大珠母貝CCT-α、CCT-β和CCT-η亞基基因全長cDNA的克隆及其冷應激表達

大珠母貝CCT-α、CCT-β和CCT-η亞基基因全長cDNA的克隆及其冷應激表達大珠母貝是生產(chǎn)大型海水珍珠的重要母貝,對海水溫度的要求嚴格,生活的適溫范圍是25~30℃,不耐低溫,了解大珠母貝對環(huán)境低溫的反應機制有重要意義。本研究首次克隆到大珠母貝冷應激相關基因CCT-α、CCT-β和CCT-η基因cDNA序列全長,并對其在不同組織和急性冷應激下的表達模式進行了分析,以了解大珠母貝的低溫反應機制,也為大珠母貝的耐寒性狀選育工作提供參考。結果如下:1.大珠母貝CCT-α、CCT-β和CCT-η基因cDNA全長克隆和生物信息學分析利用RACE技術首次從大珠母貝中克隆獲得CCT-α、CCT-β和CCT-η基因cDNA全長。CCT-α基因cDNA全長1803bp,開放閱讀框為1608bp,編碼535個氨基酸,在赤道結構域比其他物種少20個氨基酸,具有3個CCT家族蛋白簽名序列:36KSSLGPVGLDKML48、57ITNDGATILKLLEVEHP73、85QDQEVGDGT94,包含三個保守的功能結構域:赤道結構域、頂端結構域和中間結構域,含有9個保守的ATP結合位點分別位于39-41、91、95、137、377、395、434、486和488位氨基酸殘基處,6個蛋白質結合位點分別位于第1-3、256、457-461、463、525、527-535氨基酸殘基處;大珠母貝CCT-α與海蝸牛(Aplysiacalifornica)、斑馬魚(Daniorerio)、人類(Homosapiens)CCT-α推導的氨基酸序列同源性分別為80.7%、77.1%、75.4%。獲得CCT-β基因兩個轉錄本,分別長1829bp和2289bp,含有相同的5’末端非編碼區(qū)105bp,3’末端非編碼區(qū)分別長591bp和131bp,兩個轉錄本開放閱讀框均為1593bp,編碼530個氨基酸,具有3個CCT家族蛋白簽名序列:38KSTLGPKGMDKIL50、58VTNDGATILKSIGIVNP74、86QDDEVGDGT95,包含三個保守的功能結構域:赤道結構域、頂端結構域和中間結構域,含有9個保守的ATP結合位點分別位于42-44、92、96、160、387、405、445、488和490位氨基酸殘基處,含有一個DEADbox基序:377ILDEADRSL385,3個蛋白質結合位點分別位于第1-4、467、526-530氨基酸殘基處;大珠母貝CCT-β與牡蠣(Crassostreagigas)、斑馬魚(Daniorerio)、人類(Homosapiens)CCT-β推導氨基酸序列同源性分別是90.4%、76.8%、75.8%。cct-η基因cdna全長1895bp,開放閱讀框為1895bp,編碼543個氨基酸,cct-η具有3個cct家族蛋白簽名序列:37rttlgprgmdkli49、58isndgatilktldivhp74、86qdaevgdgt94,包含三個保守的功能結構域:赤道結構域、頂端結構域和中間結構域,含有9個保守的atp結合位點分別位于40-42、92、96、161、391、409、449、492和494位氨基酸殘基處,3個蛋白質結合位點分別位于第1-4、250、543氨基酸殘基處;大珠母貝cct-η與牡蠣(crassostreagigas)、海蝸牛(aplysiacalifornica)、斑馬魚(daniorerio)、人類(homosapiens)cct-η推導的氨基酸序列同源性分別是83.2%、81.2%、80.1%、79.3%。2.大珠母貝cct-α、cct-β和cct-η基因組織差異表達分析采用實時熒光定量pcr技術檢測了cct-α、cct-β和cct-η基因mrna在大珠母貝心臟、閉殼肌、外套膜、鰓、肝胰腺、胃、唇瓣、腹足8個組織中的表達情況。研究結果顯示,cct-α、cct-β和cct-η在大珠母貝各組織中均有表達。cct-α基因在鰓、外套膜和閉殼肌表達量較高,胃、腹足和唇瓣中表達量較低,肝胰腺和心臟中表達量最低。cct-β基因在鰓和閉殼肌中表達量亮較高,腹足和唇瓣次之,外套膜、心臟、肝胰腺、胃表達量較低。cct-η基因在閉殼肌中表達量最高,鰓中表達量其次,腹足、外套膜、胃和唇瓣中表達量較低,肝胰腺和心臟中表達量最低。cct-α、cct-β和cct-η在大珠母貝閉殼肌和鰓中均有較高表達,提示三者在閉殼肌和鰓中具有重要的的生理作用;而cct-α在外套膜中有較高表達,提示cct-α在外套膜中具有特別重要的作用。3.冷應激對大珠母貝cct-α、cct-β和cct-η基因表達的影響采用實時熒光定量pcr技術檢測了20℃冷應激條件下24h內cct-α、cct-β和cct-η基因mrna在大珠母貝組織中的表達情況。結果顯示,在低溫應激條件下,三種cct基因表達量均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。cct-α在閉殼肌、肝胰腺、心臟6h時表達量顯著上調,12h時仍保持較高的水平,24h時表達量顯著下降至0h時表達水平;而在鰓和外套膜12h時表達量才顯著升高,24h時表達量顯著下降至0h時表達水平。cct-β在心臟、肝胰腺中在6h時表達量升至最高,12h時仍保持較高的水平,24h時回落至0h時水平,而在閉殼肌、鰓、外套膜12h時表達量顯著升高,24h時表達量顯著下降至0h時表達水平。cct-η在閉殼肌中cct-η基因在冷應激后12h時表達量升至最高,24h時回落至0h時表達水平以下;而在肝胰腺和心臟中cct-η基因在6h時表達量達到峰值,12h時表達量顯著下降,回落至0h時表達水平,24h時表達量維持在此水平。