免疫學(xué)技術(shù)第九講

免疫學(xué)技術(shù)第九講免疫學(xué)技術(shù)：利用抗原、抗體特異性反應(yīng)的原理建立的各種檢測與分析技術(shù)，以及建立在這些技術(shù)之上的各種制備方法。一般將涉及到抗原、抗體、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等相關(guān)技術(shù)都稱為免疫技術(shù)。分類1、免疫血清學(xué)技術(shù)2、細(xì)胞免疫技術(shù)3、免疫制備技術(shù)4、分子免疫學(xué)技術(shù)免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用1、疾病診斷。2、生物活性物質(zhì)的超微定量。3、物種鑒定（血清型、亞型分析等）。4、微生物檢測。5、開發(fā)研制免疫增強(qiáng)藥物、飼料添加劑、疫苗等。6、分子生物學(xué)領(lǐng)域。主要內(nèi)容一免疫血清學(xué)技術(shù)二主要血清學(xué)技術(shù)三細(xì)胞免疫技術(shù)四主要細(xì)胞免疫技術(shù)專題一：免疫血清學(xué)技術(shù)一、免疫血清學(xué)技術(shù)1、血清學(xué)技術(shù)：簡單地說指體外的抗原與抗體反應(yīng)，由于抗體多來自于血清故稱血清學(xué)。2、分類：（1）凝聚性反應(yīng)：凝集反應(yīng)；沉淀反應(yīng)（2）標(biāo)記抗體技術(shù)：熒光抗體，本酶標(biāo)抗體，放射性標(biāo)記抗體（3）補(bǔ)體參與的反應(yīng)：補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)；（4）中和反應(yīng)：病毒中和試驗(yàn)（5）免疫轉(zhuǎn)?。篧estenBlotting一、免疫血清學(xué)技術(shù)3、特點(diǎn)：（1）特異性和交叉性如豬瘟病毒抗體只能與豬瘟病毒結(jié)合，說明具有特異性；牛痘病毒來預(yù)防人的天花和豬瘟疫苗預(yù)防牛的病毒性腹瀉病的例子說明具有交叉性。一、免疫血清學(xué)技術(shù)3、特點(diǎn)：（2）最適比和帶現(xiàn)象帶現(xiàn)象指因抗原或抗體過多而出現(xiàn)的抑制可見反應(yīng)的現(xiàn)象，抗體過多易出現(xiàn)前帶反應(yīng)；抗原過多易出現(xiàn)后帶現(xiàn)象。一、免疫血清學(xué)技術(shù)3、特點(diǎn)：（3）反應(yīng)的兩階段性第一階段為抗原與抗體的特異性結(jié)合，反應(yīng)快，幾秒鐘至幾分鐘；第二階段為抗原與抗體的可見現(xiàn)象階段。一、免疫血清學(xué)技術(shù)3、特點(diǎn)：（4）反應(yīng)的可逆性抗原與抗以弱的非共價(jià)鍵結(jié)合，受物理化學(xué)熱力學(xué)法則制約。在0-40度內(nèi)，PH4-9范圍易結(jié)合；如果溫度超過60度或PH降至3度以下，抗原抗體復(fù)合物又可重新解離。一、免疫血清學(xué)技術(shù)3、特點(diǎn)：（5）反應(yīng)的敏感性可用于定性，還可以檢測極微量的抗原或抗體，其靈敏度大超過了常規(guī)的化學(xué)方法。一、免疫血清學(xué)技術(shù)4、影響血清學(xué)反應(yīng)的因素電解質(zhì)：一般用NaCl作稀釋液；標(biāo)記抗體常用PBS磷酸鹽緩沖溶液。溫度：一般較高溫度可增加抗原與抗接觸的機(jī)會，超過60度易解離。酸堿度：PH6-8較合適。二、主要血清學(xué)技術(shù)（一）凝集反應(yīng)1、概念：顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞）與相應(yīng)抗體，在電解質(zhì)存在下，發(fā)生凝集的反應(yīng)。2、分類：直接凝集反應(yīng)、間接凝集反應(yīng)、反向間接凝集反應(yīng)、協(xié)同凝集反應(yīng)等。3、用途：如血型鑒定、牛布病檢測、雞白痢診斷等。二、主要血清學(xué)技術(shù)（二）沉淀反應(yīng)1、概念：可溶性抗原（細(xì)菌外毒素、內(nèi)毒素，菌體、裂解液、血清、組織浸出液）與相應(yīng)抗體，在電解質(zhì)存在下，發(fā)生凝集的反應(yīng)。2、分類：單向瓊脂擴(kuò)散、雙向瓊脂擴(kuò)散、對流免疫電泳、火箭電泳等。3、用途：如炭疽、小鵝瘟診斷等。AscoliAgAb對流免疫電泳二、主要血清學(xué)技術(shù)（三）免疫標(biāo)記技術(shù)1、概述：抗原與抗體能特異性結(jié)合，但抗體抗原分子小，含量低時(shí)，形成的復(fù)合物是不可見的。如果將超微量的物質(zhì)標(biāo)記（熒光素、酶、放射性同位素）就可檢測出微量的抗原與抗體復(fù)合物，其特異性與敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過常規(guī)血清學(xué)方法，被廣泛用于病原微生物鑒定，傳染病診斷及基因表達(dá)產(chǎn)物分析等。二、主要血清學(xué)技術(shù)（三）免疫標(biāo)記技術(shù)2、分類：（1）免疫熒光技術(shù)（2）免疫酶技術(shù)（3）放射免疫測定法（4）免疫印跡法（5）免疫金標(biāo)技術(shù)（6）免疫PCR小鼠脾臟免疫熒光圖像免疫酶技術(shù)3、免疫酶技術(shù)（1）原理：通過化學(xué)方法將酶與抗體或抗抗體結(jié)合，形成酶標(biāo)記物，這些酶標(biāo)記物仍保持免疫學(xué)活性和酶的活性，然后將它與相應(yīng)的抗體或抗原起反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物，結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶在遇到相應(yīng)的底物時(shí)，而顯色。3、免疫酶技術(shù)（2）分類：免疫酶組化法免疫酶測定法酶標(biāo)記抗體法抗酶抗體法液相測定法固相測定法間接法雙抗體夾心法競爭法免疫酶技術(shù)3、免疫酶技術(shù)（3）特點(diǎn)：靈敏度高，檢測能力可達(dá)毫微克水平。應(yīng)用范圍廣，既能測抗體又能檢測抗原，既能定性又能定量、定位及抗原分析。標(biāo)本可長期保存。酶標(biāo)記物有效時(shí)間較長，一般低溫保存可達(dá)一年以上。不需要特殊設(shè)備。（4）操作過程：二、主要血清學(xué)技術(shù)（四）補(bǔ)體結(jié)合技術(shù)專題二：細(xì)胞免疫技術(shù)1、概述：細(xì)胞免疫檢測主要包括T細(xì)胞及亞群的計(jì)數(shù)、T細(xì)胞活性測定、各種淋巴因子的檢測、K細(xì)胞、NK細(xì)胞活性試驗(yàn)，以及皮膚過敏試驗(yàn)等。2、用途：（1）測定疾病個(gè)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)及水平；（2）篩選免疫增強(qiáng)劑或免疫抑制藥物；（3）測定淋巴因子活性等細(xì)胞免疫技術(shù)3、分類：E花環(huán)試驗(yàn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)白細(xì)胞移動抑制試驗(yàn)白細(xì)胞介素測定酸性α醋酸萘酯酶測定主要細(xì)胞免疫技術(shù)（一）E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)1、原理：人、豬、牛、羊等的T細(xì)胞膜上的CD2是綿羊紅細(xì)胞受體，馬、豬的T細(xì)胞膜上的CD2是豚鼠紅細(xì)胞的受體。2、用途：區(qū)分T淋巴細(xì)胞主要細(xì)胞免疫技術(shù)（二）淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)1、原理：PHA+T細(xì)胞（有PHA受體）轉(zhuǎn)化大的淋巴母細(xì)胞

顯微鏡觀察計(jì)算轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率=(過渡型細(xì)胞+母細(xì)胞)/200個(gè)淋巴細(xì)胞×100%2、用途：淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，監(jiān)測免疫機(jī)能3、特點(diǎn)：簡便、準(zhǔn)確性差形態(tài)學(xué)法3H胸腺嘧啶核苷（3H-T）摻入法原理：試驗(yàn)管對照管

PHA+T細(xì)胞+3H-TdRPHA+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞淋巴母細(xì)胞（摻入3H-TdR）（無3H-TdR摻入）

液體閃爍儀測摻入測CPM

3H-T的脈沖數(shù)CPM

計(jì)算轉(zhuǎn)化刺激指數(shù)SI=試驗(yàn)管CPM/對照管CPM特點(diǎn)：準(zhǔn)確，需昂貴的閃爍儀原理：PHA、ConA+T細(xì)胞（受體）

轉(zhuǎn)化分裂、增殖

脫氫酶

甲氮唑鹽（MTT）

甲簪（formazan）

酶標(biāo)儀（595nm）測OD值特點(diǎn)：敏感、準(zhǔn)確MTT比色法主要細(xì)胞免疫技術(shù)（三）酸性α醋酸萘酯酶測定1、原理：T淋巴細(xì)胞漿內(nèi)含有的酸性α醋酸萘酯酶，在弱酸性條件下，能使底物酸性α醋酸萘酯水解成醋酸和α萘酚，后者與六偶氮副品紅偶