可切除引物DNA聚合酶Ⅱ5‘－3’聚合酶及3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修復(fù)DNA鏈DNA聚合酶Ⅲ與酶Ⅰ作用類似，酶活高，是主要的鏈延伸酶（聚合酶replicase）岡崎片段與半不延續(xù)復(fù)制〔okazaki1968年〕復(fù)制方向：單起點(diǎn)、雙向或單向復(fù)制引物〔primer〕及引物酶(primase)引物的切除與銜接5’－3’外切酶切除引物〔DNA聚合酶Ⅰ〕DNA銜接酶〔大腸桿菌DNA銜接酶/T4銜接酶〕復(fù)制的起始辨識起點(diǎn)〔富含AT區(qū)〕解旋〔拓?fù)洚悩?gòu)酶〕解鏈單鏈結(jié)合蛋白〔SSB〕三、真核DNA的復(fù)制合成真核DNA的合成的根本過程類似于原核DNA，不同之處：多復(fù)制起點(diǎn)至少有五種聚合酶αβγδε端粒的復(fù)制依賴于端粒酶真核生物DNA聚合酶

αβγδε亞基數(shù)44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256細(xì)胞內(nèi)定位核核線粒體核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能復(fù)制、引發(fā)修復(fù)復(fù)制復(fù)制復(fù)制DNA復(fù)制過程真核生物DNA復(fù)制叉構(gòu)造表示圖四、反轉(zhuǎn)錄作用〔RNA指點(diǎn)下的DNA合成〕1970年，Temin和Baltimore在致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶〔ReverseTranscriptase〕1.DNA聚合酶特性需引物〔tRNA〕、dNTP、模板〔RNA、DNA〕、5’-3’方向聚合2.雜交分子H鍵斷開常由核糖核苷酶H〔RNAaseH〕專注切除RNA-DNA分子中的RNA,全部或部分去除RNA3.前病毒DNA合成的DNA鏈稱負(fù)鏈,然后由依賴DNA的DNA聚合酶催化下,以負(fù)鏈為模板合成一正鏈這樣構(gòu)成的DNA稱前病毒DNA,前病毒DNA可嵌入宿主細(xì)胞DNA中(稱整合)或埋伏于宿主細(xì)胞用其負(fù)鏈(依賴DNA的RNA聚合酶)出RNA,合成外殼蛋白.1五、DNA的損傷與修復(fù)1.DNA的損傷與突變損傷可呵斥突變或致死突變〔mutation〕：指一種遺傳形狀，可以經(jīng)過復(fù)制而遺傳的DNA構(gòu)造的任何永久性改動。攜帶突變基因的生物稱為突變體，未突變的稱為野生型。損傷緣由物理〔紫外〔見下頁〕、高能射線、電離輻射〕化學(xué)〔烷基化試劑、亞硝酸鹽、堿基類似物〕生物要素〔堿基對置換、堿基的插入/缺失呵斥移碼〕當(dāng)DNA遭到大劑量紫外線〔波長260nm附近〕照射時，可引起DNA鏈上相鄰的兩個嘧啶堿基共價聚合，構(gòu)成二聚體，例如TT二聚體。2.DNA損傷修復(fù)光復(fù)活切除修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)光復(fù)活〔photoreactivation〕可見光〔最有效波長400nm〕激活生物界廣泛分布〔高等哺乳動物除外〕的光復(fù)活酶，該酶分解嘧啶二聚體。是一種高度專注的修復(fù)方式，只分解由于UV照射而構(gòu)成的嘧啶二聚體。切除修復(fù)〔excisionrepair〕即在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷的部分切除掉，并以完好的那一段為模板，合成出切去的部分，從而使DNA恢復(fù)正常。這是一種比較普遍的修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞的修復(fù)功能對于維護(hù)遺傳物質(zhì)DNA不受破壞有重要意義。重組修復(fù)〔recombinationrepair〕又稱復(fù)制后修復(fù)〔postreplicationrepair〕受損傷的DNA在進(jìn)展復(fù)制時，跳過損傷部位，在子代DNA鏈與損傷相對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。經(jīng)過分子間重組，從完好的母鏈上將相應(yīng)的堿基順序片段移至子鏈的缺口處，然后再用合成的多核苷酸來補(bǔ)上母鏈的空缺，此過程即反復(fù)修復(fù)。并非完全校正。SOS修復(fù)指DNA遭到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急形狀時所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完好性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯誤較多，又稱傾錯性修復(fù)〔Error-ProneRepair〕。3.基因重組與DNA克隆〔基因工程〕限制性內(nèi)切酶能識別DNA特定核苷酸序列的核酸內(nèi)切酶分布：主要在微生物中。特點(diǎn)：特異性，即識別特定核苷酸序列，切割特定切點(diǎn)。結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端〔堿基互補(bǔ)配對〕。舉例：大腸桿菌的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點(diǎn)上將DNA分子切斷。目前已發(fā)現(xiàn)的限制酶有400～500多種。運(yùn)載體種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。質(zhì)粒的特點(diǎn):細(xì)胞染色體外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子；質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體；最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒；存在于許多細(xì)菌及酵母菌等生物中；質(zhì)粒的存在對宿主細(xì)胞無影響；質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。DNA重組與克?、購募?xì)胞中分別出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分別大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培育大腸桿菌克隆大量基因⑦重組體的挑選PCR(polymeraseChainreaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒错慞CR也稱體外酶促基因擴(kuò)增，原理類似天然DNA復(fù)制。靶DNA分子變性后解鏈，兩條單鏈DNA分別與兩條引物互補(bǔ)結(jié)合，在4種dNTP存在和適宜和條件下，由耐熱的TaqDNA聚合酶催化引物由5’－3’擴(kuò)增延伸，構(gòu)成兩條新的雙鏈DNA分子，并作為下一循環(huán)的模板。每經(jīng)過一個變性、復(fù)性、延伸循環(huán)，模板DNA添加一倍。經(jīng)過30～50個循環(huán)，可使原DNA量添加106～109倍。PCR的主要步驟：?模板DNA的變性普通選用95℃左右1min，使DNA雙鏈解為單鏈?復(fù)性按引物實(shí)踐情況確定適當(dāng)溫度，時間普通30s至1.5min?延伸普通72℃1min?循環(huán)數(shù)按初始模板濃度確定，普通25－45之間PCR的引物設(shè)計PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性主要由引物決議，引物的設(shè)計是PCR勝利的關(guān)鍵，?引物位置和產(chǎn)物長度根據(jù)不同目的和要求確定，長度普通在200～800bp之間?引物的長度普通為18～25bp?末端核苷酸3’端不得有任何修飾?G＋C含量和Tm值普通在40－60%之間，兩條相差2－3℃第二節(jié)RNA的生物合成DNA攜帶的遺傳信息〔基因〕傳送給RNA分子的過程稱轉(zhuǎn)錄〔transcription〕。在生物界，RNA合成有兩種方式：一是DNA指點(diǎn)的RNA合成，此為生物體內(nèi)的主要合成方式。另一種是RNA指點(diǎn)的RNA合成，此種方式常見于病毒。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的初級轉(zhuǎn)錄本是RNA前體〔RNAprecursor〕，需經(jīng)加工過程〔processing〕方具有生物學(xué)活性。反響體系：DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+，合成方向5'→3'。銜接方式--3',5'磷酸二酯鍵。轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)：不對稱轉(zhuǎn)錄--DNA片段轉(zhuǎn)錄時，雙鏈DNA中只需一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板，這種轉(zhuǎn)錄方式稱作不對稱轉(zhuǎn)錄。模板鏈(templatestrand)及反意義鏈(antisensestrand):指點(diǎn)RNA合成的DNA鏈為模板鏈，又稱反意義鏈。

編碼鏈(codingstrand)及有意義鏈(sensestrand)：不作為轉(zhuǎn)錄的另一條DNA鏈為編碼鏈，又稱有意義鏈。由于基因分布于不同的DNA單鏈中，即某條DNA單鏈對某個基因是模板鏈，而對另一個基因那么是編碼鏈。原料：四種磷酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成中變?yōu)閁合成過程:延續(xù)，方向：5‘→3’從頭合成,5′—末端的起始核苷酸常為GTP或ATP一、轉(zhuǎn)錄根本特點(diǎn)不對稱轉(zhuǎn)錄“轉(zhuǎn)錄單位〞〔transcriptionunit〕以支配子〔operon〕為轉(zhuǎn)錄的功能單位,構(gòu)造上包括四個功能區(qū)：多順反子〔構(gòu)造基因區(qū)〕、啟動子、操作子、終止子和調(diào)理基因。原核RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄過程二、原核細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄合成特點(diǎn)調(diào)理基因啟動子支配基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP復(fù)合物mRNA+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透過酶-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶酶forward大腸桿菌的RNA聚合酶全酶由5種亞基α2ββ’σ組成，σ因子與其它部分的結(jié)合不是非常嚴(yán)密，它易于與β’βα2分別，沒有σ、亞基的酶稱為中心酶——只催化鏈的延伸，對起始無作用。五種亞基的功能分別為：α亞基：與啟動子結(jié)合功能。β亞基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯鍵。亞基：在全酶中存在，功能不清楚。β’亞基：與DNA模板結(jié)合功能。σ亞基：識別起始位點(diǎn)。

識別解鏈起始延伸終止1.起始位點(diǎn)的識別σ識別正確的啟動位點(diǎn)，啟動子的構(gòu)造至少由三部分組成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶識別的信號；-10序列是酶的嚴(yán)密結(jié)合位點(diǎn)〔富含AT堿基，利于雙鏈翻開〕；第三部分是RNA合成的起始點(diǎn)。3’5’+1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)AACTGTATATTATTGACATATAAT5’3’－35序列Sextama框－10序列Pribnow框2.轉(zhuǎn)錄起始參與的第一個核苷三磷酸常是GTP或ATP。所構(gòu)成的啟動子、全酶和核苷三磷酸復(fù)合物稱為三元起始復(fù)合物，第一個核苷三磷酸一旦摻入到轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，σ亞基就會被釋放脫離中心酶。-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板鏈E

3.鏈的延伸以NTP為原料和能量,DNA模板鏈為模板，靠中心酶的催化，核苷酸間經(jīng)過3′,5′-磷酸二酯鍵成核糖核酸鏈(RNA)4.轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止信號有兩種情況弱終止子：依賴ρ因子〔終止因子，terminators〕的終止NusA蛋白識別DNA鏈上的終止信號，在ρ因子協(xié)助終止。強(qiáng)終止子：〔1〕在終止點(diǎn)之前具有一段富含G-C的回文區(qū)域?！?〕富含G-C的區(qū)域之后是一連串的dA堿基序列，它們轉(zhuǎn)錄的RNA鏈的末端為一連串U〔延續(xù)6個〕。三、真核生物的轉(zhuǎn)錄作用酶類分布產(chǎn)物活性分子量(KDa)反應(yīng)條件ⅠⅡⅢ核仁核質(zhì)核質(zhì)rRNA（5.8S、18S、28S）mRNAtRNA、5SrRNA50～70％20～40％10％500～700～700低離子強(qiáng)度要求Mg2+或Mn2+高離子強(qiáng)度高M(jìn)n2+濃度1.真核RNA聚合酶2.轉(zhuǎn)錄真核RNA轉(zhuǎn)錄根本過程與原核類似，但其產(chǎn)生的mRNA為“單順反子〞，只編碼一條肽鏈。四、轉(zhuǎn)錄過程的選擇性抑制劑放線菌素D利福平α－鵝膏蕈堿原核抑制抑制不抑制真核抑制不抑制抑制RNA聚合酶Ⅱ五、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的“加工〞〔成熟過程〕在細(xì)胞內(nèi)，由RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄物〔primarytranscript〕往往需求一系列的變化，包括鏈的裂解、5和3末端的切除和特殊構(gòu)造的構(gòu)成、核苷的修飾、以及拼接和編輯等過程，才轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腞NA分子。此過程總稱為RNA的成熟或稱為RNA的轉(zhuǎn)錄后加工。原核生物的mRNA轉(zhuǎn)錄后普通不需求加工，轉(zhuǎn)錄的同時即進(jìn)展翻譯〔半壽期短〕。rRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工tRNA前體的加工真核mRNA前體的加工rRNA前體的加工

rRNA基因之間以縱向串聯(lián)的方式反復(fù)陳列。

加工過程：

1、剪切作用：需核酸酶參與。

2、甲基化修飾：修飾在堿基上。

3、自我剪接：一種核酶的作用。

原核rRNA加工：rRNA含非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)，其產(chǎn)物中含tRNA真核rRNA加工：1.5S自成體系加工少無修飾和剪接。

2.45S加工中含剪切和甲基化修飾，需核酸酶。大腸桿菌rRNA前體加工真核生物rRNA前體加工tRNA前體的加工tRNA前體在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子

3’末端加上CCA堿基的修飾：甲基化、脫氨和復(fù)原作用真核mRNA前體的加工剪接〔Splicing〕去除內(nèi)含子，銜接外顯子5’帽端構(gòu)造的生成〔如圖〕3’端多聚A〔polyA〕的附加六、RNA的復(fù)制合成〔RNA指點(diǎn)的RNA合成〕噬菌體Qβ的RNA復(fù)制兩階段〔1〕其單鏈RNA可充任mRNA，利用寄主中的核糖體合成外殼蛋白和RNA復(fù)制酶的β亞基?！?〕復(fù)制酶的β亞基可與來自寄主細(xì)胞的亞基αδ自動裝配成RNA復(fù)制酶，可進(jìn)展RNA的復(fù)制，以分子中單鏈RNA為模板〔正鏈〕，復(fù)制出一條新的RNA鏈〔負(fù)鏈〕，再復(fù)制出正鏈，與外殼蛋白組裝成新的噬菌體顆粒。某些RNA病毒可以以本身RNA為模板進(jìn)展復(fù)制。不同的RNA病毒復(fù)制方式不同5RNA-533RNA+釋放釋放353355RNA+RNA+RNA-RNA-及RNA+的合成方向均為5‘3’核酶1982年Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA前體自我剪接作用，RNA有催化作用;1983年發(fā)現(xiàn)RNaseP中的RNA可催化tRNA前體的加工。

核酶我切割區(qū)內(nèi)有錘頭構(gòu)造〔hammer-headstructure〕，其中的構(gòu)造特點(diǎn)是：

〔1〕三個莖區(qū)構(gòu)成部分的雙鏈構(gòu)造；其中含13個保守的核苷酸，N代表任何核苷酸。

〔2〕圖中的箭頭表示自我切割位點(diǎn)，位于GUX的X外側(cè)，X可表示為C、U或A，不能是G。核酶的生物學(xué)意義1.RNA為生物催化劑，具有重要生物學(xué)意義。

2.突破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。

3.在生命來源問題上，為先有核酸提供了根據(jù)。

4.為治療破壞有害基因，腫瘤等疾病提供手段。七、基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式基因表達(dá)調(diào)控概述原核生物以支配子為單元進(jìn)展表達(dá)和調(diào)控，特異的阻遏蛋白是控制原核啟動序列活性的重要要素。乳糖支配子的調(diào)理機(jī)制色氨酸支配子的調(diào)理機(jī)制I－調(diào)理基因P－啟動子O－操作子〔操作基因〕Z、Y、A－三種構(gòu)造基因阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)理當(dāng)無誘導(dǎo)物乳糖存在時，調(diào)理基因編碼的阻遏蛋白〔repressorprotein〕處于活性形狀，阻止RNA聚合酶與啟動基因的結(jié)合，那么無法啟動轉(zhuǎn)錄。當(dāng)有乳糖存在時，lac支配子〔元〕即可被誘導(dǎo)。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)β－半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、轉(zhuǎn)錄發(fā)生。異丙基硫代半乳糖苷〔IPTG〕是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而非常穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛運(yùn)用。CAP〔代謝產(chǎn)物活化蛋白〕的正性調(diào)理當(dāng)沒有葡萄糖及cAMP濃度較高時，cAMP與CAP結(jié)合，這時CAP結(jié)合在lac啟動序列附近的CAP位點(diǎn)，可刺激RNA轉(zhuǎn)錄活性。葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物能抑制腺苷酸環(huán)化酶活性并活化磷酸二酯酶，從而降低了cAMP的濃度，CAP不能被活化構(gòu)成CAP－cAMP復(fù)合物，那么不能轉(zhuǎn)錄。lac阻遏蛋白負(fù)性調(diào)理與CAP正性調(diào)理兩種機(jī)制協(xié)調(diào)協(xié)作：當(dāng)Lac阻遏蛋白封鎖轉(zhuǎn)錄時，CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揚(yáng)作用；但是假設(shè)沒有CAP存在來加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，即使阻遏蛋白從支配序列上解聚仍幾無轉(zhuǎn)錄活性。lac支配子強(qiáng)的誘導(dǎo)作用既需求乳糖存在又需缺乏葡萄糖。調(diào)理基因支配基因構(gòu)造基因mRNA酶蛋白調(diào)理基因支配基因構(gòu)造基因輔阻遏物trp阻遏蛋白原調(diào)理基因編碼的阻遏蛋白原不與操作基因結(jié)合，構(gòu)造基因轉(zhuǎn)錄。Trp或Trp－RNA與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與支配基因結(jié)合，構(gòu)造基因不能表達(dá)。阻遏物調(diào)理機(jī)制衰減子調(diào)理機(jī)制衰減子：在轉(zhuǎn)錄程度上調(diào)理基因表達(dá)的衰減作用，用于終止和減弱轉(zhuǎn)錄，這種調(diào)理的作用部位叫衰減子——是一種位于構(gòu)造基因上游前導(dǎo)區(qū)的終止子。真核基因的調(diào)控⑤翻譯調(diào)理〔translationalcontrol〕真核染色質(zhì)體〔DNA〕①轉(zhuǎn)錄前調(diào)理轉(zhuǎn)錄初級產(chǎn)物RNA〔Pro－RNA〕hnRNA③轉(zhuǎn)錄后加工的調(diào)理〔RNAProcessingcontrol〕④轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)理〔RNAtransportcontrol〕mRNA⑥mRNA降解的調(diào)控mRNA降解物多肽鏈⑦翻譯后加工及蛋白質(zhì)活性控制〔proteinactivitycontrol〕活性蛋白失活蛋白②轉(zhuǎn)錄調(diào)理〔transcriptioncontrol〕順式作用元件(cisactingelements)真核基因的順式調(diào)控元件是基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而影響轉(zhuǎn)錄的DNA序列。其中主要是起正性調(diào)控作用的順式作用元件，包括啟動子(promoter)、加強(qiáng)子(enhancer)；近年又發(fā)現(xiàn)起負(fù)性調(diào)控作用的元件沉寂子(silencer)。1.啟動子〔Promoter〕是指RNA聚合酶結(jié)合并起動轉(zhuǎn)錄的DNA序列。真核啟動子普通包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其上游約100－200bp序列，包含有假設(shè)干具有獨(dú)立功能的DNA序列元件，每個元件約長7－30bp。啟動子中的元件可以分為兩種：①中心啟動子元件(corepromoterelement)指RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其上游－25/－30bp處的TATA盒。中心元件單獨(dú)起作用時只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和產(chǎn)生根底程度的轉(zhuǎn)錄。②上游啟動子元件(upstreampromoterelement)包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)更遠(yuǎn)的上游元件2.加強(qiáng)子〔Ehancer〕一種可以提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，通常占100－200bp長度