環(huán)境微生物實驗?zāi)祥_大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院TheCol

環(huán)境微生物實驗環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院實驗一培育基的制備

培育基是用人工的方法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長代謝的需求配制成的一種營養(yǎng)基質(zhì)。培育基中均應(yīng)含有滿足微生物生長發(fā)育且比例適宜的水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長要素以及某些特需的微量元素外還應(yīng)具有適宜的酸堿度〔pH值〕、緩沖才干、氧化復(fù)原電位和浸透壓。一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握配制培育基的普通方法和步驟二、實驗器材(1)藥品和試劑：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10％NaOH溶液、l0％鹽酸溶液?？扇苄缘矸?、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KNO3、NaCl、FeSO4·7H2O、瓊脂、10％NaOH溶液、10％鹽酸。(2)器材：小燒杯、小鋁鍋、天平、牛角匙、1000mL刻度燒杯、玻棒、pH試紙、試管、分裝漏斗、棉花。三、方法與步驟1、牛肉膏蛋白胨培育基的配制(1)培育基配方：牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、瓊脂20.0g、自來水1000mL、pH7.0。(2)操作步驟：1〕稱藥品按實踐用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或外表皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放人熱水中，牛肉膏便與稱量紙分別，立刻取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。2〕加熱溶解在燒杯中參與少于所需求的水量，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。假設(shè)配制固體培育基，那么將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中．需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失的水分。3〕調(diào)pH檢測培育基的pH，假設(shè)pH偏酸，可滴加1滴1mol?L-1NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至到達(dá)所需pH范圍。假設(shè)偏堿，那么用1mol?L-1HCl進(jìn)展調(diào)理。pH的調(diào)理通常放在加瓊脂之前。應(yīng)留意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培育基內(nèi)各離子的濃度。4〕過濾液體培育基可用濾紙過濾，固體培育基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的察看。但是供普通運用的培育基，該步可省略。5〕分裝披實驗要求，可將配制的培育基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用漏斗以免使培育基沾在管口或瓶口上面呵斥污染(見圖4－1)。分裝量：固體培育基約為試管高度的1／5，滅菌后制成斜面〔圖4－2〕。分裝入三角瓶內(nèi)以不超越其容積的一半為宜。半固體培育基以試管高度的1/3為宜．滅菌后垂直待凝。6〕加棉塞試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制造的棉塞，棉塞制造方法如圖4—3。棉塞的外形、大小和松緊度要適宜，周圍緊貼管壁，不留縫隙，才干起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長約3／5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞零落。有些微生物需求更好的通氣，那么可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料塞替代棉塞。7〕包扎加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。8〕培育基的滅菌時間和溫度，需按照各種培育基的規(guī)定進(jìn)展，以保證滅菌效果和不損培育基的必要成份。培育基經(jīng)滅菌后，必需放37℃溫室培育24h，無菌生長者方可運用。圖例圖4－1培育基分裝圖4－2斜面制造圖4－3棉塞制造方法2、高氏一號培育基的制備(1)培育基配方：可溶性淀粉20g、KNO31.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL、pH7.2~7.4。

(2)操作步驟：1〕稱量和溶解先計算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再參與其他成分依次溶解。對微量成分FeSO4·7H2O可先配成高濃度的貯備液后再參與，方法是先在100mL水中參與1g的FeSO4·7H2O，配成濃度為0.01g?L-1的貯備液，再在1000mL培育基中參與以上貯備液1mL即可。待一切藥品完全溶解后．補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培育基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培育基配制。2〕pH調(diào)理、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培育基配制。3．常用的真菌培育基配方〔1〕馬鈴薯培育基：用以分別培育霉菌、酵母菌馬鈴薯(去皮)200g葡萄糖(或蔗糖)20g瓊脂20g水1000mLpH自然121℃滅菌30min上述培育基中參與1％的酵母粉或蛋白胨，那么能促進(jìn)孢子的大量添加?！?〕蔗糖硝酸鈉培育基〔察氏培育基〕：適宜于鑒定多數(shù)霉菌蔗糖30gK2HPO41gKCl1gNaNO42gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g水1000mLpH6.7如用以分別霉菌時．可加乳酸調(diào)理成pH5.0～5.5，制成酸性培育基?！?〕馬丁(Martin)孟加拉紅一鏈霉素培育基：葡萄糖10g蛋白胨7gK2HPO41.0gMgSO4·7H2O0.5g孟加拉水溶液(1／3000)100mL水800mL121℃滅菌30分鐘運用時加鏈霉素：<1>取國產(chǎn)1g裝鏈霉素一瓶．用無菌注射器注入無菌蒸餾水5mL。溶解后，汲取出0.5mL鏈霉素溶液，移注入330mL無菌蒸餾水即得0.03％鏈霉素。<2>上述根底培育基在沸水鍋中融化后冷卻至55~60℃，每10mL根底培育基加1mL0.03％鏈霉素溶液(含鏈霉素30μL?mL-1)〔4〕麥芽汁培育基：麥芽汁20g蛋白胨1g葡萄糖20g水1000mL瓊脂20gpH5〔5〕豆芽汁培育基，適用于酵母和霉菌。黃豆芽〔或綠豆芽〕100g白糖〔或蔗糖〕10～30g瓊脂20g水1000mL先將洗凈的豆芽放在水中煮沸30min，用2層紗布濾去豆芽，將豆芽汁補(bǔ)足水分，加糖〔培育酵母時糖量要高〕pH自然。四、本卷須知稱藥品用的牛角匙不要混用；稱完藥品應(yīng)及時蓋緊瓶蓋。調(diào)pH時要小心操作，防止回調(diào)，不同培育基各有配制特點，要留意詳細(xì)操作。五、實驗報告記錄本實驗配制培育第的稱號、數(shù)量，并圖講解明其配制過程，指明要點。六、問題和思索1．配制培育基有哪幾個步驟?在操作過程中應(yīng)留意些什么問題?為什么?2．培育基配制完成后，為什么必需立刻滅菌?假設(shè)不能及時滅菌應(yīng)如何處置？已滅菌的培養(yǎng)基進(jìn)展無菌檢查？3．牛肉膏蛋白胨培育基屬何種培育基？它除了培育細(xì)菌外，能培育真菌和放線菌嗎？高氏培育基屬何種培育基?除培育放線菌外高氏培育基還能培育細(xì)菌和真菌嗎?為什么?采用劇烈的理化要素使任何物體內(nèi)外一切的微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁衍才干的措施稱之為滅菌。滅菌是要進(jìn)展微生物純培育的需求。實驗室最常用的滅菌方法是利用高溫處置到達(dá)殺菌效果。高溫主要是使微生物的蛋白質(zhì)和核酸等重要生物大分子發(fā)生變性。高溫滅菌分為干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。濕熱滅菌的效果比優(yōu)于干熱滅菌。濕熱下熱量易于傳送，更容易破壞堅持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等構(gòu)造，加速其變性。此外，過濾除菌、射線滅菌和消毒、化學(xué)藥物滅菌和消毒等也是微生物學(xué)操作中不可短少的常用方法。實驗二消毒和滅菌

一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：了解消毒和滅菌的原理并掌握各種滅菌方法的操作步驟。內(nèi)容：1．高壓蒸汽滅菌法。2．干熱滅菌法。3．過濾除菌法。二、實驗資料和器具待滅菌的培育基和鏈霉素溶液。高壓蒸汽滅菌鍋、電熱烘箱、過濾除菌器、培育皿、試管三、操作步驟(—)高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法適用于培育基、無菌水、任務(wù)服等物品的滅菌。1．加水將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)參與適量的水，以水面與三角架相平為至。2．裝料將裝料桶放回鍋內(nèi)，裝入待滅菌的物品。裝有培育基的容器放置時要防止液體溢出，瓶塞不要緊貼桶壁，以防冷凝水沾濕棉塞。3．加蓋將蓋上與排氣孔相銜接的排氣軟管插人內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，對齊螺口，然后以同時旋緊相對的兩個螺栓的方式擰緊一切螺栓，并翻開排氣閥；4．排氣加熱．待水煮沸后，水蒸汽和空氣一同從排氣孔排出。普通以為，當(dāng)水沸后約5min，闡明鍋內(nèi)空氣已排凈。5．升壓當(dāng)鍋內(nèi)空氣排凈時，即可封鎖排氣閥，壓力開場上升。6．保壓當(dāng)壓力表指針到達(dá)所需壓力刻度時，控制熱源。開場計時并維持壓力至所需時間。本實驗用121℃，20min滅菌。7．降壓到達(dá)所需滅菌時間后，封鎖熱源，讓壓力自然下降到零后，翻開排氣閥。放凈余下的蒸汽后，再翻開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。8．無菌檢查將已滅菌培育基于37℃培育24h，無雜菌生長，即可待用。(二)干熱滅菌法干熱滅菌法適用于玻璃器皿，如試管、培育皿、三角瓶、移液管等的滅菌；1．裝入待滅菌物品預(yù)先將各種器皿用紙包好或裝入金屬制的培育皿筒、移液管筒內(nèi)，然后放人電熱烘箱中。2．升溫關(guān)好電烘箱門，翻開電源開關(guān)，旋動恒溫調(diào)理器至所需溫度刻度(本實驗所需為160～170℃)，此時烘箱紅燈亮，闡明烘箱已開場加熱，當(dāng)溫度上升至所設(shè)定溫度后那么烘箱綠燈亮，表示已停頓加溫。3．恒溫當(dāng)溫度升到所需溫度后，維持此溫度2h。4．降溫切斷電源，自然降溫。5.取出滅菌物品待電烘箱內(nèi)溫度降到70℃以下后，才干翻開箱門，取出滅菌物品。(三)過濾除菌法有些物質(zhì)，如抗生素、血清、維生素等易受熱分解，因此要采用過濾除菌法。1．過濾器的種類(1)濾膜過濾器：由醋酸纖維素、硝酸纖維素等制成，有孔徑大小不同的多種規(guī)格(如0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm等)，過濾細(xì)菌常用0.45μm孔徑。其優(yōu)點是吸附性小，即溶液中的物質(zhì)損耗少，濾速快，每張濾膜只運用1次，不用清洗。(2)蔡氏濾器：是一種金屬制成的過濾漏斗，其過濾部分是一種用石棉纖維和其他填充物壓制成的片狀構(gòu)造。溶液中的細(xì)菌經(jīng)過石棉纖維的吸附和過濾而被去除，但對溶液中其他物質(zhì)的吸附性也大。每張纖維板只能運用1次。(3)玻璃濾器：是一種由玻璃制成的過濾漏斗，其過濾部分是由細(xì)玻璃粉燒結(jié)成的板狀構(gòu)造。玻璃濾器規(guī)格很多，5號(孔徑2—5μm)和6號(孔徑小于2μm)適用于過濾細(xì)菌。其優(yōu)點是吸附量少，但每次運用后要洗凈再用。清洗方法是：用水充分沖洗，然后浸于含1％KNO3的濃硫酸中24h，再用蒸餾水抽洗數(shù)次。在抽洗液中加人數(shù)滴BaCl2，至不出現(xiàn)BaSO4沉淀時，即表示已洗凈。2．過濾安裝〔1〕按圖4-4進(jìn)展安裝，為阻止空氣中細(xì)菌進(jìn)人濾瓶而在接納處塞入棉花、外用紙包好進(jìn)展121℃濕熱滅菌20min。(2)為加快過濾速度，普通用負(fù)壓抽氣過濾，可接真空泵進(jìn)展抽濾。四、本卷須知1．運用滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)厲按照操作程序進(jìn)展，防止發(fā)惹事故；滅菌時，操作者切勿擅自分開，務(wù)必待壓力下降到零后，才可翻開鍋蓋。2．干熱滅菌時電烘箱中物品不要擺得太擁堵，以免妨礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與電烘箱內(nèi)壁的鐵板接觸．以免包裝紙烤焦起火。3．過濾除菌時應(yīng)留意檢查過濾安裝各銜接處能否漏氣，以防污染。五、實驗報告1．記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件(溫度、壓力等)。2．試述高壓蒸汽滅菌的操作過程及本卷須知。六、問題和思索1．比較各種滅菌方法的原理及適用范圍。2．高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅菌后不能驟然快速降壓，并要再放盡鍋內(nèi)蒸汽才干翻開鍋蓋?微生物接種技術(shù)是進(jìn)展微生物實驗和相關(guān)研討的根本操作技藝。無菌操作是微生物接種技術(shù)的關(guān)鍵。斜面接種、液體接種、固體接種和穿刺接種操作均以獲得生長良好的純種微生物為目的。由于接種方法不同，采用的接種工具也有區(qū)別，如固體斜面培育體轉(zhuǎn)接時用接種環(huán)；穿刺接種時用接種針，液體轉(zhuǎn)接用移液管等。實驗三微生物的接種技術(shù)一、實驗?zāi)康模毫私飧鞣N微生物接種方法。二、實驗資料和器具：已滅菌培育基、接種環(huán)、接種針、酒精燈、移液管、記號筆三、實驗步驟：1、斜面接種技術(shù)斜面接種是從已生長好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一新穎斜面培育基上的一種接種方法。詳細(xì)操作如下：(1)貼標(biāo)簽接種前在試管上貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等。貼在距試管口約2～3cm的位置。(假設(shè)用記號筆標(biāo)志那么不需標(biāo)簽)。。(2)點燃酒精燈。(3)接種用接種環(huán)將少許菌種移接到貼好標(biāo)簽的試管斜面上。操作必需按無菌操作法進(jìn)展。簡述如下：1)手持試管將菌種和待接斜面的兩支試管用大姆指和其他四指握在左手中．使中指位于兩試管之間部位。斜面面向操作者，并使它們位于程度位置。2)旋松管塞先用有于松動棉塞或塑料管蓋，以便接種時拔出。3)取接種環(huán)右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)端灼燒滅菌．然后將有能夠伸入試管中的其他部分均灼燒滅菌，反復(fù)此操作．再灼燒一次。4)拔管塞用右手的無名指、小指和手掌邊先后取下菌種管和待接試管的管塞，然后讓試管口漸漸過火滅菌(切勿燒得過燙)。見圖4—6(a)所示。圖4－6試管拔塞后過火滅菌和取菌8)塞管塞取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將管塞旋上。不要用試管去迎棉塞，以免試管在挪動時納入不潔空氣。9)將接種環(huán)灼燒滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。2、液體接種技術(shù)(1)用斜面菌種接種液體培育基時，有下面兩種情況：如接種量小，可用接種環(huán)取少量菌體移入培育基容器(試管或三角瓶等)中，將接種環(huán)在液體外表振蕩或在器壁上悄然摩擦把菌苔散開，抽出接種環(huán)，塞好棉塞，再將液體搖動，菌體即均勻分布在液體中。如接種量大，可先在斜面菌種管中注入定量無菌水．接種環(huán)把菌苔刮下研開，再把菌懸液倒入液體培育基中，倒前需將試管口在火焰上滅菌。(2)用液體培育物接種液體培育基時，可用無菌的吸管或移液管汲取菌液接種。3、固體接種技術(shù)固體接種最普遍的方式是接種固體菌制劑。因所用菌種或種子菌來源不同分為：1)用菌液接種固體料可用菌苔刮洗制成的懸液。接種時可按無菌操作法將菌液直接例入固體培育基中，攪拌均勻。留意接種所用菌液量要計算在固體料總加水量之內(nèi)，否那么往往在用液體種子菌接種后含水量加大，影響培育效果。2)用固體種子接種固體料包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培育的種子菌，直接把接種資料混入滅菌的固體料。接種后必需充分?jǐn)嚢瑁怪旌暇鶆颉?、穿刺接種技術(shù)穿刺接種技術(shù)是一種用接種針從菌種斜面上挑取少量菌體并把它穿刺到固體或半固體的深層培育基中的接種方法。經(jīng)穿刺接種后的菌種常作為保藏菌種的一種方式，同時也是檢查細(xì)菌運動才干的一種方法，它只適宜于細(xì)菌和酵母的接種培育。詳細(xì)操作如下．(1)貼標(biāo)簽。(2)點燃酒精燈。(3)穿刺接種，方法如下1)手持試管。2)旋松棉塞。3)右手拿接種針在火焰上將針端灼燒滅菌，接著把在穿刺中能夠伸入試管的其他部位也灼燒滅菌；4)用右手的小指和手掌邊拔出棉塞。接種針先在培育基部分冷卻．再用接種針的針尖沾取少量菌種。5)接種有兩種手持操作法。一種是程度法，它類似于斜面接種法。一種那么稱垂直法，如圖4—8所示。雖然穿刺時手持方法不同，但穿刺時所用接種針都必需挺直，將接種針自培育基中心垂直地刺入培育基中。穿刺時要做到手穩(wěn)、動作輕巧快速，并且要將接種針穿刺到接近試管的底部，然后沿著接種線將針拔出。最后，塞上棉塞，再將接種針上殘留的菌在火焰上燒掉。(4)將接種過的試管直立于試管架上，放在37℃或28℃恒溫箱中培育。24h后察看結(jié)果(留意：假設(shè)具有運動才干的細(xì)菌，它能沿著接種線向外運動而彌散，故構(gòu)成的穿刺線較粗而散、反之那么細(xì)而密)。圖4－7斜面劃線法〔a〕和不同細(xì)菌直線接種長出的菌苔形狀〔b〕圖4－8穿刺接種：〔a〕程度穿刺接種；〔b〕垂直穿刺接種四、實驗報告列表比較各種接種方法及本卷須知。五、問題和討論1、

斜面接種取菌前為什么要將灼燒過的接種針在無菌培育基上沾一下？穿刺接種時能否將接種針直接穿透培育基？微生物都是個體微小的生物，用肉眼不能看到它們的個體，所以察看它們的形狀必需在顯微鏡下進(jìn)展，另外微生物細(xì)胞具有較高的透明性，所以有些微生物〔尤其是細(xì)菌和放線菌〕需求經(jīng)過染色后才干察看清楚，細(xì)菌個體很小，其大小以微米計，所以需求在油鏡下察看。放線菌和霉菌的個體普通呈絲狀，并且明顯地分為基質(zhì)菌絲和氣生菌絲。成熟地個體還具有各種形狀的孢子。實驗四微生物形狀的察看一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：經(jīng)過實驗學(xué)習(xí)察看微生物形狀的根本方法，了解細(xì)菌、放線菌和霉菌的形狀特征。內(nèi)容：1.察看細(xì)菌的根本形狀和構(gòu)造染色裝片。2．察看放線菌形狀裝片。3．察看霉菌染色裝片，仔細(xì)察看基質(zhì)菌絲、氣生菌絲和孢子形狀。4．掌握細(xì)菌制片方法。二、實驗資料和器具葡萄球菌、大腸桿菌、棒桿菌、螺菌的斜面菌種，放線菌平板培育物，霉菌平板培育物。香柏油、二甲苯、無菌水。顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片。三、操作步驟1、察看細(xì)菌的根本形狀用低倍鏡、高倍鏡和油鏡察看球菌、桿菌、螺菌，并分別在油鏡下繪圖。2、察看細(xì)菌的細(xì)胞構(gòu)造用低倍鏡、高倍鏡和油鏡察看宏大芽孢桿菌(示細(xì)胞壁)、宏大芽孢桿菌(示異染粒)、蘇云金芽孢桿菌(示伴胞晶體)、普通變形菌(示鞭毛)、丙酮丁醇梭菌(示芽孢)、褐球固氮菌(示莢膜)等細(xì)菌，并繪圖。3、察看放線菌、霉菌染色裝片。用低倍鏡察看放線菌、霉菌菌絲形狀，包括基質(zhì)菌絲、氣生菌絲；放線菌孢子絲；根霉假根，孢子囊；曲霉、青霉分生孢子梗及分生孢子。4、察看枯草芽孢桿菌活菌常用壓滴法。如圖4-9所示。圖4－9壓滴法制片表示圖1〕將干凈無油膩的載片放于本人右邊前方，在中央放—小滴無菌水?！?〕將酒精燈放于本人正前方，點燃?！?〕用無菌操作方法從枯草芽孢桿菌斜面中沾取少量菌體，與載片上的水滴充分混勻，把接種環(huán)上殘留的菌體殺滅后，放回試管架?！?〕用鑷子夾一干凈的蓋玻片，使其一邊先接觸菌液．然后將整個蓋玻片漸漸放下，留意不要產(chǎn)生氣泡。如菌液過多，可用吸水紙適當(dāng)吸去一部分?！?〕先用低倍鏡然后轉(zhuǎn)用高倍鏡觀查，察看光陰線要適當(dāng)調(diào)暗些。四、本卷須知1、留意擦鏡頭時，只能用擦鏡紙。2、察看終了，必需將鏡筒上升，才干取下裝片．放入另一裝片后，要按運用油鏡要求，重新操作．不能在油鏡下直接取下和交換裝片，切記！3、無菌操作過程中，接種環(huán)滅菌后不能觸及其他物品，挑菌不能過多。五、實驗報告1、給出他所察看到的幾種細(xì)菌的個體形狀視野圖。2、繪出他所察看到的細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造視野圖，并注明各部分。六、問題和討論1、出在制備活菌裝片時，應(yīng)留意什么問題?2、用明視野顯微鏡察看細(xì)菌的形狀時，他以為用染色裝片好，還是用非染色的活體裝片好？為什么？察看活體裝片與染色裝片，光線調(diào)理各有什么不同?3、無菌操作過程中，可否將棉塞放在桌面上?為什么?4、試設(shè)計一個預(yù)備本實驗的任務(wù)方案。用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋電質(zhì)等電點較低，當(dāng)它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料(如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等)使其著色。酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培育基pH值下降時，細(xì)菌所帶正電荷添加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料．如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。實驗五細(xì)菌染色法及微生物的察看簡單染色法是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形狀的方法難于區(qū)分細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。革蘭氏染色法法可將一切的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌(G－)和革蘭氏陰性菌(G＋)兩大類，是細(xì)菌學(xué)上是常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為G－菌和G＋菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁構(gòu)造和成分的不同所決議的。G－菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，添加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)番紅復(fù)染后就成紅色。G＋菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處置后反而使肽聚糖層的孔徑減少，通透性降低，因此細(xì)菌仍保管初染時的顏色。細(xì)菌莢膜染色的原理是由于莢膜和染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負(fù)染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在90％以上，固染色時普通不加熱固定，以免莢膜伸展變形。細(xì)菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，假設(shè)用普通染色法只能使菌體著色而芽胞不著色(芽胞呈無色透明狀)。芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設(shè)計的。一切的芽胞染色法都基于同一個原那么：除了用著色力強(qiáng)的染料外，還需求加熱，以促進(jìn)芽胞著色。當(dāng)染芽胞時，菌體也會著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌領(lǐng)會脫色。然后用對比度強(qiáng)的染料對菌體復(fù)染，使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色，因此能更明顯地烘托出芽胞，便于察看。細(xì)菌的鞭毛極細(xì)，直徑普通為10～20nm，只需用電子顯微鏡才干察看到。但是，如采用特殊的染色法，那么在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色的方法很多．但其根本原理一樣，即在染色前充用媒染劑處置，讓它堆積在鞭毛上．使鞭毛直徑加粗。然后再進(jìn)展染色。一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：穩(wěn)定無菌操作技求，掌握細(xì)菌及其構(gòu)造的染色技術(shù)。內(nèi)容：1、學(xué)習(xí)細(xì)菌單染色操作技術(shù)。2、學(xué)習(xí)革蘭氏染色技術(shù)。3、學(xué)習(xí)細(xì)菌的莢膜、芽孢及鞭毛染色方法。二、實驗資料和器具1、單染色法：〔1〕大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的斜面菌種?！?〕呂氏美藍(lán)染色液、石炭酸復(fù)紅染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、無菌水〔3〕顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、吸水紙、無菌牙簽。2、革蘭氏染色：〔1〕

黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌〔E.coli〕菌液，待測菌菌液l～2種；〔2〕

革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、〔3〕

香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。3、莢膜染色：(l)在阿須貝(Ashby)無氮培育基上培育3—5天的團(tuán)褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)或者培育2—3天的硅酸鹽細(xì)菌(Bacillusmucilaginosussubspsilicus)(2)李夫森氏染色液、硼酸鈉美蘭染色液、石炭酸復(fù)紅染色液、黑色液。(3)載玻片、接種環(huán)、洗瓶。(4)顯微鏡。4、鞭毛染色：(1)在牛內(nèi)膏蛋白胨斜面上培育19—24小時的假單孢菌(Pseudomonas.sp)，此培育體在取用前經(jīng)過每日移植—代，延續(xù)移植5～7代。(2)新配制的費氏及康氏鞭毛染色液A和B。(3)無菌水、無菌空試管、凹玻片。蓋玻片、干凈載玻片、接種環(huán)、洗瓶。(4)顯微鏡．5、芽孢染色：(1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培育24～36小時的枯草桿菌或者蘇云金桿菌。(2)載玻片、接種環(huán)、酒精燈、洗瓶、鑷子。(3)顯微鏡。(4)香柏油、二甲苯、擦鏡紙．(5)孔雀綠染色液、蕃紅染色液。三、操作步驟1、單染色法〔1〕涂片在干凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水〔圖4－10a〕，用無菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂布面積約1～1.5cm2〔圖4－10b〕?！?〕枯燥將涂片于室溫中自然枯燥?！?〕固定手執(zhí)載片—端，使涂菌的一面向上，將載片經(jīng)過微火2～3次。在火上固定時，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。不能將載片在火上烤，否那么細(xì)菌形狀毀壞(圖4—10c)?！?〕染色將涂片置于程度位置，滴加染色液覆蓋于涂菌處，染色約2min(圖4—10d)?！?〕水洗傾去染色液，斜置載片，用自來水的細(xì)水流由載片上端流下，不得直接沖在涂菌處，直洗至從載片上流下的水中無染色液的顏色為止(圖4—10e)?！?〕枯燥自然晾干或用吸水紙悄然地吸干，留意不要擦掉菌體(圖4—10f)?！?〕待標(biāo)本完全枯燥后，先用低倍鏡和高倍鏡察看，將典型部位移至視野中央，再用油鏡察看。圖4－10單染色方法〔二〕革蘭氏染色法1、制片〔1〕涂菌用無菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在干凈無脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約1cm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌?！?〕枯燥于空氣中自然枯燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速枯燥(溫度不宜過高)?！?〕固定目的是殺死細(xì)菌并使細(xì)菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法，即將細(xì)菌涂片面向上，經(jīng)過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此制片可用于染色。2、染色〔1〕初染：于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料?！?〕滴加盧戈氏碘液，1min后水洗：〔3〕滴加95％乙醇脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據(jù)涂片之厚薄需時30s至1min)?！?〕復(fù)染滴加石炭酸復(fù)紅液復(fù)染1min，水洗?！?〕用濾紙吸干，油鏡鏡檢。3、結(jié)果革蘭氏陽性菌染成籃紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。4、檢測未知菌用以上方法對未知面進(jìn)展革蘭氏染色，并繪圖、記錄染色結(jié)果?！踩城v膜染色法1．石炭酸復(fù)紅染色(1)取培育了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然枯燥(莢膜是多糖類物質(zhì)，不可用火焰烘干)。(2)滴入1～2滴95％乙醇固定(不可加熱固定)。(3)加石炭酸復(fù)紅染液染色1～2min，水洗，自然枯燥。(4)在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，在以勻速推向另一端，涂成均勻的一薄層，自然枯燥。(5)枯燥后用油鏡察看。菌體紅色，莢膜無色，背景黑色。2．背景染色(1)先加1滴墨水于干凈的玻片上，并挑少量褐球固氮菌與之充分混合均勻。(2)放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸收多余的菌液。(3)枯燥后用油鏡察看。背景灰色，菌體較暗．在其周圍呈現(xiàn)一亮堂的透明圈即莢膜。3．李夫森氏－硼酸鈉美蘭染色〔1〕取在阿須貝氏無氮培育基上培育3天的硅酸鹽細(xì)菌少許，制成枯燥涂片(不要加熱固定)?！?〕加李夫森氏染色液染色l0min，傾之染液(勿用水洗)。〔3〕加硼酸鈉美蘭染色液染色5min，水洗，晾干?！?〕油鏡視察可見莢膜被染成紅色，菌體處成藍(lán)色?！菜摹潮廾旧?．方法一：〔1〕用接種環(huán)由培育18～20h的斜面上取假單胞菌菌體少許，用菌滴制片法檢查細(xì)菌的運動性。假設(shè)菌體的運動性很強(qiáng)，那么可作鞭毛染色?！?〕用3～4mL無菌水，將培育體洗下，移入另一無菌試管中，適溫培育10min，再檢查運動性?！?〕用無菌吸管由懸液上部取一小滴，置于一清潔載玻片的一端，將玻片傾斜。使菌液由一端流向另外一端。于是在玻片上做成2～3條菌液帶。待水膜自然枯燥〔切勿用火焰烘〕?！?〕用剛剛過濾的鞭毛染色液A染色5min(不要加熱)?！?〕傾去A液，加鞭毛染色液B染色10min。用蒸餾水悄然沖洗，晾干?！?〕用齊氏石炭酸復(fù)紅染色2～3min。悄然沖洗，晾干(不能用吸水紙吸干)?！?〕先用低倍鏡，再用高倍鏡，最后用油鏡檢查。2．方法二：〔1〕制涂片：先加少量無菌蒸餾水于凹載玻片的凹窩中．再從培育10h左右的斜面菌苔上取菌一環(huán)，輕放在凹窩水面上(不要攪動)，放30度溫箱靜置5～10min．取出，從凹窩水面上悄然取菌液一環(huán)，輕放在干凈的載玻片上(不要涂抹)，放回溫箱，讓其自然枯燥(不要加熱固定)?！?〕染色：在自然枯燥的涂片上，滴加含石炭酸的鞭毛染色液一滴，染色5min，用水悄然沖洗，讓其自然枯燥?！?〕鏡檢：用油鏡察看。五〕芽孢染色法1．方法一：(1)取37℃培育18～24h的枯草芽孢桿菌作涂片，并枯燥，固定。(2)于載片上滴人3～5滴5％孔雀綠水溶液。(3)用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時，開場計算時間約4～5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。(4)傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。(5)用0.5％沙黃水溶液(或0.05％堿性復(fù)紅)復(fù)染1min，水洗。(6)制片枯燥后用油鏡察看。芽孢呈綠色，菌體紅色。2．方法二：(1)加1～2滴自來水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2～3環(huán)培育18～24h的枯草芽孢桿菌菌苔于試管中，并充分均勻打散，制成濃稠的菌液。(2)加5％孔雀綠水溶液2～3滴于小試管中．用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。(3)將此試管浸干沸水浴(燒杯)中，加熱15～20min。(4)用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌于干凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片經(jīng)過微火3次固定。(5)水洗，至流出的水中無孔雀綠顏色為止。(6)加沙黃水溶液，染2～3min后，傾去染液，不用水洗。(7)枯燥后用油鏡察看。芽孢綠色，菌體紅色。四、本卷須知1．載玻片要干凈無脂，否那么菌液涂不開。涂片時，滴水不要過多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌過厚。2．在染色過程中，不可使染液干涸。3．在革蘭氏染色過程中脫色時間非常重要，過長，那么脫色過度，會使陽性菌被染成陰性菌，另外，老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會使陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。3．

莢膜染色涂片不要用加熱固定，以免莢膜伸展變形。4．

鞭毛染色液最好當(dāng)日配置，次日運用那么鞭毛染色淺，察看效果差。染色時一定要充分洗凈A液后再加B液，否那么背景不明晰。5．供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保管在菌體上為宜。五、實驗報告(一)繪圖1．單染色后察看到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形狀圖。2．大腸桿菌革蘭氏染色視野圖。3．金黃色葡萄球菌革蘭氏染色視野圖。4．褐球固氮菌菌體及莢膜的形狀。4．繪出他所察看到的細(xì)菌的形狀及鞭毛著生情況。6．枯草芽孢桿菌及宏大芽孢桿菌的菌體及芽孢形狀，芽孢的著生位置。(二)單染色法操作要點。(三)記錄革蘭氏染色法法步驟，并進(jìn)展結(jié)果分析。六、問題和思索1．涂片在染色前為什么要先進(jìn)展固定?固定時應(yīng)留意什么問題?2．制備染色裝片時應(yīng)留意哪些事項，為什么?制片為什么要完全枯燥后才干用油鏡察看？3．什么是革蘭氏染色法?染色過程應(yīng)留意什么?4．試分析革蘭氏染色法在細(xì)菌分類中的意義。5．組成莢膜的成分是什么?涂片普通用什么固定方法，為什么?6．鞭毛染色的菌種為什么要先延續(xù)傳幾代，并且要采用幼齡菌種?7．根據(jù)他的實驗領(lǐng)會，哪些要素影響鞭毛染色的效果?如何控制?水中細(xì)菌總數(shù)往往同水體受有機(jī)物污染的程度呈正相關(guān)。因此，它是評價水質(zhì)污染程度的—個重要目的之一。由于重金屬及某些其它的有毒物質(zhì)對細(xì)菌有殺滅或抑制造用，在總細(xì)菌數(shù)少的水樣中并不能排除這些物質(zhì)的污染。實驗六水中細(xì)菌總數(shù)的檢測本實驗采用規(guī)范平皿法對水樣中細(xì)菌作計數(shù)，這是測定水中好氧和兼性厭氧異養(yǎng)細(xì)菌密度的方法。由于細(xì)菌在水體個能以單獨個體、成對、鏈狀、成簇或成團(tuán)的方式存在，此外沒有單獨的一種培育基或其一環(huán)境條件能滿足—個水樣中一切細(xì)菌的生理要求，所以由此法所得的菌落數(shù)實踐上要低于被測水樣中真正存在的活細(xì)菌的數(shù)目。細(xì)菌總數(shù)是指1mL水樣在營養(yǎng)瓊脂培育基中，37℃24h培育后所生長的菌落數(shù)。普通規(guī)定，1mL自來水的總菌數(shù)不得超越100個。一、目的和內(nèi)容了解水中細(xì)菌總數(shù)的測定方法。二、資料和器皿(—)以下固體培育基1、營養(yǎng)瓊脂培育基2．2216E培育基蛋白胨50g酵母膏1.0gFePO40.01g瓊脂18.0g蒸餾水1000mLpH7.6~7.8(二)無菌采樣瓶，滅菌移液管，滅菌培育皿，盛有4.5mL滅菌蒸餾水的試管。三、方法和步驟(一)采集水樣，留意采集水樣的代表性和數(shù)量，詳見第2.9節(jié)。(二)汲取0.5mL水樣(河水、污水、游泳池水或港灣水等)，注入盛有4.5mL無菌水的試管中，混勻成10-1稀釋液，留意在吸水樣前，水樣及稀釋水應(yīng)徹底攪動均勻。(三)吸稀釋液0.5ml按10倍稀釋法稀釋成10-2、10-3、10-4等延續(xù)的稀釋度〔圖4－11〕。(四)根據(jù)水樣的干凈程度，污染嚴(yán)重者選取10-2、10-3、10-4三個延續(xù)稀釋度，中等的選取10-1、10-2、10-3三個延續(xù)稀釋度。稀釋度的選擇是本實驗準(zhǔn)確度的關(guān)鍵，選擇適宜者，平皿上菌落總數(shù)介于30和300之間。(五)汲取由高倍至低倍的稀釋液，每個稀釋液分別注入兩個培育皿，每皿1mL。(六)注入徹底融化，然后冷卻到45℃的營養(yǎng)瓊脂培育基〔用于河水樣〕或2216E培育基(用于海水、港灣水樣)約15mL，立刻旋搖培育皿，充分混勻。方法是握住平皿，先往一個方向畫圓，再朝相反方向回轉(zhuǎn)；或一面畫圓，一面適當(dāng)傾斜。小心勿使這個混合液體濺到培育皿的邊緣。讓平皿培育基于程度位置放置至固化。(七)接種河水樣的培育皿，倒置于37℃培育24h，接種海水樣、港灣水樣的培育皿，應(yīng)倒置后于18~20℃下培育到長出明顯菌落(5天左右)。四、結(jié)果與分析取同—稀釋度的平板培育物，依菌落計算原那么進(jìn)展計算。(一)菌落計算原那么平皿菌落的計算．可用肉眼察看，必要時用放大鏡檢查，防止脫漏，也可借助于菌落計數(shù)器計數(shù)。對那些看來類似，并且長得相當(dāng)接近，但并不相觸的菌落，只需它們之間的間隔至少相當(dāng)于最小菌落的直徑，便應(yīng)該—一予以計數(shù)。對鏈狀菌落．看來似乎是由于一團(tuán)細(xì)菌在瓊脂培育基和水樣的混合中被崩解所致，應(yīng)把這樣的一條鏈當(dāng)做一個菌落來計數(shù)，不可去數(shù)鏈上各個單—的菌鏈。假設(shè)同—個稀釋度中一個平皿有較大片狀菌落生長時，那么不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平皿計數(shù)該稀釋度的平均菌落數(shù)。假設(shè)片狀菌落少于平皿的一半時，而另—半中菌落分布又均勻，那么可將其菌落數(shù)的2倍作為全皿的數(shù)目。在記下各平皿菌落數(shù)后，應(yīng)算出同一稀釋度的平均菌數(shù)，供下—步計算時用。(二)計算方法l、首先選擇平均菌落效在30～300者進(jìn)展計算，當(dāng)只需一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，即可用它作為平均值乘其稀釋倍數(shù)。2、假設(shè)有兩個稀釋度的平均菌落數(shù)都在30～300之間，那么應(yīng)按兩者的比值來決議。假設(shè)其比值小于2，應(yīng)報告兩者的平均數(shù)；假設(shè)大于2，那么報告其中較小的數(shù)字(見表4—l例2和例3)。3、假設(shè)一切稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，那么應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表4—1例4)。4、假設(shè)一切稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，那么應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表4—1例5)。5、假設(shè)全部稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，那么以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表4—l例6)。6、菌落計數(shù)的報告，菌落在100以內(nèi)時按實有數(shù)報告；大于100時，采用二位有效數(shù)字；在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)也可用10的指數(shù)來表示，〔見表4—1的“報告方式〞欄〕。在所需報告的菌落數(shù)多至無法計算時，應(yīng)注明水樣的稀釋倍數(shù)。表4－1稀釋度選擇及菌落報告方式例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)〔個/mL〕報告方式〔個/mL〕10-110-210-31016420－1640016000或1.6×10422760295461.63775038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044無法計數(shù)4651513－513000510000或5.1×105527115－270270或2.7×1026無法計數(shù)30512－3050031000或3.1×104圖4－11菌液逐級稀釋過程表示圖五、實驗報告1、論述細(xì)菌計數(shù)原那么。2、報告樣品中細(xì)菌總數(shù)。六、問題與討論微生物應(yīng)思索哪些原那么？培育時，為什么要把已接種的培育基倒置保溫培育？實驗七水中大腸菌群(Coliformgroup)細(xì)菌的檢測一、實驗?zāi)康牧私獯竽c菌群的檢測方法。二、資料與器皿(—)培育基1、普通乳糖蛋白胨培育液蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化鈉5g1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL蒸餾水1000mLpH7.2~7.4將蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)理pH為7.2~7.4，再參與1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管10mL，115℃滅菌20min。2、三倍濃縮乳糖蛋白胨培育液按上述普通乳糖蛋白胨培育液濃縮三倍配制，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管5mL。3、品紅亞硫酸鈉培育基〔供平板分別用〕蛋白胨10g乳糖10gK2HPO43.5g瓊脂15～20g蒸餾水1000mL無水亞硫酸鈉5g左右5％的堿性品紅乙醇溶液20mLpH7.2~7.44、伊紅美藍(lán)培育基〔EMB培育基〕〔供發(fā)酵法平板分別用，3和4可任選一種〕蛋白胨10g乳糖10gK2HPO42.0g瓊脂20g蒸餾水1000mL2％伊紅〔曙紅〕水溶液20mL5％美藍(lán)〔亞甲藍(lán)〕水溶液13mLpH7.2~7.4(二)滅菌移液管、滅菌稀釋水、試管、杜漢氏小管、革蘭氏染色液、滅菌培育皿。三、方法與步驟(一)水樣的采集供細(xì)菌學(xué)檢驗的水樣，必需按普通無菌操作的根本要求采集，并保證再運送、儲存過程中不受污染。水樣從采集到檢驗不應(yīng)超越4小時，在0～4℃下保管不應(yīng)超越24小時，如不能在4小時內(nèi)分析，應(yīng)在檢驗報告上注明保管時間和條件?！?〕自來水取樣：應(yīng)在水龍頭翻開放水5分鐘，再用無菌容器接取水樣，待分析。如水樣內(nèi)含有余氯，那么采樣瓶滅菌后按每500mL水樣加3％Na2S2O3.5H2O溶液1mL。江、河、湖、池自然水體取樣：可用采樣器，采樣瓶應(yīng)先滅菌。采樣后，瓶內(nèi)應(yīng)留有空隙。假設(shè)與其他化驗工程結(jié)合取樣，細(xì)菌學(xué)分析水樣應(yīng)采在其他樣品之前?！捕吵醢l(fā)酵實驗水樣稀釋：制備水樣10-1、10-2的稀釋液，方法為用無菌移液管汲取水樣10mL放于盛有90mL無菌水和假設(shè)干玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩使混合均勻，并使其中的細(xì)菌盡量呈單個存在，即為10-1稀釋液；再從10-1制備10-2稀釋液。以此類推，稀釋到所需倍數(shù)。

〔2〕接種和培育：以無菌操作于5支三倍濃縮培育基〔接種前一定應(yīng)先檢查杜漢氏小管內(nèi)有無氣泡〕中各參與水樣10mL，5支普通培育基試管中參與水樣1mL，5支普通培育基試管中參與10-1稀釋液1mL，小心混勻放入37℃培育箱中培育24小時。此即5管法。〔3〕結(jié)果察看：37℃中培育24h后取出察看，察看有無氣體〔杜漢氏小管內(nèi)有無氣體〕和酸產(chǎn)生〔培育基有無變色〕。在48h之間，培育管內(nèi)倒置的杜漢氏小管內(nèi)有任何量的氣體積累，或培育基顏色從紫色變?yōu)辄S色，便可初步斷定為陽性反響。假設(shè)實驗所測定的15支管中均為陽性反響，闡明濃水樣污染嚴(yán)重，可將樣品進(jìn)一步稀釋后，再按上述方法接種、培育和察看。(三)平板培育實驗將初發(fā)酵實驗中產(chǎn)酸產(chǎn)氣的后只產(chǎn)酸或只產(chǎn)氣的試管中的培育物用接種環(huán)取少許，劃線接種在品紅亞硫酸鈉培育基或伊紅美藍(lán)培育基平板上，為了確保獲得分別的單菌落，須留意以下事項：〔1〕劃線間距至少相隔0.5厘米；〔2〕接種釘尖端要稍彎；〔3〕先對試管輕擊并使之傾斜，以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣；〔4〕劃線時要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培育基平面．以免刮傷或戳破培育基。劃線后培育皿倒置，于37℃培育18～24h。24h后，察看在平板上出現(xiàn)的單個菌落，其中心有深綠色金屬光澤者為較典型的大腸菌群菌落。盡能夠挑取典型的或接近典型的大腸菌群菌落，在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線，置37℃培育24h。挑取斜面培育物制成涂片，進(jìn)展革蘭氏染色，凡屬革蘭氏陰性桿菌，即確認(rèn)了大腸菌群細(xì)菌的存在．(四)復(fù)發(fā)酵驗證明驗經(jīng)上述經(jīng)染色為革蘭氏陰性的典型菌落，用接種環(huán)刮取部分接種于盛有乳糖培育基的試管中，在37℃培育24h，陽性反響者即確以為大腸菌群細(xì)菌。四、結(jié)果計算在初發(fā)酵實驗中，能夠有極少數(shù)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的非大腸菌群細(xì)菌混在陽性可疑反響管中，經(jīng)過對初發(fā)酵中的陽性可疑管進(jìn)展平板和復(fù)發(fā)酵實驗，并進(jìn)展革蘭氏染色和細(xì)菌形狀的察看，可將那些少量的非大腸菌群細(xì)菌(“假陽性管〞)刪除去，故在記錄時只能把三步實驗都呈陽性的試管計入陽性反響管。假設(shè)初發(fā)酵接種水樣量為10mL、1mL、0.1mL，可直接查表4－2求出原水樣100mL中大腸菌群指數(shù)〔MPN〕。假設(shè)接種水樣量低于上述水樣量，那么經(jīng)下面的換算式計算。目前我國系以1L水樣中的菌數(shù)為報告值，即為MPN×10。目前我國系以1L水樣中的菌數(shù)為報告值，即為MPN×10。表4－2水樣的總大腸菌群檢索表出現(xiàn)陽性反響的試管數(shù)每100ml中的細(xì)菌的MPN出現(xiàn)陽性反響的試管數(shù)每100ml中的細(xì)菌的MPN10ml管中1ml管中0.1ml管中10ml管中1ml管中0.1ml管中000000000000012345024579000000222222012345467911130000001111110123452467911000000333333012345679111315000000444444012345891113151711111133333301234581012151719下略五、實驗報告1、簡述實驗過程。2、計算實驗結(jié)果。六、問題與思索實驗過程中有什么問題，他以為緣由何在，如何抑制？實驗八土壤及空氣中微生物的檢測土壤是微生物生活最適宜的環(huán)境、它具有微生物所需求為一切營養(yǎng)物質(zhì)和微生物進(jìn)展生長繁衍及生存的各種條件．所以土壤中微生物的數(shù)量和種類都很多。它們參與土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循環(huán)作用。此外，土壤中微生物的活動對土壤構(gòu)成、土壤肥力和作物消費都有非常重要的作用。因此，查明土壤中微生物的數(shù)量和組成情況，對開掘土壤微生物資源和對土壤微生物實行定向控制無疑是非常必要的?？諝庵袥]有可為微生物直接利用的營養(yǎng)物質(zhì)和足夠的水分，它不是微生物生長繁衍的天然環(huán)境，因此空氣中沒有固定的微生物種類。它主要經(jīng)過土壤塵埃、小水滴、人和動物體表的于燥零落物、呼吸道的排泄物等方式被帶人空氣。由于微生物能產(chǎn)生各種休眠體，故可在空氣中存活相當(dāng)長的時期而不至死亡?？諝庵形⑸锏姆N類，主要為真菌和細(xì)菌。其數(shù)量那么取決于所處的環(huán)境和飛揚(yáng)的尖埃量。實驗?zāi)康膶W(xué)會土壤微生物的檢測方法，了解土壤中微生物的數(shù)量和組成。了解一定環(huán)境空氣中微生物的分布情況，學(xué)習(xí)并掌握檢定和計數(shù)空氣微生物的根本方法。二、資料和儀器(—)培育基〔詳細(xì)配方見實驗一〕肉膏蛋白胨瓊脂培育基〔培育細(xì)菌〕高氏一號瓊脂培育基〔培育放線菌〕查氏培育基〔培育霉菌〕(二)滅菌稀釋水、滅菌吸管、滅菌培育皿。(三)土壤樣品、天平、稱旦紙?！菜摹澈銣叵?、氣體流量計三、方法和步驟土壤微生物檢測(1)土壤樣品的延續(xù)稀釋取新穎土壤樣品1g，在酒精燈火焰旁加到一個裝有99mL無菌水的錐形瓶中〔錐形瓶內(nèi)裝有幾個玻璃珠〕，將錐形瓶依左右方向振蕩數(shù)十次使土與水充分混合，將菌分散，即為10-2菌液。然后再按實驗六的方法將菌懸液進(jìn)一步稀釋。不斷稀釋到適宜的稀釋倍數(shù)〔使接種1mL菌液的培育皿平板上出現(xiàn)30～300個菌落。(2)根據(jù)樣品中各種微生物的數(shù)量選擇適宜的稀釋度，每種選擇三個稀釋度，每個稀釋度設(shè)兩個反復(fù)。選擇出適宜的稀釋度后，用移液管將懸液1mL轉(zhuǎn)移到培育皿中?！?〕將已滅菌的培育基融化后冷卻至45℃〔溫度過高，培育皿蓋上凝結(jié)水太多，菌易被沖掉；溫度過低，那么培育基凝固，不易倒出〕。右手拿培育基，左手把皿蓋翻開一小縫傾入培育基15～20mL，迅速蓋皿蓋，平放桌上，悄然旋轉(zhuǎn)，使培育基和土壤懸浮液充分混勻，凝固后，制成平板，將培育皿倒置于培育箱中培育?！?〕分別放線菌時，在制備平板前在培育基中參與5％的酚溶液2滴，以抑制細(xì)菌生長，于25～30℃培育箱中培育7～10天察看。霉菌分別，在制備平板前在培育基中參與80％的乳酸數(shù)滴，于25～30℃培育箱中培育3～4天察看。細(xì)菌在37℃培育24小時察看〔見圖4－12〕圖4－12細(xì)菌菌落形狀?！瞐〕肉眼察看的細(xì)菌菌落形狀的多變性。菌落總體外形和邊緣情況可由菌落上方俯視察看。而菌落高度那么由平板邊緣程度察看?！捕晨諝庵形⑸锏臋z測1、沉降法(1)將肉膏蛋白胨瓊脂培育基、查氏瓊脂培育基、高氏一號瓊脂培育基溶化后，各倒四個平板?！?〕將上述三種培育皿各取二個，在室外翻開皿蓋，分別暴露于空氣中5分鐘、10分鐘。另二個培育皿在實驗室空氣中分別暴露5分鐘、10分鐘?！?〕肉膏蛋白胨平板于37℃，倒置培育1天；查氏瓊脂平板和高氏一號瓊脂平板倒置于28℃培營養(yǎng)別培育3～4天和7～10天后各自計算其菌落數(shù)，察看菌落形狀、顏色?！?〕計算每m3空氣中微生物的數(shù)量。奧梅梁斯基曾建議：面積為100cm2的平板培育基，暴露在空氣中5分鐘相當(dāng)于10升空氣中的細(xì)菌數(shù)。計算公式如下：

2、篩孔采樣法將四個細(xì)菌培育基平板和采樣儀器帶到受試環(huán)境，開啟采樣儀，調(diào)好空氣流量，根據(jù)流量確定采樣時間，關(guān)上電源。將細(xì)菌培育基平板放入采樣器中，調(diào)好采樣時間后立刻接通電源。到時后，取出平皿，并立刻蓋好皿蓋。將平板放于培育箱內(nèi)37℃培育1天，察看計數(shù)平皿中的菌落數(shù)。根據(jù)下式計算1m3空氣中細(xì)菌數(shù)。式中X為1m3空氣中的細(xì)菌數(shù)；N為平皿上的平均菌落數(shù)；L為采樣空氣體積〔升〕。四、結(jié)果與分析土壤1、根據(jù)平皿上菌落數(shù)與平皿內(nèi)土壤懸液的稀釋倍數(shù)算得每g土壤中微生物的數(shù)量，本卷須知請參閱“水中細(xì)菌總數(shù)的檢測〞實驗。2、選擇剛好能把細(xì)菌分開，而稀釋倍數(shù)最低的平板〔普通含菌落30～300個〕計算每克土樣中微生物的數(shù)量：按實驗六表6－1報告樣品微生物數(shù)量。3、填寫表4-3?！捕晨諝飧鶕?jù)沉降法，記錄空氣中微生物的種類和相對數(shù)量，填寫表4-4，推算出1m3空氣中細(xì)菌數(shù)。五、問題與討論用稀釋法進(jìn)展微生物計數(shù)時，怎樣保證準(zhǔn)確并防止污染？為什么在霉菌計數(shù)時要參與幾滴80％的乳酸？加在什么地方？為什么在放線菌計數(shù)時要參與5％的酚？加在什么地方？比較空氣微生物檢測兩種方法的優(yōu)缺陷。實驗九微生物在自然界氮素循環(huán)中的作用在自然界中，生物所需求的各種化學(xué)元素，經(jīng)過生物的生命活動，—方面被合成為有機(jī)物組成生物體；另一方面這些有機(jī)物質(zhì)又被分解成無機(jī)物而前往自然界。如此組成了地球上物質(zhì)的循環(huán)，微生物在自然界的物質(zhì)循環(huán)中具有非常重要的作用。一、實驗?zāi)康恼{(diào)查微生物在自然界氮素循環(huán)中的作用。二、資料與器皿(一)菌種：蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)普通變形菌(Proteusvulgaris)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(二)菜園土壤樣品(三)培育基4％蛋白胨液體培育基亞硝酸鹽生成培育基硝酸鹽生成培育基硝酸鹽培育基固氮菌培育基(四)試劑：萘氏試劑查氏試劑二苯胺試劑a－萘胺試劑對氨基苯磺酸試劑(五)器皿：培育皿、試管、錐形瓶、比色板三、方法與步驟(一)氨化作用以下述方式在5支4％的蛋白胨液體培育基試管中接種：接一環(huán)菜園土壤；接種蠟狀芽孢桿菌；熒光假單孢菌；普通變形菌；不接種(對看管)。2、在30℃培育48h。3、檢查各管中有無氨存在，方法為：在比色板的凹坑中加一滴萘氏試劑。然后用吸管吸一滴待測試管中的液體，假設(shè)呈黃色表示有氨存在。(二)硝化作用1、亞硝酸鹽的生成①在亞硝酸生成培育基中接種0.1g土樣(中性至微堿性)，在25℃培育。②培育一周后測試有無亞硝酸鹽存在，方法是加三滴查氏試劑和一滴硫酸〔濃硫酸：水＝1：3〕至比色板凹坑中，再以吸管加一滴培育物，呈藍(lán)黑色示有亞硝酸鹽存在；③用萘氏試劑測試培育物中能否存在氨，假設(shè)有氨存在那么再培育一段時期，直至萘氏試劑反響呈陰性．亦即氨全部氧化成亞硝酸鹽。2、硝酸鹽生成①在硝酸鹽生成培育基中接種0.1g土樣，30℃培育。②每隔一周用查氏試劑測試培育物，直至亞硝酸鹽實驗反響是陰性(由于二苯胺試劑對硝酸鹽和亞硝酸鹽都呈陽性反響)。③在比色板凹坑中加一滴二苯胺試劑和二滴濃硫酸，然后再加一滴培育物，深藍(lán)黑色表示硝酸鹽的存在。(三)反硝化作用l、在一支放有杜漢氏小管的硝酸鹽液體培育基中接種0.1g土樣。另一管接種銅綠假單胞菌。2、在30℃培育15d以上。3、察看氣體的產(chǎn)生。4、加1mlLa—萘胺試劑和1mL對氨基苯磺酸試劑至培育管中〔留意勿用口吸〕。在30s內(nèi)呈紅色示有硝酸鹽存在。(四)自生固氮作用1、在—個含有一薄層自生固氮菌培育基的錐形瓶中，接種1g菜園土。在30℃培育數(shù)天。2、在外表有生長物產(chǎn)生時，對其進(jìn)展染色，并在顯微鏡下檢查粘性物質(zhì)中能否有桿狀或橢園形細(xì)胞。四、培育基及試劑的配制(一)亞硝酸鹽生成培育基(NH4)2S042.0gK2HPO41.0gMgS040.5gFeS040.4gCaCO35.0~10.0g蒸餾水1000mL培育基不需滅菌(二)硝酸鹽生成培育基NaNO31.0gK2HPO41.0gMgS040.3gNaCO31.0gNaCl0.4gFeS040.4g蒸餾水1000mL培育基可不滅菌〔三〕硝酸鹽培育基蛋白胨5.0g牛肉膏3.0gKNO3，(或NaNO3)5.0g蒸餾水1000mLpH7.0(四)固氮菌培育基甘露糖醇15.0gK2HPO40.5gMgS040.2gCaSO40.1gNaCl0.2gCaCO35.0g瓊脂18gpH8.3(五)萘氏試劑稱45.5gHgI2和34．9gKI溶于500mL無氨蒸餾水中。(六)查氏試劑l、在含有4.0g淀粉的150mL水溶液中，不斷攪拌并漸漸參與100mL煮沸的20％ZnCl2水溶液。繼續(xù)加熱使淀粉盡能夠多地溶解．溶液應(yīng)廓清。2、用水稀釋并加2gKI。3、稀釋至1L，過濾，盛于帶塞的棕色瓶中備用。(七)二苯胺試劑二苯胺0.7g濃硫酸60.0mL水28.8mL濃鹽酸11.3mL配制：將二苯胺溶于硫酸中，然后加水。緩慢冷卻，再參與鹽酸，放置過夜后備用。(八)a-萘胺試劑溶解0.6ga-萘胺于含1mL濃鹽酸的蒸餾水中，然后稀釋至100mL。貯于棕色瓶中放于冷處，備用。(九)對氨基苯磺酸試劑溶解0.6g對氨基苯磺酸于70mL沸蒸餾水中。冷卻后加20mL濃鹽酸。然后用水稀釋至100mL，貯于棕色瓶中，保管于冷處，備用。五、結(jié)果與實驗報告記錄并解釋結(jié)果。根據(jù)實驗繪出氮循環(huán)圖。六、問題與思索從實驗結(jié)果論述微生物在自然界氮循環(huán)中的作用。實驗十光合細(xì)菌的培育及其對高濃度有機(jī)廢水的凈化作用光合細(xì)菌是一大類具有光合色素，能在厭氧、光照條件下進(jìn)展光協(xié)作用的原核生物的總稱。光合細(xì)菌中的紅螺菌科細(xì)菌，在光照厭氧或黑暗好氧條件下，都具有降解高濃度有機(jī)物的才干，它們既不象好氧的活性污泥微生物那樣受污水中溶解氧濃度的限制，又不象嚴(yán)厲厭氧的甲烷細(xì)菌等對氧的存在非常敏感，即使生境中氧量添加，其降解有機(jī)物的活性也不受抑制，產(chǎn)生的菌體又可作為重要的資源加以利用。因此，這種適宜于處置高濃度有機(jī)廢水的光合細(xì)菌處期法(簡稱PSB處置法)正引起人們的高度注重。目前PSB法已用于處置豆制品廢水、濃質(zhì)糞便水、羊毛洗滌廢水、淀粉廢水及抗生素發(fā)酵工業(yè)廢水。實驗?zāi)康倪M(jìn)一步了解光合細(xì)菌的培育及其對高濃度有機(jī)廢水的凈化作用。二、資料與器皿(一)菌種球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonassphaeroides)沼澤紅假單胞菌(R.palustris)(二)培育基M瓊脂培育基(Molisch瓊脂培育基)范尼爾氏液體培育基(vanNiel培育基)(三)厭氧培育缸(四)滅菌的具塞100mL錐形瓶、滅菌的具塞250mL錐形瓶、200mL燒杯、100mL量筒。(五)真空泵(六)焦性沒食子酸、碳酸鈉、石蠟三．方法與步驟(一)光合細(xì)菌的菌種培育1取球形紅假單胞菌和沼澤紅假單胞菌原種培育物，分別再M瓊脂培育基瓊脂柱中進(jìn)展穿刺接種，每種接二支。2．把經(jīng)過穿刺接種的試管，每種取一支，參與混合石蠟液〔由液體石蠟和固體石蠟1：1比例，加熱后混合配制而成〕于試管頂部，作為與氧隔離的封蓋，置于28℃下，在2000～5000lx的光照進(jìn)展培育。3．另二支接種的試管．放入?yún)捬醺變?nèi)，用焦性沒食子酸和碳酸鈉反響來吸氧，普通1g焦性沒食子酸一個大氣壓下，具有吸收100mL空氣中的氧氣的才干，據(jù)此可推算出不同大小厭氧缸中吸氧劑的加量。立刻將厭氧缸缸蓋緊閉，用真空泵抽氣5min左右．使厭氧缸內(nèi)空氣減壓至1／3左右。有條件的還可將過濾除菌的氮氣或氬氣充入?yún)捬醺變?nèi)，使厭氧缸內(nèi)呵斥個理想的厭氧壞境。4與石蠟封蓋試管一樣，置于28℃，光照培育4~5天，察看在沿穿刺線上長出鮮紫紅色或桔紅色的菌苔，即為己生長勝利，對兩種方法的結(jié)果加以比較。5．在厭氧缸中的培育管瓊脂頂部，參與1~2mL滅菌的液體石蠟．進(jìn)展保種。(二)光合細(xì)菌的增殖培育1．用范尼爾液體培育基加至已滅菌的磨口具塞250mL錐形瓶內(nèi)，使之接近瓶頸部。2．取上述穿刺培育的光合細(xì)菌菌種管，用接種環(huán)挑取部分培育物，轉(zhuǎn)接入瓶內(nèi)。每種菌各接一瓶，然后再用液體培育基加滿至瓶頸口，小心用瓶蓋悄然蓋緊，使多余培育液溢出。留意加塞時不要使瓶內(nèi)留有氣泡。3將上述錐形瓶，在28℃、2000~5000lx光照下培育，逐日察看瓶內(nèi)光合細(xì)菌生長情況和出現(xiàn)的顏色變化。4挑取菌種管中部分剩余的培育物，制成涂片，在簡單染色后視察，比較兩種菌株形狀上的差別，并結(jié)合穿刺培育和液體培育上的特征，列表記錄。(三)光合細(xì)菌對高濃度有機(jī)廢水的降解作用1．取豆制品廠黃泔水〔或淀粉廢水、抗生素發(fā)酵廢水、羊毛洗滌廢水等類高濃度有機(jī)廢水〕80mL放入200mL燒杯內(nèi)。2．把上述增殖培育好的球形紅假單胞菌菌液(或沼澤紅假單胞菌菌液)汲取80mL參與燒杯內(nèi)，與廢水充分?jǐn)噭蛳嗷?、調(diào)整pH至7.2~7.5。3．取出混合液50mL測定其CODCr，BOD5，作為實驗起始時的水質(zhì)。4．將剩下的混合液加到滅菌的100mL具塞錐形瓶內(nèi)，加至瓶頸口．蓋上瓶塞，使余液溢出，留意勿使瓶內(nèi)留有氣泡。5.在28℃，光照培育至24h(或48h)后取出，測定瓶內(nèi)混合液的CODCr和BOD5值，對照0h的CODCr和BOD5值．算得有機(jī)物的去除率。四、結(jié)果與分析將二株光合細(xì)菌菌株的形狀、穿刺培育物和液體培育物特征以及對各種高濃度有機(jī)廢水的凈化效果列表比較。五、培育基配制(一)M瓊脂培育基(Molisch瓊脂培育)蛋白胨10g甘油(或糊精)5gMgSO40.5gKH2PO40.5gFeSO4痕量瓊脂18gpH7.20.11Kpa滅菌15min(二)范尼爾氏液體培育基(vanNiel培育基)酵母膏1～2gNH4Cl1gMgCl20.2gK2HPO40.5gNaCl1gNaHCO35g蒸餾水1000mLpH中性如要高壓滅菌，NaHCO3應(yīng)另作抽濾除菌后添加。六、問題與思索光合細(xì)菌對高濃度有機(jī)廢水的凈化作用和其它細(xì)菌相比有什么優(yōu)勢？實驗十一酚降解菌的分別及其性能的測定在工業(yè)廢水的生物處置中，對污染成分單一的有毒廢水?？蛇x育特定的高效菌種進(jìn)展處置。這些高效菌具有處置效率高、耐受毒性強(qiáng)等優(yōu)點。本實驗經(jīng)過挑選酚分解微生物來掌握特定高效菌種的常規(guī)分別方法。挑選所得高效酚分解菌種除了具有較強(qiáng)的分解酚才干外．還必需能構(gòu)成菌膠團(tuán)，才干在活性污泥成生物膜中保管下來．實驗?zāi)康?、了解菌膠團(tuán)構(gòu)成才干的鑒定方法。2、分別高效酚降解菌。二、資料和器皿(—)培育基營養(yǎng)肉湯液體培育基營養(yǎng)肉湯瓊脂培育基尿素培育基蛋白胨培育基(二)測酚試劑及需用的儀器(三)搖床、恒溫培育箱(四)250mL錐形瓶、玻璃珠及石英砂三、方法與步驟(一)采樣為了獲得酚分解才干較強(qiáng)的菌種，可在高濃度含酚廢水流經(jīng)的場所采樣，如排放含酚廢水下水道的污泥、沉渣等，在這些地方分得的微生物往往降解酚才干較強(qiáng)。為了獲得既能降解酚、又有良好的構(gòu)成菌膠團(tuán)才干的微生物，也可在處置含酚廢水的構(gòu)筑物中取活性污泥或生物膜進(jìn)展分別。(二)單菌株分別1．將上述采得樣品，分別置于裝有玻璃珠及石英砂的250mL無菌錐形瓶中，在搖床上振蕩片刻．使樣品分散、細(xì)化。2．分別以稀釋平