動物肝臟中DNA的提取

動物肝臟中DNA的提取南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化實驗報告 動物肝臟中DNA的提取一實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握用濃鹽法從動物組織中提取DNA的原理和技術(shù)了解分離提取DNA的一般原理二實驗原理一、核酸提取的主要步驟：破碎細胞：研磨、組織勻漿、超聲波、凍融；一硫氰酸胍、堿裂解；酶解（溶菌酶）除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子：酚/氯仿抽提、蛋白質(zhì)變性（SDS、異硫氰酸胍等）、蛋白酶處理、高鹽洗滌除去其他不需要的核酸分子沉淀核酸，去除鹽類，有機溶劑等雜質(zhì)二提取DNA的注意事項避免過酸、過堿及高溫加入DNA酶抑制劑：檸檬酸、氰化物、碑酸鹽、EDTA、SDS、苯酚等蛋白變性劑反映不宜過于劇烈，以防機械張力使核酸鏈破壞。加入RNA降解酶除RNA三、DNA的主要來源動物組織及器官：脾、肝、胸腺、魚類精子等。植物：種子的胚芽等微生物：細菌、酵母菌等核酸和蛋白質(zhì)在生物體中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于細胞核中，RNA主要存在于核仁及細胞質(zhì)中。生物體組織細胞中的脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白——脫氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，這兩種復(fù)合物在不同的電解質(zhì)溶液中的溶解度有較大差異。在低濃度的NaCl溶液中，DNP的溶解度隨NaCl濃度的增加而逐漸降低，當(dāng)NaCl濃度達到0.14mol/L時，DNP的溶解度約為純水中溶解度的1%（幾乎不溶）；但當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)升高時，DNP的溶解度又逐漸增大，當(dāng)NaCl濃度增至0.5mol/L時，DNP的溶解度約等于純水中的溶解度，當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)增至1.0mol/L時，DNP的溶解度約為純水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP則不一樣，它在濃NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同濃度的NaCl溶液將DNP和RNP分別抽提出來。在低濃度的NaCl溶液中，DNP的溶解度隨NaCl濃度的增加而逐漸降低，當(dāng)NaCl濃度達到0.14mol/L時，DNP的溶解度約為純水中溶解度的1%（幾乎不溶）；但當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)升高時，DNP的溶解度又逐漸增大，當(dāng)NaCl濃度增至0.5mol/L時，DNP的溶解度約等于純水中的溶解度，當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)增至1.0mol/L時，DNP的溶解度約為純水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP則不一樣，它在濃NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同濃度的NaCl溶液將DNP和RNP分別抽提出來。將抽提得到的DNP用十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，DNA即與蛋白質(zhì)分開，可用氯仿-異丙醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA溶于溶液中，加入適量的乙醇，DNA即析出，進一步脫水干燥，即得白色纖維狀的DNA粗制品。為了防止DNA（或RNA）酶解，提取時加入乙二胺四乙酸（EDTA）。大部分多糖在用乙醇或異丙醇分級沉淀時即可除去。DNA中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍色反應(yīng)。制備過程應(yīng)在低溫下（4度）進行，防止過酸，過堿及其他引起核降解的因素。必要時加入酶抑制劑（檸檬酸、EDTA等可以抑制DNA酶活性，SDS或苯酚等蛋白質(zhì)變性劑可以使核酸降解酶破壞）動植物的DNA核蛋白能溶于水及高濃度的鹽溶液，但在0.14mol/l的鹽溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白則溶于0.14mol/l鹽溶液，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。在核酸分子中，由于磷酸基的存在，使其酸性占優(yōu)勢，DNA或RNA都能溶于水中，而不溶于有機溶劑。用絡(luò)合劑EDTA抑制核酸水解酶的活力，同時用去污劑SDS把蛋白質(zhì)和DNA分開，再用氯仿-異丙醇作為蛋白質(zhì)的變性劑沉淀蛋白質(zhì)最后用乙醇把DNA沉淀出來。三實驗器材搗碎機離心機手術(shù)剪離心管刻度吸管燒杯（100ml，250ml）玻棒新鮮動物肝臟石英比色皿量筒（10ml，100ml）容量瓶（50ml）四實驗試劑1、 0.1mol/LNaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉溶液（pH6.8）。2、 0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L檸檬酸三鈉溶液:氯化鈉0.828克及檸檬酸三鈉0.341克溶于蒸餾水，稀釋至1000ml。3、 95%乙醇（A.R.）。4、 NaCl固體（A.R.）。5、 5%SDS溶液：5gSDS溶于100ml水中。6、 氯仿（A.R.）。7、 V（氯仿）：V（異戊醇）混合液20:1五實驗操作

）粗提稱取豬肝8g于100ml的小燒杯中，用剪刀剪碎，加入2倍重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液（16ml），高速勻漿。.將勻漿液（~25ml）轉(zhuǎn)移到100ml離心管中，在4000r/min下離心10min，棄去上清液。沉淀中繼續(xù)加入25ml緩沖液，攪拌均勻后于4000r/min離心20min,取沉淀。2）分離DNP、除蛋白.將上述沉淀轉(zhuǎn)移至250ml燒杯中，加入40ml0.1mol/LNaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液、21ml氯仿/異戊醇、4ml5%SDS,用保鮮膜封口，振搖30min。.緩慢加入3.6gNaCl（事先在研缽中研成粉末）使體系終濃度為1mol/L。將混合液轉(zhuǎn)移至離心管中于3500r/min離心20min，取上清水相（用滴管吸取并量體積）?！揖誓髮印袡C和場一本格（含DNA—我臼凝殷層—有機和場一本格（含DNA仍鹽）3）沉淀DNA.在水相中加入等體積95%乙醇，邊加邊用玻璃棒朝一個方向慢慢攪動直至溶液澄清，將DNA凝膠纏繞在玻璃棒上，用濾紙吸去多余的乙醇，得DNA粗品。【注】用玻棒纏繞DNA有困難時，亦可緩慢搖動燒杯以助于DNA聚集。6.將DNA粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至50ml，作為待測樣品。六注意事項1、 勻漿（破碎細胞）要充分，需剪成小塊。2、 固體