《植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)踐》校本教材

校本教材

植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)踐

編者序

2016年,全國啟動了新一輪的課程改革,確立了著力發(fā)展學(xué)生

核心素養(yǎng)，落實(shí)立德樹人的總體目標(biāo)。學(xué)生核心素養(yǎng)主要指學(xué)生應(yīng)

具備的，能夠適應(yīng)終身發(fā)展和社會發(fā)展需要的正確價值觀念、必備

品格和關(guān)鍵能力。

改革要求努力培養(yǎng)學(xué)生善于發(fā)現(xiàn)并提出問題，做出合理的分析

與決策；能夠運(yùn)用已有知識技能，設(shè)計(jì)和實(shí)施問題解決方案；具有

獨(dú)立思考和探索精神；能夠進(jìn)行反思和質(zhì)疑；敢于創(chuàng)新，勇于挑戰(zhàn),

能夠提出新穎和有價值的想法并實(shí)施?！吨参锝M織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)踐》

一書的編寫正是順應(yīng)國家改革的大勢所趨。

全書共分為三章，第一章是對植物組織培養(yǎng)技術(shù)概況以及我校

植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的介紹，意在讓學(xué)生了解并大體熟悉植物組織

培養(yǎng)技術(shù)的基本情況。第二章重點(diǎn)剖析了本課程的相關(guān)目標(biāo)、簡介、

實(shí)施和評價情況，旨在告知學(xué)生課程的大體概況。第三章分為10小

節(jié)，詳細(xì)介紹分析植物組織培養(yǎng)技術(shù)的基本操作知識，主要是為參

與課程的學(xué)生提供研究方法和基本思路，為發(fā)揮學(xué)生的創(chuàng)造力做好

鋪墊。

全書遵循“科學(xué)化、素質(zhì)化、流程化”的原則編寫。由于時間

倉促，能力有限，書中難免有疏漏之處，敬請專家、同行不吝賜教。

目錄

第一章簡介

一、植物組織培養(yǎng)技術(shù)簡介..................(1)

二、南安國光中學(xué)植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室簡介….…(3)

第二章課程

一、課程目標(biāo).............................(6)

二、課程簡介.............................(6)

三、課程實(shí)施.............................(7)

四、課程評價.............................(7)

第三章實(shí)踐

第1節(jié)植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)............(8)

第2節(jié)實(shí)驗(yàn)室布置和常用儀器的使用.........(11)

第3節(jié)實(shí)驗(yàn)器具的消毒.....................(19)

第4節(jié)培養(yǎng)基及其配制......................（22）

第5節(jié)外植體的選擇和接種..................（29）

第6節(jié)脫分化培養(yǎng)..........................（33）

第7節(jié)再分化培養(yǎng)..........................（38）

第8節(jié)煉苗................................（41）

第9節(jié)大田種植............................（44）

第10節(jié)常見問題及對策.....................（46）

第一章簡介

一、植物組織培養(yǎng)技術(shù)簡介

（-）植物細(xì)胞的全能性

所謂植物細(xì)胞的全能性，就是指植物的每個細(xì)胞都具有該植物的全部遺傳信息和發(fā)育

成完整植株的能力。

一切植物都是由細(xì)胞和細(xì)胞產(chǎn)物所構(gòu)成的。在植物的生長發(fā)育中，一個受精卵可以發(fā)

育成為具有完整形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的植株，這就是全能性，就是該受精卵具有該物種全部

遺傳信息的表現(xiàn)。同樣，植物的體細(xì)胞是從合子的有絲分裂產(chǎn)生的，也具有全能性，具備

著遺傳信息的傳遞、轉(zhuǎn)錄和翻譯的能力。在一個完整的植株上某部分的體細(xì)胞只表現(xiàn)一定

的形態(tài)，承受一定的功能，這是由于它們受到具體器官或組織所在環(huán)境的束縛，而其遺傳

潛力并沒有喪失。一旦它脫離原來所在的器官或組織，成為離體狀態(tài)，在一定的營養(yǎng)、激

素和外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性而生長發(fā)育成完整的植株。

（二）植物組織培養(yǎng)的概念

植物組織培養(yǎng)一一是指通過無菌操作，把植物的外植體接種于人工配置的培養(yǎng)基上，

在人工控制的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其成為完整植株的方法。（如圖）

一^根、芽

一愈傷組織一芽一根U

I―^根一?芽一

外植體狀

一胚狀體-------------a

一根、芽------------k苗

外植體一一是指用于植物組織培養(yǎng)的接種材料，它包括植物體的各個器官、組織、細(xì)

胞和原生質(zhì)體等。

從理論上說，所有的植物細(xì)胞與組織材料都能培養(yǎng)成功。但實(shí)際上接種的外植體不同,

培養(yǎng)的難易程度也不同。

（三）植物組織培養(yǎng)的類型

I根據(jù)接種的外植體不同分為五類。

1.胚胎培養(yǎng)一一指把原胚或成熟胚、胚乳、胚珠或子房分離出來，在人工合成的培養(yǎng)

基上培養(yǎng)，使其成為正常的植株。

2.器官培養(yǎng)一一指分離莖尖、莖段、根尖、根、葉片、葉原基、子葉、花瓣、花藥或

1

花粉、果實(shí)等作為外植體，在人工合成的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整的植株。

3.組織培養(yǎng)一一指分離植物體的各部分組織，如分生組織、形成層組織或其它組織來

進(jìn)行培養(yǎng)，或采用從植物器官培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織來培養(yǎng)，通過分化誘導(dǎo)再生最后形成植

株。這是狹義的組織培養(yǎng)。

4.細(xì)胞培養(yǎng)一一包括單細(xì)胞、多細(xì)胞或懸浮細(xì)胞和細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)等。

5.原生質(zhì)體培養(yǎng)一一包括原生質(zhì)體、原生質(zhì)融合體和原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)等。

II根據(jù)培養(yǎng)的過程分：

1.初代培養(yǎng)（第一代培養(yǎng)）：指將從植物體上分離下來外植體作第一次培養(yǎng)。

2.繼代培養(yǎng):指第一次培養(yǎng)以后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

IH根據(jù)培養(yǎng)基態(tài)相不同分：

1.固體培養(yǎng)一一指在培養(yǎng)基中加凝固劑（多為瓊脂）的組織培養(yǎng)。

2.液體培養(yǎng)一一指在培養(yǎng)基中不加凝固劑的組織培養(yǎng)。

（四）植物組織培養(yǎng)的前景

植物組織培養(yǎng)能夠在很短的時間內(nèi)由一個外植體（外植體包括莖尖、根、莖、葉、花

器官或一個細(xì)胞等材料）繁殖出比常規(guī)繁殖多幾百倍甚至上萬倍的與母體遺傳性狀相同而

更健康的小植株，其標(biāo)準(zhǔn)可達(dá)到大田生產(chǎn)種苗的要求。因此，植物組織培養(yǎng)是當(dāng)前生物工

程中應(yīng)用最廣泛、最有效的技術(shù)和方法，在園藝農(nóng)林、藥用植物生產(chǎn)等方面得到廣泛的應(yīng)

用。必將給整個農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)帶來革命性的深遠(yuǎn)影響。

隨著植物組織培養(yǎng)基礎(chǔ)理論研究的深入，發(fā)展更為迅速，應(yīng)用范圍也越來越廣，它在

細(xì)胞學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)、藥物學(xué)以及農(nóng)

學(xué)、園藝、林學(xué)等學(xué)科上具有重要作用。眾所周知，植物的各種器官、組織和細(xì)胞，在正

常情況下是受各種組織、細(xì)胞的相互制約、相互作用和相互影響的。因此，如果以完整的

植物體來研究器官的發(fā)生、形態(tài)建成的機(jī)理、影響器官發(fā)生的因素以及生理生化上的變化

等問題是極其困難的，并有極大的局限性。而植物克隆可以克服上述不足，這是因?yàn)椋阂?/p>

方面植物材料是離體的，它能夠減少組織和細(xì)胞間的相互干擾；另一方面，在植物克隆中

幾乎所有條件都是人為控制的，影響組織和細(xì)胞活動的環(huán)境因素在一定程度上是可預(yù)知的,

從而更有利于對器官、組織和細(xì)胞變化規(guī)律的研究，也彌補(bǔ)了在自然條件下利用植物體進(jìn)

行研究的缺陷，因此植物克隆在生物學(xué)的研究中占有越來越重要的位置。

植物組織培養(yǎng)快速繁殖不僅可用于常規(guī)無性繁殖的植物，而且還用于常規(guī)方法難以繁

殖的植物，例如有性雜交不親和與不育基因型植物的繁殖。在轉(zhuǎn)基因植物的快速繁殖，以

及繁殖大批遺傳性狀一致的親本供大規(guī)模雜交制種，大量繁殖果樹、花卉、蔬菜、作物、

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藥材等種苗，尤其在搶救與繁殖珍、稀、瀕危植物等方面效果更佳。植物克隆技術(shù)因其環(huán)

境因素可人工控制，繁殖周期短、速度快、效率高，可周年生產(chǎn)，節(jié)省材料，脫去病毒，

提高優(yōu)良性狀等優(yōu)勢，在植物優(yōu)良品種的快速繁殖及推廣方面取得了巨大的成功。植物組

織培養(yǎng)已廣泛的應(yīng)用于林果、花卉、蔬菜、作物、藥材等產(chǎn)業(yè)，徹底改變了傳統(tǒng)的苗木、

花卉生產(chǎn)繁殖靠種子、桿插、嫁接等方法，能夠迅速推廣名、特、新、優(yōu)品種，極大地滿

足國內(nèi)外大市場對高產(chǎn)量、高效率、高品質(zhì)的消費(fèi)需求。

二、南安國光中學(xué)植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室簡介

南安國光中學(xué)植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建于2010年,建筑面積約130平方米，較大型儀

器設(shè)備總數(shù)40余臺，價值50余萬元。實(shí)驗(yàn)室涵蓋了制備區(qū)、緩沖區(qū)、細(xì)胞工程操作室、無

菌操作室、組織培養(yǎng)室五大功能分區(qū)。

(-)常用儀器設(shè)備

電3A年(A)

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世凈工作臺（二）

4

抵電肱人工氣候箱

（二）實(shí)驗(yàn)室發(fā)展情況

目前，根據(jù)福建省多樣化辦學(xué)的相關(guān)指導(dǎo)思想,

在學(xué)校的大力支持下，由生物教研組主導(dǎo)，面向全

校學(xué)生開設(shè)了相關(guān)的研究性學(xué)習(xí)課程和校本課程，

重點(diǎn)開展了包括胡蘿卜、金線蓮、石竹、玫瑰在內(nèi)

的多種植物的組織培養(yǎng)，并獲得了成功。

新時期，為進(jìn)一步落實(shí)《課程標(biāo)準(zhǔn)（2017版）》

中關(guān)于“科學(xué)探究”、“社會責(zé)任”等核心素養(yǎng)，

實(shí)驗(yàn)室將探索更多培養(yǎng)途徑、培養(yǎng)材料，與發(fā)展學(xué)

生素養(yǎng)接軌、與生活接軌、與市場接軌。

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第二章課程

一、課程目標(biāo)

我國對基礎(chǔ)教育高中階段培養(yǎng)目標(biāo)的界定是：高中教育在義務(wù)教育的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提

高學(xué)生思想道德素質(zhì)、科學(xué)文化素質(zhì)、身體心理素質(zhì)，并且使學(xué)生的個性得到健康的發(fā)展，

為培養(yǎng)社會主義建設(shè)者和接班人奠定良好的基礎(chǔ)。其中，德育方面要求具有為國家富強(qiáng)和

人民富裕而艱苦奮斗的獻(xiàn)身精神，樹立辯證唯物主義和歷史唯物主義的觀點(diǎn)；智育方面則

要求要發(fā)展學(xué)生的志趣、特長，培養(yǎng)學(xué)生具有不斷追求新知識的熱忱以及自學(xué)能力和分析

問題、解決問題的能力，具有實(shí)事求是、獨(dú)立思考、勇于創(chuàng)造的科學(xué)精神；在勞動技術(shù)教

育方面要求使學(xué)生具有勞動觀點(diǎn)、勞動習(xí)慣和學(xué)習(xí)生產(chǎn)技術(shù)的興趣，掌握現(xiàn)代生產(chǎn)技術(shù)的

一些基礎(chǔ)知識和基本技能，學(xué)會使用一般的生產(chǎn)工具，掌握組織生產(chǎn)和管理生產(chǎn)的初步知

識和技能。

同時，我校以“光前精神”立校，辦學(xué)思想是“手腦并用、文理并重、和諧發(fā)展”，

學(xué)校的課程目標(biāo)緊密圍繞“光前精神”，努力培養(yǎng)德、智、體、美和諧發(fā)展的新時代中學(xué)

生，尤其注重學(xué)習(xí)與實(shí)踐相結(jié)合。

《植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)踐》的校本課程是基于以上國家課程目標(biāo)，同時結(jié)合學(xué)校的課

程目標(biāo)開展實(shí)施。該校本課程的具體課程目標(biāo)主要有：

1.豐富學(xué)生的學(xué)習(xí)內(nèi)容，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

2.使學(xué)生初步具有愛科學(xué)、學(xué)科學(xué)、用科學(xué)的思想和科學(xué)致富的意識。

3.深化生物學(xué)核心素養(yǎng)，培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)探究、科學(xué)思維能力。

4.了解社會需求，嘗試將理論知識用于實(shí)踐；真正做到教學(xué)過程重實(shí)踐，深化STEAM

教育對學(xué)生的影響。

5.在實(shí)踐中逐步培養(yǎng)自主探究、發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的良好意識和克服困難的意志品

質(zhì)。

二、課程簡介

《植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)踐》的校本課程通過借助植物細(xì)胞的全能性，利用國光中學(xué)植

物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，重點(diǎn)開展常見植物的組織培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室大批量培養(yǎng)種苗的目的。

同時嘗試開展經(jīng)濟(jì)種苗的育苗實(shí)驗(yàn)，比如多彩多肉植物的植物組織培養(yǎng)，一定程度上實(shí)現(xiàn)

經(jīng)濟(jì)效益。

課程主要內(nèi)容包括：相關(guān)理論學(xué)習(xí)一配制培養(yǎng)基與滅菌一脫分化接種和培養(yǎng)一再分化

接種與培養(yǎng)一植株馴化煉苗一種植。

三、課程實(shí)施

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1.開展形式：以8人左右的研究小組為單位開展本課程，設(shè)立小組長，實(shí)行教師引導(dǎo)、

小組長領(lǐng)導(dǎo)負(fù)責(zé)制，組員分工合作，共同提高。

2.課時計(jì)劃：按照學(xué)校課表安排的校本課程和研究性學(xué)習(xí)的時間，以及周末的時間進(jìn)

行。

3.教學(xué)場地：國光中學(xué)植物工程實(shí)驗(yàn)室和多媒體教室。

4.課程設(shè)備：相關(guān)多媒體教學(xué)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)藥品、實(shí)驗(yàn)耗材等。

四、課程評價

（-）學(xué)校評價

1.校本課程評價領(lǐng)導(dǎo)小組檢查評價。

2.定期組織教研組評價教學(xué)。

（-）教師評價

1.教師教學(xué)有計(jì)劃、有安排、有考勤。

2.教師保存實(shí)驗(yàn)室使用記錄、課程實(shí)施照片、課程實(shí)施過程記錄、課程成果照片等。

（三）學(xué)生評價

1.側(cè)重態(tài)度、創(chuàng)新能力和操作技能，多進(jìn)行分析性評價；以檔案袋、成績冊、記分等

方式對每位學(xué)生的表現(xiàn)簡單記錄，作為評價依據(jù)。

2.學(xué)生通過小組合作，進(jìn)行培養(yǎng)成果展示、評比。

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第三章實(shí)踐

第1節(jié)植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)

（-）教學(xué)目標(biāo)

1.簡述細(xì)胞全能性的概念；簡述植物組織培養(yǎng)的過程和方法。

2.在質(zhì)疑、探究的學(xué)習(xí)過程中，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考，推理判斷和創(chuàng)造性思維能力；通

過聯(lián)系農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，培養(yǎng)學(xué)生活學(xué)活用，理論聯(lián)系實(shí)際的能力

3.了解植物組織培養(yǎng)的類型、發(fā)展歷程及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

（二）教學(xué)重點(diǎn)

掌握植物組織培養(yǎng)的基本原理和基本過程

（三）教學(xué)過程

3.1情景導(dǎo)入、展示目標(biāo)

顯示本地菊花展圖片，引入新課。

多媒體展示：科學(xué)家利用菊花的花瓣培育出的菊花植株，并讓學(xué)生思考：

①為什么植物的一個花瓣就可以培育出完整的植株呢？

②為什么花瓣細(xì)胞在植物體內(nèi)沒有表現(xiàn)出全能性呢？

閱讀思考33-34,課件展示問題，全面理解細(xì)胞的全能性。

1.植物組織培養(yǎng)的原理是什么？

2.什么是細(xì)胞的全能性？

3.全能性大小比較

4.為什么體內(nèi)細(xì)胞沒有表現(xiàn)出全能性，而是分化成為不同的組織、器官？

3.2合作探究、精講點(diǎn)撥

【問題探究】

1.什么是植物組織培養(yǎng)？

2.植物細(xì)胞全能性的探索歷程

3.觀看視頻菊花組織培養(yǎng)

4.簡述植物組織培養(yǎng)的大體過程？

5.討論組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中需要控制哪些條件？

為什么要強(qiáng)調(diào)無菌操作？如何避免雜菌污染？

6.分析培養(yǎng)基主要成分是什么？

3.3分析

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指導(dǎo)學(xué)生閱讀教材相關(guān)內(nèi)容，并解答思考與討論:

3.3.1植物組織培養(yǎng)的基本過程

引導(dǎo)學(xué)生理解相關(guān)核心概念：愈傷組織、胚狀體、脫分化、再分化等。

脫分化：讓已經(jīng)分化的細(xì)胞，經(jīng)過誘導(dǎo)后，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變?yōu)槲捶只?xì)胞

的過程，又稱去分化。

實(shí)質(zhì)：是恢復(fù)細(xì)胞的全能性過程；結(jié)果：形成愈傷組織。

再分化：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織在培養(yǎng)過程中重新分化成根或芽等器官的過程。

愈傷組織：一種高度液泡化，由無定形狀態(tài)薄壁細(xì)胞組成的排列疏松無規(guī)則的組織

3.3.2回答思考討論、解答資料分析：

在本實(shí)驗(yàn)中，切取胡蘿卜塊時強(qiáng)調(diào)要切取含有形成層的部分，原因是什么？胡蘿卜的其他

部分是否也能培育成小植株？

次氯酸鈉、無菌水、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、消毒用棉球都意味組織培養(yǎng)過程全程滅菌,

為什么要強(qiáng)調(diào)所用器械的滅菌和實(shí)驗(yàn)人員的無菌操作？

資料一和資料二，你能得出什么結(jié)論？離體；含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基；無菌環(huán)境；一

定的溫度、空氣、適合的pH、適時光照等。

3.3.3概念

在無菌和人工控制條件下，將離體的植物組織、器官、細(xì)胞，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)

基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織、叢芽，最終形成完整的植株。

3.3.4分析：菊花的植物組織培養(yǎng)

營養(yǎng)：常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg,微量元

素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Cl、Ni、I、Co,有機(jī)物有甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、

蔗糖等。

激素：在培養(yǎng)基中需要添加生長素和細(xì)胞分裂素等植物激素，其濃度、使用的先后順序、

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用量的比例等都影響結(jié)果。

使用順序?qū)嶒?yàn)結(jié)果生長素/細(xì)胞分裂素比值與結(jié)果

先生長素，促進(jìn)根分化，

有利于分裂但不分化比值高時

后細(xì)胞分裂素抑制芽形成

先細(xì)胞分裂素，促進(jìn)芽分化，

細(xì)胞既分裂也分化比值低時

后生長素抑制根形成

同時使用分化頻率提高比值適中促進(jìn)愈傷組織生長

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)、器官分化及植株再生具有重要的作用，是培養(yǎng)基

中的關(guān)鍵物質(zhì)。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有生長素和細(xì)胞分裂素。

①生長素它作為組織培養(yǎng)中外源激素的重要來源，對外植體的生長是十分重要的。常用

的生長素有口引咪乙酸（IAA）、n引珠丁酸（IBA）、蔡乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）

等。

IAA的活力較低，可能是最弱的激素，對器官形成的副作用小。高溫高壓時易被細(xì)胞

中的IAA分解酶降解，遇光也易分解。

NAA在組織培養(yǎng)中的起動能力要比IAA高3.7倍，且由于它可人工大量生產(chǎn)，在高溫

高壓下也比較穩(wěn)定，不易被破壞、分解，所以在組織培養(yǎng)中使用十分廣泛。

2,4-D在組織培養(yǎng)中的起動能力要比IAA高10倍以上，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上

活力最高，但它強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。

生長素對發(fā)根有作用，對愈傷組織的產(chǎn)生和再分化有誘導(dǎo)作用，還能促進(jìn)細(xì)胞的分裂、

分化和新陳代謝。

②細(xì)胞分裂素常用的有玉米素（ZT）、6-茉基腺喋吟（6-BA）、激動素（KT）。細(xì)胞分

裂素不僅能促進(jìn)細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)大，解除頂端優(yōu)勢，促進(jìn)側(cè)芽生長，而且還有減少

葉綠素的分解，延緩葉片衰老的作用。但是，細(xì)胞分裂素對根的生長一般起抑制作用。

注意：通常當(dāng)生長素/細(xì)胞分裂素的比例高時有利于生根；生長素/細(xì)胞分裂素的

比例低時則有利于產(chǎn)生芽；若兩者濃度相當(dāng)時，既不利于生根，也不利于生芽，愈傷組織

的產(chǎn)生則占優(yōu)勢。關(guān)于激素控制器官形成的這一模式，在許多植物組織培養(yǎng)中得到了驗(yàn)證。

但在一些情況下，不是生長素/細(xì)胞分裂素的比值決定器官的發(fā)生，而是絕對濃度。止匕外,

赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）等也在組織培養(yǎng)中不同程度地發(fā)揮作用。因此，究竟采用哪

些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，采用什么樣的細(xì)胞分裂素與生長素比例，要根據(jù)培養(yǎng)的目的、植物的種

類和細(xì)胞分裂素與生長素的種類而定。

環(huán)境條件：pH、溫度、光等環(huán)境條件。菊花組培所需pH為5.8,溫度為18-22C,光

照條件為每日用日光燈照射12小時。

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第2節(jié)實(shí)驗(yàn)室布置和常用儀器的使用

（-）教學(xué)目標(biāo)

1.理解實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)意圖并熟悉各個功能區(qū)；

2.了解植物組織培養(yǎng)常用設(shè)備和器材；

3.掌握實(shí)驗(yàn)用具的清洗方法；

（二）教學(xué)重點(diǎn)

了解植物組織培養(yǎng)常用設(shè)備和器材的作用。

（三）教學(xué)過程

3.1植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。

分為：準(zhǔn)備室、緩沖區(qū)、接種室、培養(yǎng)室、溫室。

3.1.1準(zhǔn)備室

在準(zhǔn)備室主要進(jìn)行一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作，如各種藥品的儲備，稱量，器皿洗滌，培養(yǎng)基

配制，培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿的滅菌，培養(yǎng)材料的預(yù)處理等。為了方便管理還可以將準(zhǔn)備室進(jìn)

行適當(dāng)?shù)姆謪^(qū)，如劃分為藥瓶儲藏區(qū)，洗滌區(qū)，培養(yǎng)基配制區(qū)及滅菌區(qū)等。

①藥品儲藏區(qū)

主要用于存放各種化學(xué)藥品，要求室內(nèi)干燥、通風(fēng)、避光、應(yīng)配制、備藥品柜、冰箱

等。各類化學(xué)試劑應(yīng)按要求分類存放，需要低溫保存的藥劑應(yīng)置于冰箱內(nèi)保存，有毒藥品

應(yīng)按規(guī)定存放和管理。

②洗滌區(qū)

用于玻璃器皿、用具及實(shí)驗(yàn)用具的洗滌、干燥和存放；培養(yǎng)材料的預(yù)處理與清洗：組

培苗的出瓶、清洗與整理等。要求有電源、自來水和水槽，上下水道暢通，排水良好，地

面耐濕、防滑，便于清潔。應(yīng)配備工作臺、烘箱、曬瓶架、周轉(zhuǎn)筐、毛刷等。多個水槽并

排，方便多道清洗程序的順利進(jìn)行。

③培養(yǎng)基配制區(qū)

用于培養(yǎng)基的配制，還可以分為稱重分區(qū)和配制分區(qū)。藥品稱量需配制各種規(guī)格的天

平，包括普通天平和分析天平。培養(yǎng)基配制需要配備工作臺、蒸儲水器、電磁爐、水浴鍋、

磁力攪拌器、過濾裝置、酸度計(jì)（或pH試紙）、分注器、各種試管、三角瓶、燒杯、量筒、

吸管、移液槍及移液槍架以及貯藏母液的冰箱、移動式載物臺（醫(yī)用小推車）等。

④滅菌區(qū)

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用于培養(yǎng)基、器皿、用具、及其它物品的滅菌。滅菌區(qū)根據(jù)工作量的大小決定其面積

的大小。要求、通風(fēng)、明亮，墻壁和地面應(yīng)防潮、耐高溫。應(yīng)配置高壓電源和排水設(shè)施、

高壓蒸汽滅菌裝置、干熱消毒柜或烘箱、細(xì)菌過濾裝置及移動式載物臺、周轉(zhuǎn)筐等。

準(zhǔn)備室也可設(shè)計(jì)成大的通間，使試驗(yàn)操作的各個環(huán)節(jié)在同一房間按程序完成，以便于

程序化操作與管理，從而提高工作效率。此外還便于培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌的自動化

操作程序設(shè)計(jì)，更便于無菌操作體系的建立。

3.1.2無菌操作室（接種室）

無菌操作室也叫接種室，主要用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的繼代轉(zhuǎn)接等無菌

操作。由于植物組織培養(yǎng)時間較長，尤其需要防止細(xì)菌、真菌污染。因此，接種室內(nèi)無菌

條件控制的好壞直接影響培養(yǎng)物的污染率及接種工作效率等重要指標(biāo)。接種室面積根據(jù)需

要和環(huán)境控制的難易程度而定，在工作方便的前提下易小不宜大。室內(nèi)地面、墻面、天花

板應(yīng)采用防水或耐腐蝕材料，符合無塵積累要求，易于清潔和消毒；門窗要求密閉性好，

一般用滑動門窗，不能安裝風(fēng)扇，通風(fēng)換氣需通過空氣調(diào)節(jié)裝置進(jìn)行。

接種室應(yīng)定期用70%酒精或0.5%苯酚噴霧降塵和消毒，用2%新潔爾滅抹拭臺面和用具

（70%酒精也可），用福爾馬林（40%甲醛）加少量鉀定期密閉熏蒸，配合紫外線滅菌燈（每

次開啟15分鐘以上）等消毒滅菌手段，以使無菌室經(jīng)常保持度的無菌狀。接種箱內(nèi)部也應(yīng)

裝有紫外線燈，使用前開燈15分鐘以上照射滅菌，但凡是照射不到之處仍是有菌的。在紫

外線燈開啟時間較長時，可激發(fā)空氣中的氧分子締合成臭氧分子，這種氣分有很強(qiáng)的殺菌

作用，可以對紫外線沒有直接照到的角落產(chǎn)生滅菌效果。由于臭氧有礙健康，在進(jìn)入操作

之前應(yīng)先掉紫外線燈，后十多分鐘即可入內(nèi)。

接種室外還應(yīng)設(shè)置預(yù)備室作為緩沖間，一方面可供操作人員更換工作服、工作帽、拖

鞋及器皿準(zhǔn)備、培養(yǎng)材料處理等，另一方面可減少工作人員將外界塵埃、雜菌等污染物直

接帶入接種室內(nèi)。緩沖間與接種室之間最好安裝塑鋼玻璃及滑動門，以便于觀察；而且緩

沖間與接種室的門應(yīng)該錯開，也不得同時開啟，以防止在工作人員進(jìn)出時空氣對流帶入雜

菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)配備鞋架和衣帽掛鉤，并備有清潔的工作服、工作帽、口罩及拖鞋；墻頂

應(yīng)安裝1?2盞紫外燈，定時照射殺菌。

3.1.3培養(yǎng)室

用于對接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物離體材料進(jìn)行控制條件下的培養(yǎng)。培養(yǎng)室內(nèi)放置

培養(yǎng)架，方便操作，并充分利用空間。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模和培養(yǎng)架的大小、數(shù)

目及其他附屬設(shè)備而定，其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則?？刹扇《嗍以O(shè)計(jì)方式,

每個培養(yǎng)室面積不宜過大，約10-20m2,以滿足不同培養(yǎng)材料對環(huán)境條件控制的不同要求,

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也便于對同室內(nèi)環(huán)境條件的均勻控制。室內(nèi)天花板和內(nèi)墻最好用塑鋼板或瓷磚裝修，地面

鋪設(shè)水模式或瓷磚，以保持室內(nèi)明亮、平整，并方便清潔和消毒；室內(nèi)還要安裝紫外燈，

定時進(jìn)行殺菌處理。培養(yǎng)室內(nèi)需要安裝空調(diào)，以控制室內(nèi)溫度，一般要求保持在20?27℃

之間，低于15℃或高于35℃對植物的生長不利。培養(yǎng)室的光源一般使用白色日光燈，光周

期可采用自動定時器來控制，光照強(qiáng)度一般控制為1000~60001X,每天光照時間薇10~

16h?需要大量的暗培養(yǎng)時可以增設(shè)暗培養(yǎng)室，或使用暗箱培養(yǎng)。培養(yǎng)室內(nèi)的相對濕度保持

在70%?80%為宜。濕度過高，容易使培養(yǎng)材料受到污染；濕度過低，容易使培養(yǎng)基失水

變硬，影響培養(yǎng)物生長。在梅雨季節(jié)可使用除濕機(jī)人工除濕，干燥季節(jié)可利用加濕器來增

加濕度，也可采取放置水盆的方法來調(diào)節(jié)濕度。

3.1.4溫室

組培試管苗在進(jìn)入大田栽培之前，必須經(jīng)過一段時間的煉苗，即馴化移栽過程，使其

逐漸適應(yīng)自然條件。北方（長江以北）通常建造日光溫室，而南方通常建造連棟溫室大棚

進(jìn)行試管苗的馴化移栽。

3.2設(shè)備和器材

設(shè)備：超凈工作臺、自動高壓濕熱滅菌鍋、烘干箱、冰箱、空調(diào)、電磁爐、鍋、全自

動純凈水機(jī)、稱量天平

器材：剪刀、解剖刀、鑲子、鐵架、移液槍、濾紙、pH試紙、燒杯、量筒、培養(yǎng)皿、

培養(yǎng)瓶、玻璃棒、試管刷、酒精燈、橡皮筋、報(bào)紙

試劑：清水、氯化汞溶液或次氯酸鈉溶液、酒精

3.3常用儀器的使用及注意事項(xiàng)

3.3.1分析天平

⑴介紹：精確度達(dá)0.0001g,用于稱量微量元素、植物生長調(diào)節(jié)劑和一些高精確度的試驗(yàn)

品。

⑵使用方法：

①將天平置于穩(wěn)定的工作臺上避免振動、氣流及陽光照射。

②在使用前調(diào)整水平儀氣泡至中間位置。

③電子天平應(yīng)按說明書的要求進(jìn)行預(yù)熱。

④稱量易揮發(fā)和具有腐蝕性的物品時，要盛放在密閉的容器中，以免腐蝕和損壞電子天平。

⑤經(jīng)常對電子天平進(jìn)行自校或定期外校，保證其處于最佳狀態(tài)。

⑥如果電子天平出現(xiàn)故障應(yīng)及時檢修，不可帶“病”工作。

⑦操作天平不可過載使用以免損壞天平。

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⑧若長期不用電子天平時應(yīng)暫時收藏為好。

⑶注意事項(xiàng)：

第一，電子天平的心臟一重力電磁傳感器簧片（一般共有六一八片）細(xì)而薄，極易受

損，且天平的精度越高，其重力傳感簧片也越薄，所以在使用中應(yīng)特別注意加以保護(hù)，不

要向天平上加載重量超過其稱量范圍的物體，絕不能用手壓稱盤或使天平跌落地下，以免

損壞天平或使重力傳感器的性能發(fā)生變化，另外稱量一個物體以特別是較重的物體）一

般不要超過30秒鐘搬動和運(yùn)輸時應(yīng)將稱盤及其托盤取下來。

第二，電子天平實(shí)際上是測量地球?qū)Τㄔ诜Q盤上的物體的引力即重力的儀器，而由于

地球徑緯度的不同，各地的重力加速度（9-9.8m2/s）并不相同，在使用當(dāng)?shù)仄浞Q量準(zhǔn)確度

取決于是否進(jìn)行了正確的校正和校正砧碼的精度，假如您發(fā)現(xiàn)在廣州經(jīng)校正好的天平，在

當(dāng)?shù)胤Q重有一定誤差，這并不表示天平有任何故障請按各型號電子天平說明書介紹的方法

用計(jì)量部門認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)砧碼進(jìn)行校正即可進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。

第三，電子天平是一臺對環(huán)境高度敏感的精密電子測量儀器，使用時應(yīng)小心操作，安

裝臺面應(yīng)無明顯振動，不要敞在空調(diào)口，若這些條件不能滿足，應(yīng)采取一些改進(jìn)措施如變

更使用地點(diǎn)裝上防風(fēng)罩等同時注意要調(diào)整底角螺絲使水平指示器的氣泡居中。天平未調(diào)好

水平也是產(chǎn)生稱量誤差的原因之一。

3.3.2超凈工作臺

⑴介紹：超凈工作臺原理是在特定的空間內(nèi)，室內(nèi)空氣經(jīng)預(yù)過濾器初濾，由小型離心風(fēng)機(jī)

壓入靜壓箱，再經(jīng)空氣高效過濾器二級過濾，從空氣高效過濾器出風(fēng)面吹出的潔凈氣流具

有一定的均勻的斷面風(fēng)速，可以排除工作區(qū)原來的空氣，將塵埃顆粒和生物顆粒帶走，以

形成無菌的高潔凈的工作環(huán)境。

⑵使用方法：①接通電源。打開整個超凈工作臺的總開關(guān)后，可以看到按鈕面板個電源指

示燈亮，表示電源處于接通狀態(tài)。（通常，實(shí)驗(yàn)室的超凈工作臺總電源開關(guān)一直是處于打開

狀態(tài)）。②清理臺面，拉下防塵玻璃擋板，紫外殺菌。若超凈工作臺內(nèi)堆放有與本實(shí)驗(yàn)無關(guān)

的物品，可先移出，用酒精棉球清潔臺面后可預(yù)先放入實(shí)驗(yàn)相關(guān)的且能以紫外照射的材料

進(jìn)行紫外滅菌。拉下工作臺前面的玻璃擋板，并關(guān)嚴(yán)。找到按鍵板，開啟紫外燈管（再次按

下該按鈕則會閉紫外燈）進(jìn)行殺菌，一般照射30min即可。【注意】可將操作臺面大致分為

廢物回收區(qū)、物品放置區(qū)和操作區(qū)。操作區(qū)內(nèi)盡量不要堆放物品；不要在殺菌的同時開啟

風(fēng)機(jī)。③開啟風(fēng)機(jī)和照明系統(tǒng)，開始實(shí)驗(yàn)。紫外殺菌結(jié)束前應(yīng)先開啟風(fēng)機(jī)，再關(guān)閉紫外燈,

最后掀起玻璃擋板開始實(shí)驗(yàn)。使用時可多次按下“風(fēng)量調(diào)節(jié)”按鈕選擇需要的風(fēng)速大小。

按動風(fēng)量調(diào)節(jié)按鈕后，風(fēng)速的變化為：“低一高一低”的不斷循環(huán)，并且有相應(yīng)的燈指示

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風(fēng)量狀態(tài)。④結(jié)束試驗(yàn)，清理臺面，關(guān)閉風(fēng)機(jī)，拉下防塵玻璃擋板。試驗(yàn)后，清理臺面廢

棄物后，用酒精棉球擦拭臺面。關(guān)閉風(fēng)機(jī)后拉下防塵玻璃擋板。若下面還有試驗(yàn)，可打開

紫外燈，為接下來再次使用做好準(zhǔn)備。

⑶注意事項(xiàng)：

①試驗(yàn)操作時候盡量避免快速且大幅度移動，以減少對超凈工作臺內(nèi)氣流的擾亂，避

免外界細(xì)菌進(jìn)入。

②超凈臺進(jìn)風(fēng)口在背面或正面的下方，金屬網(wǎng)罩內(nèi)有一普通泡沫塑料片或無紡布，用

以阻攔大顆粒塵埃，應(yīng)常檢查、拆洗，如發(fā)泡沫塑料老化，及時更換。除進(jìn)風(fēng)口以外，如

有漏氣孔隙，應(yīng)當(dāng)堵嚴(yán)，如貼膠布，塞棉花，貼膠水紙等。工作臺正面的金屬網(wǎng)罩內(nèi)是超

級濾清器，超級濾清器也可更換，如使用年久，塵粒堵塞，風(fēng)速減小，不能保證無菌操作

時，則可換上新的。

③超凈臺使用壽命的長短與空氣的潔凈度有。在溫帶地區(qū)超凈臺可在一般實(shí)驗(yàn)室使用，

然而在熱帶或亞熱帶地區(qū)，由大氣中含有量的花粉，或多粉塵的地區(qū)，超凈臺則宜放在較

好的有雙道門的室內(nèi)使用。任何情況下不應(yīng)將超凈臺的進(jìn)風(fēng)罩對著開敞的門或窗，以免影

響濾清器的使用壽命。

④超凈臺由三相電機(jī)作鼓風(fēng)動力，功率145?260W左右，將空氣通過由特的微孔泡沫

塑料片層疊合組的“超級濾清器”后吹送出來，形成連續(xù)不斷的無塵無菌的超凈空氣層流,

即所謂“有效的特殊空氣”，它除去了大于0.3um的塵埃、真菌和細(xì)菌抱子等等。超凈

空氣的流速為24?30m/min,這已足夠防止附近空氣可能襲擾而引起的污染，這樣的流速

也不會妨礙采用酒精燈對器械等的灼燒消毒。工作人員就在這樣的無菌條件下操作，保持

無菌材料在轉(zhuǎn)移接種過中不受污染。但是萬一操作中途遇到停電，暴露在未過濾空氣中的

材料便難以幸免污染。這時應(yīng)迅速結(jié)束工作，并在瓶上作出記號，內(nèi)中的材料如處增殖階

段，則以后不再用作增殖而轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)。如為一般性生產(chǎn)材料，也可棄去。如生根過，

則可留待以后種植用。

3.3.3移液槍的使用

⑴樣品準(zhǔn)備

樣品提前從冰箱拿出室溫放置，使溫度與室溫平衡。

令液體溫度＞吸頭的移取的液體體積會偏大

令液體溫度V吸頭的移取的液體體積會偏小

若溶劑瓶中液體太少，請到入EP管（微量離心管）中，方便吸取。

⑵設(shè)定體積

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令大體積f小體積逆時針

令小體積f大體積順時針超過設(shè)定刻度，再回調(diào)。保證最佳的精確度。

⑶裝槍頭

令將移液槍端垂直插入吸頭，左右微微轉(zhuǎn)動，上緊即可

（4）吸液

①垂直吸液，槍頭尖端需浸入液面2-4mm以下。

②槍頭預(yù)潤濕（3次）

令吸頭內(nèi)壁會吸附一層液體，使表面吸附達(dá)到飽和，然后再吸入樣液，最后打出液體

的體積會很精確。

令一是前進(jìn)移液法（一般液體），正向吸液（一檔一二檔）用大拇指將按鈕按下至

第一停點(diǎn)，然后慢慢松開按鈕回原點(diǎn)。接著將按鈕按至第一停點(diǎn)排出液體，稍停片刻

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繼續(xù)按按鈕至第二停點(diǎn)吹出殘余的液體。最后松開按鈕。

令二是反向移液法（二檔f一檔）。此法一般用于轉(zhuǎn)移高粘液體、生物活性液體、

易起泡液體或極微量的液體，其原理就是先吸入多于設(shè)置量程的液體，轉(zhuǎn)移液體的時候不

用吹出殘余的液體。先按下按鈕至第二停點(diǎn)，慢慢松開按鈕至原點(diǎn)。接著將按鈕按至第一

停點(diǎn)排出設(shè)置好量程的液體，繼續(xù)保持按住按鈕位于第一停點(diǎn)（千萬別再往下按），取下

有殘留液體的槍頭，棄之。

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③慢吸慢放，控制好彈簧的伸縮速度。

令吸液速度太快會產(chǎn)生反沖和氣泡，導(dǎo)致移液體積不準(zhǔn)確。

④將移液槍提離液面，停約一秒鐘。

令觀察是否有液滴緩慢的流出。若有流出，說明有漏氣現(xiàn)象。

令原因：1、移液槍內(nèi)部氣密性不好。

令2、槍頭未上緊，槍頭是否匹配。

令3、彈簧活塞是否正常。

令4、如果是易揮發(fā)的液體（許多有機(jī)溶劑都如此），則可能是飽和蒸汽壓的問

題?？梢韵任艓状我后w，然后再移液。

⑤外壁

令用濾紙蘸擦移液嘴外面附著的液滴

⑥放液

將吸嘴口貼到容器內(nèi)壁并保持10-40°傾斜。

平穩(wěn)地把按鈕壓到一檔，停約一秒鐘后壓到二檔，排出剩余液體。

排放致密或粘稠液體時，壓到一檔后，多等一兩秒鐘，再壓到二檔。

壓住按鈕，同時提起移液槍，使吸嘴貼容器壁擦過。

松開按鈕。

按彈射器除去移液嘴。（只有改用不同液體時才需更換吸嘴）。

⑦使用完畢

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使用完畢，可以將其豎直掛在移液槍架上，但要小心別掉下來。當(dāng)移液器槍頭里

有液體時，切勿將移液器水平放置或倒置，以免液體倒流腐蝕活塞彈簧。

⑸維護(hù)保養(yǎng)時的注意事項(xiàng)

如不使用，把移液槍的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)以保護(hù)彈簧。

最好定期清洗移液槍，可以用肥皂水或60%的異丙醇，再用蒸儲水清洗，自然晾

干。

高溫消毒之前，要確保移液器能適應(yīng)高溫。

3.4用具的洗滌

(1)玻璃器皿的洗滌

新購置的玻璃器皿或多或少都含有游離的堿性物質(zhì)。使用前要先用設(shè)稀HC1浸泡一夜，

再用肥皂水洗凈，清水沖洗后，再用蒸憎水沖洗1次，晾干后備用。用過的玻璃器皿，用清

水沖洗，蒸儲水沖洗1次，干后備用即可。對于已被污染的玻璃器皿則必須在高壓蒸汽滅菌

后，倒去殘?jiān)妹⑺⑷テ勘谏系呐囵B(yǎng)液和菌斑后，再用清水沖洗干凈，蒸鐳水沖淋一

遍，晾干備用，切忌不可直接用水沖洗，否則會造成培養(yǎng)環(huán)境的污染。清洗后的玻璃器皿，

瓶壁應(yīng)透明發(fā)亮，內(nèi)外壁水膜均一，不掛水珠。

(2)金屬用具的洗滌

新購置的金屬用具表面上有一層油膩，需擦凈油膩后再用熱肥皂水洗凈，清水沖洗后,

擦干備用。用過的金屬用具，用清水洗凈，擦干備用即可。

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第3節(jié)實(shí)驗(yàn)器具的消毒

（-）教學(xué)目標(biāo)

1.掌握高溫蒸汽滅菌鍋、烘干箱的使用方法及注意事項(xiàng)

2.掌握實(shí)驗(yàn)室及玻璃器皿、培養(yǎng)基、操作器械的滅菌方法及注意事項(xiàng)

（~）教學(xué)重點(diǎn)

1.掌握高溫蒸汽滅菌鍋、烘干箱的使用方法及注意事項(xiàng)

2.掌握實(shí)驗(yàn)室及玻璃器皿、培養(yǎng)基、操作器械的滅菌方法及注意事項(xiàng)

（三）教學(xué)過程

3.1接種室滅菌

?紫外燈照射（接種室、超凈臺、接種箱）：波長260nm,距離小于L2m,30mino

?臭氧滅菌機(jī)：l-2h

?熏蒸滅菌：5-8ml/n?甲醛+5g/m，高鎬酸鉀；冰醋酸；1-3%高鎰酸鉀或3%來蘇兒。

?接種臺噴霧消毒：75%酒精。

?隔2-5天用洗衣粉水或來蘇水拖地1次，用高鋸酸鉀擦架1次。

3.2用具的滅菌

培養(yǎng)皿、三角瓶、吸管等玻璃用具和解剖針、解剖刀、鑲子等金屬器具，均可用干熱

滅菌法。將清洗晾干后的用具用紙包好，放進(jìn)電熱烘干箱。當(dāng)溫度升至100C時，啟動箱內(nèi)

鼓風(fēng)機(jī)，使電熱箱內(nèi)的溫度均勻。當(dāng)溫度升至150℃時，定時控制40min（或120℃定時

120min）,達(dá)到滅菌目的。由于干熱滅菌能源消耗大，費(fèi)時間，這一方法并不常用，常用

高壓蒸汽滅菌代替。

高壓蒸汽滅菌時，一般在121c控溫15?40min,即可切斷電源，緩慢降壓至讀數(shù)為0

時，方可取出滅菌物。

用于無菌操作的用具除高壓蒸汽滅菌外，在接種過程中還常常采用灼燒滅菌。準(zhǔn)備接

種前，將鑲子、解剖刀置于酒精燈火焰上灼燒，借助酒精瞬間燃燒產(chǎn)生高熱來達(dá)到殺菌的

目的。

操作中要反復(fù)灼燒、放涼、使用，操作完畢后，用具應(yīng)擦拭干凈后再放置。

3.3常用滅菌儀器的使用及注意事項(xiàng)

3.3.1熱空氣消毒箱

一、設(shè)備用途：

熱空氣消毒箱具有高效、可靠、安全和精確的特點(diǎn)，采用物理方法進(jìn)行消毒滅菌以及

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一些玻璃器皿和操作器械的烘干。

二、設(shè)備參數(shù)：

1、溫度調(diào)節(jié)范圍：RT+10~200℃RT+10~250℃

2、波動值（偏移、穩(wěn)定性）：±0.4℃

3、供電電源：220V50Hz單相

4、環(huán)境條件：5~40℃

5、分辨率:0.1℃

6、不確定度：0.4℃

三、操作指引

1.把需消毒處理的物品放入消毒箱內(nèi)，關(guān)好箱門。

2.開啟電源開關(guān)，如消毒物品比較潮濕，可通過風(fēng)門調(diào)節(jié)旋鈕將風(fēng)門打開，使箱內(nèi)濕空

氣排出。

3.溫度的設(shè)定：按環(huán)形箭頭鍵，上排顯示SP符號，按f或I鍵，使下排顯示為所需要

的設(shè)定溫度，再按環(huán)形箭頭鍵，儀表回到標(biāo)準(zhǔn)模式。

4.如用定時器，開啟定時器開關(guān)，將定時器控制器調(diào)節(jié)到所需時間。

5.定時結(jié)束后，消毒箱進(jìn)入冷卻狀態(tài)，待消毒箱內(nèi)溫度冷卻接近室溫時，取出物品，并

關(guān)閉電源。

四、注意事項(xiàng)

1、消毒結(jié)束后，取出物品時，應(yīng)注意小心燙傷。

2、箱內(nèi)外殼必須有效接地，使用完畢后應(yīng)將電源關(guān)閉。

3、消毒箱無防爆裝置，不得放置易燃易爆物品。

4、消毒箱內(nèi)物品放置切勿過擠，必須留出空間，以利于熱空氣循環(huán)和消毒。

五、保養(yǎng)點(diǎn)檢

1、設(shè)備不宜在高壓、大電流、強(qiáng)磁場條件下使用，以免干擾溫控儀及發(fā)生觸電危險(xiǎn)。

2、消毒箱應(yīng)放置在具有良好通風(fēng)條件的室內(nèi)，在其周圍不可放有易燃易爆的物品。

3.3.2高壓蒸汽滅菌鍋

⑴介紹

高壓滅菌鍋又名高壓蒸汽滅菌鍋，可分為手提式滅菌鍋和立式高壓滅菌鍋。利用電熱

絲加熱水產(chǎn)生蒸汽，并能維持一定壓力的裝置。主要有一個可以密封的桶體，壓力表，排

氣閥，安全閥，電熱絲等組成。安全閥：超過額定壓力，釋放壓力；手輪：旋轉(zhuǎn)羅盤式開

啟蓋門，簡單方便（適合于40L以上產(chǎn)品）；壓力表：指示壓力顯示；密封圈：自漲式密

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封圈；底部活動輪；蒸汽收集瓶：3L,聚乙烯材質(zhì)（適合于內(nèi)排式和帶干燥型）具備產(chǎn)品

醫(yī)療器械注冊證，每臺經(jīng)過技術(shù)監(jiān)督局嚴(yán)格檢測（每臺設(shè)備配一套檢測證書）。

⑵使用方法：

①在鍋內(nèi)加適量的水，與三個支架齊平，將需要滅菌的物品用報(bào)紙等材料包扎好，放

入鍋內(nèi)，蓋好鍋蓋并扭緊螺旋。

②加熱使鍋內(nèi)產(chǎn)生蒸氣，當(dāng)壓力表指針達(dá)到33.78kPa時，打開排氣閥，將冷空氣排

出，此時壓力表指針下降，當(dāng)指針下降至零時，即將排氣閥關(guān)好。

③繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)蒸氣增加，壓力表指針又上升到所需溫度（121℃）與壓力，維持一

定時間（20min或更久）。時間到后，儀器會發(fā)出鳴叫聲，關(guān)掉電源，讓其自然冷后再慢

慢打開排氣閥以排除余氣，然后才能開蓋取物。

⑶注意事項(xiàng)

①待滅菌的物品放置不宜過緊；

②必須將冷空氣充分排除，否則鍋內(nèi)溫度達(dá)不到規(guī)定溫度，影響滅菌效果；

③滅菌完畢后，不可放氣減壓，否則瓶內(nèi)液體會劇烈沸騰，沖掉瓶塞而外溢甚至導(dǎo)致

容器爆裂。須待滅菌器內(nèi)壓力降至與大氣壓相等后才可開蓋；

④已有微電腦自動控制的高壓滅菌鍋，只需放去冷氣后，儀器即可自動恒壓定時，時

間一到則自動切斷電源并鳴笛:使用起來很方便。

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第4節(jié)培養(yǎng)基及其配制

（-）教學(xué)目標(biāo)

1.了解培養(yǎng)基的種類及成分；

2.掌握固體培養(yǎng)基的配制方法及注意事項(xiàng)；

3.了解培養(yǎng)基滅菌的注意事項(xiàng)；

（二）教學(xué)重點(diǎn)

1.培養(yǎng)基的種類及成分；

2.固體培養(yǎng)基配制的一般步驟及注意事項(xiàng)；

3.培養(yǎng)基配制后的滅菌；

（三）教學(xué)過程

3.1培養(yǎng)基的種類和成分

3.1.1培養(yǎng)基分類

①培養(yǎng)基相態(tài)

固體培養(yǎng)基通氣性較好，便于操作，但營養(yǎng)分布不均，生長發(fā)育不整齊。

液體培養(yǎng)基營養(yǎng)分布均勻，生長整齊一致，但通氣性差。

②根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程分

初代培養(yǎng)基

繼代培養(yǎng)基

③根據(jù)作用不同分

誘導(dǎo)培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基

生根培養(yǎng)基

3.1.2常見培養(yǎng)基的種類

基本培養(yǎng)基：

MS培養(yǎng)基特點(diǎn)：無機(jī)鹽、離子濃度高，硝酸鹽含量較高。

White培養(yǎng)基：生根培養(yǎng)還是胚胎培養(yǎng)或一般組織培養(yǎng)都有很好的效果，特點(diǎn)是無機(jī)

鹽濃度較低

B5培養(yǎng)基：含較低的鏤，雙子葉植物，尤其木本植物組培可選擇

N6培養(yǎng)基：成分簡單，KN03和（NH4）2S04含量高，適合花藥離體培養(yǎng)

3.1.3培養(yǎng)基成分

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3.1.3.1水

3.1.3.2無機(jī)鹽

（1）無機(jī)大量元素

是指培養(yǎng)基中含量超過lOOmg/L的無機(jī)元素，包括N、P、K、Ca、Mg、S等。

①氮（N）。是細(xì)胞中核酸的組成部分，也是生物體許多酶的成分，氮被植物吸收后轉(zhuǎn)化為

氨基酸再轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，然后被植物利用，氮還是葉綠素、維生素和植物激素的組成成分。

氮主要以鏤態(tài)氮、硝態(tài)氮兩種形式被利用，實(shí)際中常常將兩者混合使用，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中

的離子平衡，利于細(xì)胞的生長發(fā)育。一般認(rèn)為，錢態(tài)氮的含量超過8nlmo"L時容易傷害

培養(yǎng)物，但這種情況也依植物種類、培養(yǎng)部位、培養(yǎng)類型而定。

②磷（P）。參與植物生命活動中核酸和蛋白質(zhì)合成、光合作用、呼吸作用以及能量的儲存、

轉(zhuǎn)化與釋放等重要的生理生化過程，增強(qiáng)植物的抗逆能力，促進(jìn)早熟。組織培養(yǎng)過程中培

養(yǎng)物需大量的磷。磷常以鹽的形式供給。

③鉀（K）。是許多酶的活化劑。組織培養(yǎng)中鉀能促進(jìn)器官和不定胚的分化，促進(jìn)葉綠體ATP

的合成，增強(qiáng)植物的光合作用和產(chǎn)物的運(yùn)輸，能調(diào)節(jié)植物細(xì)胞水勢，調(diào)控氣孔運(yùn)動，提高

植物的抗逆性能。鉀常以鹽的形式供給。

④鈣、鎂、硫（Ca、Mg、S）。也是植物的必需元素，參與細(xì)胞壁的構(gòu)成，影響光合作用，促

進(jìn)代謝等生理活動。鈣、鎂和硫的濃度以1?3mmol/L較宜，常以MgSO,和鈣鹽的形式供給。

NNH4NQ,

KNO3

PKH.PO,NaH2Po

KKC1

KNO3

CaCaCl2?2H20

MgMg2S01?7H20

SMg2S0)?7H20

FeFeNa2-EDTA

（2）無機(jī)微量元素

是指在培養(yǎng)基中含量低于lOOmg/L的元素，主要有鐵、硼、銃、鋅、銅、鋁、鉆、

氯。植物生長對微量元素需要量很少，一般為107?105mol/L,稍多則會出現(xiàn)外植體

蛋白質(zhì)變性、酶系失活、代謝障礙等毒害現(xiàn)象。微量元素中，鐵對葉綠素的合成和延長生

長起重要作用，通常以硫酸亞鐵與Na?EDTA螯合物的形式存在培養(yǎng)基中，避免Fe"氧化

產(chǎn)生氫氧化鐵沉淀。硼能促進(jìn)生殖器官的正常發(fā)育，參與蛋白質(zhì)合成或糖類運(yùn)輸，可調(diào)節(jié)

和穩(wěn)定細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞伸長和細(xì)胞分裂。鎰參與植物的光合作用、呼吸代謝過程，影

23

響根系生長，對維生素c的形成以及加強(qiáng)莖的機(jī)械組織有良好作用。鋅是各種酶的構(gòu)成要

素，增強(qiáng)光合作用效率，參與生長素的代謝，促進(jìn)生殖器官發(fā)育和提高抗逆性。銅能促進(jìn)

花器官的發(fā)育；鑰是氮素代謝的重要元素，參與繁殖器官的建成。

BH3B03

MnMnSO，1

(W0.5mmol/L)CuCuSOi

MoNa2MoO.?2H20

ClCaCl2?2H20

3.1.3.3有機(jī)物：有機(jī)營養(yǎng)成分是指植物生長發(fā)育時所必需的有機(jī)碳、氫、氮等物質(zhì)，主

要有糖、維生素、肌醇、氨基酸等。

⑴碳水化合物：既可作為碳源，又可為培養(yǎng)的外植體提供生長發(fā)育所需的碳架和能源，同

時還具有維持培養(yǎng)基滲透壓的作用。

選用種類：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等

蔗糖濃度：2—3%胚培養(yǎng)為4-15%

高壓滅菌部分糖會分解。

⑵維生素：

種類：VB1、VB6、Vpp、Vc

濃度：0.l—l.Omg/L

作用：VB1促愈傷組織產(chǎn)生，提高活力

VB6促根生長

Vpp與代謝和胚發(fā)育有關(guān)

Vc抗氧化，防組織褐變

⑶肌醇

能幫助活性物質(zhì)發(fā)揮作用，使培養(yǎng)組織快速生長，促進(jìn)胚狀體及不定芽的形成，對組

織細(xì)胞繁殖、分化的促進(jìn)作用。肌醇用量一般為50?100mg/L。

⑷氨基酸和有機(jī)添加物

氨基酸作為一種重要的有機(jī)氮源，除構(gòu)成蛋白質(zhì)、酶、核酶等生物大分子的基本組成

外，還具有緩沖作用和調(diào)節(jié)培養(yǎng)物體內(nèi)平衡的功能，對外植體芽、根、胚狀體的生長、分

化有良好的促進(jìn)作用。常用的氨基酸有丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、酪氨酸、天

冬酰胺以及多種氨基酸的混合物，如水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH）等。其中甘氨

酸能促進(jìn)離體根的生長，絲氨酸和谷氨酰胺有利于花藥胚狀體或不定芽的分化。半胱氨酸

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可作為抗氧化劑，防止培養(yǎng)材料褐化，延緩酚氧化。有些植物組織培養(yǎng)中還加入一些天然

的有機(jī)物，如椰乳(椰子、CM)、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥、馬鈴薯泥等，其有效成分

為氨基酸、酶、植物激素等，這些天然有機(jī)物對植物組織培養(yǎng)并非必需的，但可起一定的

促進(jìn)作用。由于這些天然有機(jī)物成分復(fù)雜且難以確定，在培養(yǎng)基的配制中仍傾向于選用已

知成分的合成有機(jī)物。

天然復(fù)合物：

椰乳：促愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)，用量10—20%使用注意莖尖大小

香蕉泥：對pH值緩沖大，用量150—200ml/L,應(yīng)用在蘭花組培

馬鈴薯：對pH值緩沖大，用量150—200g/L,使苗壯

水解酪蛋白：濃度100—200mg/L,應(yīng)用在微莖尖培養(yǎng)

3.1.3.4植物激素

生長素類

(1)種類IAAIBANAA2,4-D

它們作用的強(qiáng)弱依次為2,4-D>NAA>IBA>IAA

(2)作用主要功能是促進(jìn)細(xì)胞伸長生長和細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)愈傷組織形成，促進(jìn)生根。配

合一定量的細(xì)胞分裂素，可誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長。誘導(dǎo)愈傷組織和根分

化，促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長。

(3)濃度0.05-5mg/L

細(xì)胞分裂素(CTK)

(1)種類：常見細(xì)胞分裂素有激動素(KT)、異戊烯基腺喋吟(2iP)、6-茉基

腺喋吟(6-BA)、玉米素(ZT)、嚷重氮苯基胭(TDZ)。它們作用的強(qiáng)弱依次為TDZ>Zt>

2ip>BAP>KT

(2)作用：主要功能是促進(jìn)細(xì)胞分裂、抑制衰老、當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素/生長素的比值高

時，可誘導(dǎo)芽的分化。

(3)濃度:0.05-100mg/L

赤霉素(GA)注：不耐熱

(1)種類:GA3

(2)作用：促莖伸長，促胚發(fā)育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。

3.1.3.5培養(yǎng)體支持材料

瓊脂是從海藻中提取出來的一種高分子碳水化合物，其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下

固化形成固體培養(yǎng)基。瓊脂的固化能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌

25

的溫度、時間、pH值等有關(guān)。長時間高溫會使其凝固能力下降，過酸和過堿加上高溫也會

使瓊脂發(fā)生水解，喪失固化能力，存放時間過久，也會逐漸失去凝固能力。瓊脂的用量一

般在0.6%?1.0%（6-10g/L）,選擇顏色淺、透明度好、潔凈、雜質(zhì)少的瓊脂為宜。使用

高純度的瓊脂可避免其中的雜質(zhì)對細(xì)胞生長分化的影響。新買應(yīng)試凝固力。

3.1.3.6輔助性物質(zhì)

抗生素：

添加抗生素的主要目的是，防止由外植體內(nèi)生菌造成的污染。不過，在使用抗生素時

應(yīng)注意以下四個問題：

①不同抗生素能有效抑制的菌種不完全相同，因此必須針對性地對抗生素的種類加

以選擇；

②在有些情況下，單獨(dú)使用無論哪一種抗生素對控制污染皆無效，必須幾種抗生素

結(jié)合使用才能取得較好的效果；

③當(dāng)所用抗生素的濃度高到足以消除內(nèi)生菌時，有些植物的生長發(fā)育也會同時受到

抑制；

④在停用抗生素后，污染率往往顯著上升，這可能是原來受抑的菌類又滋生造成的。

因此，在高等植物離體培養(yǎng)中，特別是在商業(yè)性快繁中，應(yīng)當(dāng)盡量避免使用抗生素。

常用種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等

用量：為5?20mg/Lo大部分抗生素要求過濾滅菌。

抗氧化物：

常用抗氧化劑及使用：半胱氨酸、VC（50—200mg/L液洗滌外植體傷口表面）。

活性炭：

作用：具吸附作用；莖尖初代培養(yǎng)可防褐化；促進(jìn)新梢增殖（濃度0」-0.2%）；促

進(jìn)生根；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）。利于胚胎培養(yǎng)。

常用濃度：0.5-10g/L

注意：活性炭具副作用。

3.2培養(yǎng)基配制的一般步驟

配制培養(yǎng)基所用的器具主要包括不同型號的燒杯、量筒、玻棒、培養(yǎng)瓶等。配制培養(yǎng)

基前，要洗凈備齊所用器具。經(jīng)常需配制培養(yǎng)基時，為了減少工作量，現(xiàn)在配制培養(yǎng)基一

個廣泛采用的比較方便的方法是先配制一系列的母液，需要時再稀釋使用。

26

混合…一pH調(diào)整一加熱溶解

分裝

瓊脂-------

玻璃器皿一水洗一干燥」一加棉塞

高壓蒸汽滅菌----冷卻一凝固------接種

具體操作流程如下：

①稱出規(guī)定數(shù)量的瓊脂和蔗糖，加水直到培養(yǎng)基最終容積的3/4,在恒溫水浴中加熱使

之溶解。

②分別加入一定量的各種母液，包括生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他的特殊補(bǔ)加物。

③加蒸儲水直至培養(yǎng)基的最終容積。

④充分混合之后，用0.Imol/LNaOH或0.Imol/LHC1調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。pH值通常用精密

pH試紙或酸度計(jì)進(jìn)行測定。若用酸度計(jì)測定，則應(yīng)在調(diào)節(jié)pH值后再加入瓊脂，因?yàn)榄傊?/p>

要作用是固化培養(yǎng)基，加入瓊脂后再調(diào)pH值，會使酸度計(jì)靈敏度降低，測量不準(zhǔn)確。pH試

紙測定時，可先加瓊脂后再調(diào)pH值。

⑤已經(jīng)配好的培養(yǎng)基，在瓊脂沒有凝固的情況下(約在40C時凝固)，應(yīng)盡快將其分裝

到培養(yǎng)容器中。分裝時要掌握好培養(yǎng)基的量，一般以占培養(yǎng)容器的1/4?1/3為宜。分裝時

要注意不要將培養(yǎng)基沾到壁口，以免引起污染。如果在步驟(2)?(5)期間培養(yǎng)基開始凝

固，應(yīng)將裝培養(yǎng)基的三角瓶置水浴中加熱，只有當(dāng)培養(yǎng)基為均勻的液態(tài)時才能分裝。

⑥分裝后的培養(yǎng)基應(yīng)盡快將容器口封住，以免培養(yǎng)基水分蒸發(fā)。在此應(yīng)特別注意培養(yǎng)