分子生物學(xué)課件

DNA與染色體2.1.1含氮堿基連接在核糖-磷酸骨架形成多聚核苷酸鏈（Polynucleotidechainhavenitrogenousbaseslinkedtoasugar-phosphatebackbone）2.1DNA譯自GENESIX1.5;GENESX1.4核酸（nucleicacid）的基本結(jié)構(gòu)單位是核苷酸。核苷酸有三部分構(gòu)成：含氮堿基（nitrogenousbase）、糖（suger）和磷酸（phosphate）。含氮堿基是一個(gè)嘌呤環(huán)或嘧啶環(huán)，通過糖苷鍵連接于一個(gè)五碳糖的1’C上，其中嘧啶通過N1、嘌呤通過N9連接。五碳糖與堿基相連構(gòu)成核苷（nucleoside）。為避免雜環(huán)和糖的編號(hào)系統(tǒng)混淆，五碳糖編號(hào)使用“’”。1’9Figure2.1腺嘌呤核苷核酸據(jù)糖的類型命名：DNA含有2’脫氧的核糖（2–deoxyribose）；RNA含有核糖（ribose），其2’位上是一個(gè)OH基團(tuán)。糖可通過其5’、3’位與磷酸基團(tuán)相連而連接起來。核苷連接磷酸后稱為核苷酸（nocleotide）。Figure2.2腺嘌呤核苷三磷酸。所以，糖、磷酸骨架由5’–3’二酯鍵（5’–3’phosphodiesterlinkages）連接而成。一個(gè)核糖的3’C與磷酸的O形成價(jià)鍵，另一個(gè)核糖的5’C與相對(duì)的另一個(gè)O形成價(jià)鍵。含氮堿基伸出骨架外。Figure2.3

核酸（多聚核苷酸）是由核苷酸形成的長(zhǎng)鏈，F(xiàn)igure2.3顯示多核苷酸鏈骨架包括一系列交替的核糖與磷酸殘基。磷酸基團(tuán)把一個(gè)五碳糖的3’與下一個(gè)五碳糖的5’連接起來，這樣形成核酸鏈。RNA中是尿嘧啶（uracil,U）而沒有胸腺嘧啶。這兩者的唯一區(qū)別是胸腺嘧啶的第5位有甲基取代。(U)每種核酸包括4種堿基，兩種嘌呤—腺嘌呤（adenine,A）和鳥嘌呤（guanine,G）在DNA與RNA中都存在；DNA中的嘧啶是胞嘧啶（cytosine,C）和胸腺嘧啶（thymine,T），F(xiàn)igure2.4DNA中的含氮堿基。鏈的一個(gè)末端的核苷酸具有游離的5’磷酸，另一個(gè)末端核苷酸有游離的3’羥基。習(xí)慣上按5’→3’書寫核酸序列，即從左側(cè)的5’端到右側(cè)的3’端。Figure2.5從同一個(gè)磷酸基的3’酯鍵到5’酯鍵的方向定為鏈的方向，表示為pCpApApTpCpGpTpCp或pCAATCGTCA或5’-CAATCGTCA-3’。Figure2.6大多數(shù)天然DNA分子的兩端，往往有一個(gè)核糖帶有自由的5’磷酸，稱5’端；另一端的核糖帶有自由的3’羥基，稱3’端。2.1.2DNA是雙螺旋（DNAisadoublehelix）DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)是指其序列；最典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)是雙螺旋。譯自GENESIX1.6;GENESX1.6到了1950s，ErwinChargaff發(fā)現(xiàn)來源于不同物種（differentspecies）的DNA的堿基含量有所不同，這導(dǎo)致這樣一個(gè)概念——堿基順序是攜帶遺傳信息的形式?；谶@一概念，有兩個(gè)相關(guān)的問題需要解決：核酸的結(jié)構(gòu)和DNA的堿基序列（sequenceofbases）是如何代表蛋白質(zhì)中氨基酸序列的。有三種實(shí)驗(yàn)證據(jù)為Watson和Crick在1953年提出DNA雙螺旋模型提供了支持：

RosalindFrankiln和MauriceWilkins收集的X-射線衍射（X-raydiffraction）數(shù)據(jù)顯示，B型DNA（比A型DNA更易與水結(jié)合）呈規(guī)則的螺旋，每34?（3.4nm）轉(zhuǎn)一整圈（acompleteturn），直徑~20?（2nm）。由于相鄰的核苷酸之間的距離為3.4?，所以，每圈之間肯定是10個(gè)核苷酸（在水溶液中，平均每圈10.4個(gè)核苷酸）。DNA的密度表明一定是有兩條多核苷酸鏈參與構(gòu)成。直徑不變可能是由于每條鏈的堿基朝內(nèi)，嚴(yán)格按嘌呤對(duì)著嘧啶的原則排布，這樣，避免嘌呤對(duì)著嘌呤（過寬），嘧啶對(duì)著嘧啶（過窄）。

Chargaff還發(fā)現(xiàn)不管每種堿基的絕對(duì)數(shù)量是多少，G的比例總是與C的比例一致，A的比例總是與T的比例一致。所以，任何一種DNA的組成均可由其G-C含量描述（A和T的含量為1減G-C的含量）。在不同物種中，G-C含量從26%到74%不等。

Watson和Crick提出雙螺旋中兩條多核苷酸鏈通過堿基之間的氫鍵（hydrogenbond）結(jié)合，G與C之間、A與T之間特異地形成氫鍵。堿基之間的這種氫鍵結(jié)合稱為堿基配對(duì)（basepairing），也就是說配對(duì)的堿基（G與C間形成3個(gè)氫鍵；A與T間形成2個(gè)氫鍵）彼此為互補(bǔ)（complementary）?；パa(bǔ)堿基之間之所以能配對(duì)，是由于互補(bǔ)堿基在作用界面處形狀互補(bǔ)，正確的功能基團(tuán)在作用界面處于正確的空間位置，才形成氫鍵。Figure

2.7由于在A-T和G-C堿基對(duì)中嘌呤總是與嘧啶相對(duì)，雙螺旋的寬度是恒定的。圖中的序列為T-A,C-G,A-T,G-C。

Watson和Crick的模型指出兩條多核苷酸鏈走向相反，即呈反向平行（antiparallel）如Figure2.7顯示。沿螺旋看，一條鏈為5’→3’，另一條為3’→5’。

糖-磷酸骨架位于外側(cè)，磷酸基團(tuán)攜帶負(fù)電荷，在體外（invitro）溶液環(huán)境中，電荷被所結(jié)合的金屬離子（通常是Na+）中和。在細(xì)胞中，由攜帶正電荷的蛋白質(zhì)中和，因此，這些蛋白對(duì)于DNA在細(xì)胞內(nèi)的功能具有重要作用。

呈片狀結(jié)構(gòu)的堿基位于內(nèi)側(cè)，扁平狀的堿基對(duì)垂直于螺旋軸。如Figure2.8，雙螺旋形似旋轉(zhuǎn)樓梯，堿基對(duì)就像是樓梯踏板。隨著沿螺旋上升，堿基對(duì)就像一堆碟子，層層疊起。Figure

2.8扁平的堿基對(duì)與核糖磷酸骨架垂直。相對(duì)于相鄰的堿基對(duì)，每個(gè)堿基對(duì)沿螺旋軸旋轉(zhuǎn)~36°，所以10個(gè)堿基對(duì)正好旋轉(zhuǎn)360°。Figure2.9顯示，兩鏈相互纏繞，呈雙螺旋，形成小溝（minorgroove）（寬~12?）和大溝（majorgroove）（寬~22?）。雙螺旋為右手形式，沿螺旋軸望去，旋轉(zhuǎn)呈順時(shí)針（離觀察者而去）。這些是B-型DNA的特征。Figure

2.9右手螺旋：不管從頂部還是底部觀察，螺旋按順時(shí)針方向離你而去。必須注意的是，B-型DNA代表一種平均的，而不是精確特異的結(jié)構(gòu)，局部的DNA結(jié)構(gòu)可以有變化。若每圈堿基對(duì)不足10個(gè)，為超纏（緊纏，overwound），若超過10個(gè)，為松纏（underwound）。DNA雙螺旋的總體構(gòu)象、特異位點(diǎn)（specificsites）上蛋白的結(jié)合都能影響局部纏繞情況。DNA還有另一種結(jié)構(gòu)上的變化形式——彎曲DNA（轉(zhuǎn)折DNA，bentDNA）。一條鏈上出現(xiàn)8-10個(gè)A會(huì)導(dǎo)致DNA雙螺旋產(chǎn)生內(nèi)在的（intrinsic）彎曲，這一結(jié)構(gòu)使DNA更易包裝成緊密的形式，在核小體組裝和基因調(diào)控時(shí)發(fā)揮作用。（Thisstructureallowstighterpackingwithconsequencefornucleosomeassemblyandgeneregulation.）A-DNAB-DNAright-handedhelix(右手螺旋)：Z-DNAABZleft-handedhelix(左手螺旋)Figure2.10與軸的傾角Table2.1各種形式的雙螺旋DNA的參數(shù)A-DNA

Watson和Crick的雙螺旋模型描述的是B–DNA，是DNA鈉鹽在相對(duì)濕度為92%時(shí)的結(jié)構(gòu)，但在一定情況下B–DNA可以轉(zhuǎn)變?yōu)锳–DNA，如：相對(duì)濕度減少75%；雙螺旋中一條鏈被RNA取代，比如轉(zhuǎn)錄時(shí)；

RNA形成的螺旋。Z-DNA

1979年，AlexanderRich等發(fā)現(xiàn)嘧啶核嘌呤相間排列的寡核苷酸序列呈伸展的左手螺旋狀態(tài)，因?yàn)閺膫?cè)面看呈之字形（zigzag），故稱Z–DNA。有一定的生物學(xué)活性。2.1.3DNA雙螺旋的穩(wěn)定性氫鍵對(duì)雙螺旋中堿基配對(duì)的特異性有重要作用，但對(duì)雙螺旋的整體穩(wěn)定性沒有作用（即僅憑氫鍵不足以維持雙螺旋的整體穩(wěn)定）。整體穩(wěn)定性源于堿基堆積作用（stackinginteractionbetweenbasepairs）。（節(jié)選自孫乃恩等《分子遺傳學(xué)》1.5）氫鍵：氫供體——氨基、羥基氫受體——酮基、亞胺基當(dāng)氫供體、氫原子、氫受體處于一條直線，形成氫鍵能力最強(qiáng)。堿基堆積力：同一條鏈中相鄰堿基之間的非特異性作用力，包括疏水作用和范德華力（VandeWaalforce）。磷酸基的負(fù)電荷靜電斥力：磷酸集團(tuán)在雙鏈之間形成強(qiáng)有力的靜電排斥作用，不利于雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。在細(xì)胞中，由攜帶正電荷的蛋白質(zhì)中和（屏蔽）。堿基分子內(nèi)能：溫度增高等因素能使堿基分子內(nèi)能加大，削弱氫鍵和堿基堆積力，不利于雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。所以，維持DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的力：氫鍵堿基堆積力磷酸基的負(fù)電荷靜電斥力堿基分子內(nèi)能利于雙螺旋結(jié)構(gòu)不利于雙螺旋結(jié)構(gòu)核酸的紫外吸收源于堿基中芳環(huán)。DNA和RNA的最大紫外吸收是260nm（λmax=260nm）。核酸紫外吸收的特性可用于核酸的檢測(cè)、定量和純度的判斷。2.1.4.1紫外吸收（UVabsorption）2.1.4核酸的物理、化學(xué)特性因?yàn)椋?0ng/μl

的dsDNA的A260=1.0（ds:doublestrand,雙鏈），所以：

dsDNA（ng/μl）樣品濃度為：A260×50×稀釋倍數(shù)因?yàn)椋?0ng/μlRNA:A260=1.0，所以：

RNA（ng/μl）樣品濃度為：A260×40×稀釋倍數(shù)

純的DNA:A260/A280=1.8

純的RNA:A260/A280=2.0

如果DNA樣品的A260/A280大于1.8，說明有RNA污染；小于1.8，說明有蛋白污染。2.1.4.2變性（denaturation）加熱、化學(xué)試劑（如尿素、甲酰胺）或極端的pH條件下可導(dǎo)致DNA雙螺旋變性（也稱熔解，melting）——配對(duì)堿基之間的氫鍵和堿基片層之間的堆積作用被破壞，導(dǎo)致雙螺旋解纏，形成單鏈，彼此完全分離。由于單鏈的紫外吸收比雙鏈大，所以產(chǎn)生增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）。雙螺旋部分解鏈無規(guī)線團(tuán)Figure2.11比如：當(dāng)DNA濃度為50ng/μl時(shí)：dsDNAA260=1.00denaturedDNAA260=1.37變性一半時(shí)：A260=1.185（降解后）dNMPA260=1.60Figure2.121.01.37OD1.185Tm℃當(dāng)DNA溶液加熱到足夠高的溫度時(shí)，變性，兩鏈解離。DNA變性到一半時(shí)的溫度稱為熔點(diǎn)（meltingpoint）或熔解溫度（meltingtemperature,Tm）。Tm和GC之間的關(guān)系：每種DNA都有特定的Tm值：其G≡C堿基對(duì)越多，Tm值越高，因?yàn)橄鄬?duì)于兩個(gè)氫鍵的A=T堿基對(duì)，打開三個(gè)氫鍵的G≡C堿基對(duì)需要更多的能量。

(GC)%=(Tm－69.3)×2.44GC對(duì)百分比相同的DNA，GC對(duì)比較集中時(shí)Tm值大。Figure2.13有一些經(jīng)驗(yàn)公式反映Tm與GC之間的關(guān)系，比如：2.1.4.3復(fù)性（renaturation）在特定的條件下，變性解鏈后的兩條DNA單鏈可以重新結(jié)合在一起，這稱作退火（annealing）或復(fù)性（renaturation）。影響復(fù)性效率的因素主要有：

溫度：最佳復(fù)性溫度為Tm-25℃。這一溫度足夠低，不利于變性；又足夠高，使得DNA能夠擴(kuò)散，不利于錯(cuò)配序列之間暫時(shí)形成化學(xué)鍵，也不利于鏈內(nèi)堿基之間暫時(shí)形成化學(xué)鍵。

DNA濃度：一定限度內(nèi)，DNA的濃度越高，復(fù)性越快。

復(fù)性時(shí)間：復(fù)性時(shí)間越長(zhǎng)，復(fù)性越充分。離子濃度：0.15-0.50MNaCl，消除磷酸基團(tuán)間斥力；DNA片段的長(zhǎng)度；DNA的復(fù)雜性（ThecomplexityoftheDNA）。

變性后快速冷卻會(huì)阻撓復(fù)性。實(shí)際上，為了使變性的DNA維持在變性狀態(tài)，通常采取把加熱的DNA溶液迅速放置冰上的辦法，這叫做淬火（quenching）。常用的復(fù)性方法是把互補(bǔ)的DNA溶于緩沖液，加熱到94℃，然后放置在室溫，使之逐漸冷卻。2.1.4.4

核酸可通過堿基配對(duì)雜交雙螺旋的一個(gè)關(guān)鍵特性是能夠不通過斷裂共價(jià)鍵就實(shí)現(xiàn)兩條單鏈（strand）分離，這使得雙螺旋能夠在生理狀態(tài)下，以（很快的）能維持遺傳功能（geneticfunctions）的速率解鏈和重新形成。這一過程的特異性由互補(bǔ)堿基配對(duì)決定。譯自GENESIX1.10;GENESX1.10對(duì)于任何涉及核酸的過程而言，堿基互補(bǔ)是核心。堿基配對(duì)的打破對(duì)于雙鏈分子行使功能至關(guān)重要，而形成堿基配對(duì)的能力對(duì)于單鏈分子的功能則至關(guān)重要。Figure2.14顯示堿基配對(duì)使互補(bǔ)的單鏈形成螺旋結(jié)構(gòu)。Figure

2.14

堿基配對(duì)可以發(fā)生在DNA雙鏈之間，也可以發(fā)生在單鏈的RNA（或DNA）分子內(nèi)或分子間。RNA分子內(nèi)部配對(duì)

分子內(nèi)雙鏈區(qū)域是通過單鏈核酸分子中兩段互補(bǔ)序列堿基配對(duì)而形成。一個(gè)單鏈核酸可以通過與一段獨(dú)立的、與之互補(bǔ)的單鏈核酸的堿基配對(duì)形成分子間雙鏈。

由單鏈核酸分子形成雙鏈區(qū)域?qū)τ赗NA非常重要，但單鏈DNA也存在（分子內(nèi)的互補(bǔ)）（比如病毒基因組）。獨(dú)立的、互補(bǔ)的單鏈分子之間堿基配對(duì)不只局限于DNA-DNA或RNA-RNA形式，也可在DNA與RNA分子之間形成。

由于鏈間沒有共價(jià)鍵，因此可以在體外操作DNA。加熱和低鹽處理可使穩(wěn)定雙螺旋的非共價(jià)力被破壞，當(dāng)兩條單鏈之間的氫鍵全部斷裂后，兩鏈完全解離。

DNA變性發(fā)生在很窄的溫度范圍內(nèi)，雙鏈解離的溫度范圍的中點(diǎn)稱為溶解溫度（Tm），它依賴于G·C堿基對(duì)的比例。在生理?xiàng)l件的溶液中，含40%G·C對(duì)—哺乳動(dòng)物DNA中G·C對(duì)的典型比例—在~87°C變性。所以雙螺旋DNA在細(xì)胞溫度環(huán)境是穩(wěn)定的。在適當(dāng)條件下，DNA變性可逆。兩條互補(bǔ)單鏈復(fù)性。復(fù)性依賴互補(bǔ)鏈之間特異的堿基配對(duì)。復(fù)性分為兩個(gè)階段，如Figure2.15所示：首先，溶液中單鏈之間隨機(jī)碰撞，若序列互補(bǔ)，兩鏈堿基配對(duì)形成一小段雙螺旋區(qū)域；然后，堿基配對(duì)的區(qū)域象拉拉鏈一樣沿分子擴(kuò)展，形成很長(zhǎng)的雙螺旋分子。復(fù)性使DNA分子重新獲得變性時(shí)失去的特性。Figure

2.15變性的DNA單鏈復(fù)性，形成雙鏈。

復(fù)性描述的是由于變性解鏈形成的互補(bǔ)鏈之間的反應(yīng)，但作為一項(xiàng)技術(shù)有更為廣泛的應(yīng)用，可使任意兩條互補(bǔ)的核酸鏈彼此作用形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。復(fù)性有時(shí)也稱退火，若兩條核酸單鏈來源不同，其復(fù)性反應(yīng)往往稱為雜交（hybridization），比如DNA與RNA雜交。由于只有互補(bǔ)序列才能形成雙鏈結(jié)構(gòu)，所以兩個(gè)核酸樣品之間雜交能力的檢測(cè)，是衡量其互補(bǔ)性的精確實(shí)驗(yàn)。雜交反應(yīng)原理是兩個(gè)單鏈核酸分子在溶液中混合后，檢測(cè)生成的雙鏈樣品的量。

Figure2.16顯示了這一過程，一種DNA樣品變性，單鏈吸附于濾膜，然后添加另一種變性的DNA（或RNA）。適當(dāng)處理濾膜，這樣，只有與吸附在濾膜上的DNA發(fā)生堿基配對(duì)，第二種DNA（或RNA）才能吸附于膜上。Figure

2.16濾膜上進(jìn)行的雜交能驗(yàn)證溶液中的變性DNA（或RNA）是否含有與結(jié)合在濾膜上的單鏈能互補(bǔ)的序列。

通常，第二種DNA用同位素標(biāo)記，可通過檢測(cè)膜上保持的放射性強(qiáng)度測(cè)得雜交反應(yīng)程度（第二種DNA是過量的，因而結(jié)合在膜上的同位素可以反映第一種DNA的量）。

在溶液中進(jìn)行的雜交也可通過測(cè)量核酸紫外（260nm）吸收的變化來衡量。當(dāng)DNA隨溫度升高而變性為單鏈時(shí)，溶液的紫外吸收值增高；隨著溫度降低，ssDNA（single-strandDNA，單鏈DNA）與互補(bǔ)的DNA或RNA雜交，吸收值減小。兩鏈的互補(bǔ)性決定雜交程度，并不一定要完全互補(bǔ)兩鏈才能雜交。如果兩鏈不完全互補(bǔ)，但很相似，也能形成不完善的雙鏈，堿基不對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)不能形成互補(bǔ)配對(duì)。2.1.4.5DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)（reassociationkinetics）Cot：是DNA起始濃度（C0）（以mol/L為單位）和時(shí)間（t）（以秒為單位）的乘積。摘譯自GENESVIIISupplement1Cot1/2:

是指兩條互補(bǔ)的單鏈復(fù)性到一半時(shí)的C0t，或者說是C0×t1/2。較大的Cot1/2

意味著復(fù)性反應(yīng)較慢。01Cot1/2

FractionreassociatedFigure2.17

DNA復(fù)性過程通常以Cot曲線表示——以已經(jīng)復(fù)性DNA的比例（1–C/C0）與Cot的對(duì)數(shù)作圖（C是單鏈DNA的濃度）。

Figure2.18給出了幾種簡(jiǎn)單基因組的Cot曲線，從復(fù)性10%到90%，這幾種基因組的Cot都有約100倍的變化，但每種基因組的Cot1/2都不相同。Figure2.18.RateofreassociationisinverselyproportionaltothelengthofthereassociatingDNA.

上述每種都是單一序列（除紅色曲線的polyU:polyA），而且是長(zhǎng)度逐漸增加。Cot1/2與基因組中的DNA量直接相關(guān)，表明當(dāng)DNA質(zhì)量一定，基因組越復(fù)雜時(shí)，特定序列的拷貝數(shù)越少。例如，如果C0是12pg，相當(dāng)于3000個(gè)拷貝的細(xì)菌基因組（其每個(gè)基因組為0.004pg），而只相當(dāng)于4個(gè)拷貝的真核生物基因組（若這種真核生物的基因組為3pg）。所以，當(dāng)DNA的絕對(duì)濃度（以一升溶液中核苷酸的摩爾數(shù)表示，C0）相同時(shí)，真核生物序列的濃度是細(xì)菌序列濃度的1/750。

由于復(fù)性的幾率依賴于互補(bǔ)序列的濃度，若使真核生物序列與細(xì)菌序列的相對(duì)濃度相同，則前者的DNA量應(yīng)為后者的750倍（或者相同量的DNA，但前者復(fù)性時(shí)間為后者的750倍，才能有相同的復(fù)性效果）。所以真核復(fù)性的Cot1/2是細(xì)菌的750倍。所以一個(gè)復(fù)性反應(yīng)的Cot1/2代表著反應(yīng)體系中不相同的序列（differentsequences）的總長(zhǎng)度，通常以復(fù)雜性（complexity）描述，以堿基對(duì)為單位。任何一個(gè)基因組（或基因組的一部分）復(fù)性時(shí)的Cot1/2與它的復(fù)雜性是成比例的，通過比較其Cot1/2與一個(gè)復(fù)雜性已知的標(biāo)準(zhǔn)DNA的Cot1/2，可知該基因組的復(fù)雜性。通常，以E.coli的基因組（有4.2×106bp的單一序列）作為標(biāo)準(zhǔn)：Cot1/2(DNAofanygenome)Cot1/2(E.coliDNA)=Complexityofanygenome4.2×106bpFigure2.19在一定條件下，Cotl/2反映的是DNA分子的復(fù)雜性，成正比：

X=K?Cotl/2

X代表DNA分子的復(fù)雜性，如(ATATATAT)的X為2，(ATCG)n的X為4；序列不重復(fù)的DNA的X則為其長(zhǎng)（K為常數(shù)，取決于離子強(qiáng)度和片段長(zhǎng)度等反應(yīng)條件）。如果采用復(fù)性動(dòng)力學(xué)表征真核基因組，通常復(fù)性反應(yīng)的Cot值可跨越幾個(gè)數(shù)量級(jí)（有些基因組可達(dá)8個(gè)），比Figure2.18中（原核生物的）兩個(gè)數(shù)量級(jí)廣泛得多。因?yàn)槊慷吻€代表的方程只是描述一種單一成分（asinglecomponent）（的復(fù)性特征），而真核生物實(shí)際上包括數(shù)個(gè)成分，每種都以其獨(dú)特的動(dòng)力學(xué)復(fù)性。Cot曲線揭示了真核與原核基因組的一個(gè)很重要的區(qū)別：原核基因組主要有一個(gè)單一動(dòng)力學(xué)成分構(gòu)成，而真核基因組要復(fù)雜的多。

Figure2.20描述的是一種（理論上的）真核基因組的復(fù)性情況，始于Cot為10–4

終于Cot為104

，整個(gè)反應(yīng)分三個(gè)階段（以陰影框表示），各部分代表基因組中復(fù)性動(dòng)力學(xué)特征不同的各種成分：Figure2.20

快復(fù)性組分（fastcomponent）：是復(fù)性反應(yīng)中最早復(fù)性的部分。此例中，占基因組全部DNA的25%，Cot范圍10–4到~2×10–2，Cot1/2為0.0013。接下來是中間復(fù)性組分（intermediatecomponent）此例中，占總DNA的30%，Cot范圍~0.2到100，Cot1/2為1.9。最后復(fù)性的是慢復(fù)性組分（slowcomponent），此例中，占總DNA的45%，Cot范圍~100到~10,000，Cot1/2為630。為計(jì)算這些組分的復(fù)雜性，須把每種組分視為獨(dú)立的動(dòng)力學(xué)成分，與標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行比較。慢復(fù)性組分占總DNA的45%，所以在復(fù)性反應(yīng)中其濃度為測(cè)得的C0（相當(dāng)于反應(yīng)中的DNA總量）乘以0.45。則慢復(fù)性組分對(duì)應(yīng)的Cot1/2為283。如果在同樣條件下，E.coliDNA復(fù)性時(shí)Cot1/2為4.0，則慢復(fù)性組分的復(fù)雜性為3.0×108bp（=4.2×106×283/4）。同理，中間組分的復(fù)雜性為6×105bp，快復(fù)性組分復(fù)雜性為340bp。這為下列說法提供了數(shù)量方面的基礎(chǔ)：復(fù)性越快的成分，復(fù)雜性越低。反過來看，當(dāng)有三種DNA成分，每種都有單一序列構(gòu)成，長(zhǎng)度分別為340bp、6×105bp和3.0×108bp，按質(zhì)量比25:30:45混合后，每種成分會(huì)像單一組分那樣復(fù)性，這樣整個(gè)混合物復(fù)性時(shí)表現(xiàn)出Figure2.20所示整個(gè)基因組那樣的復(fù)性動(dòng)力學(xué)特征。慢復(fù)性組分的復(fù)雜性與它的物理意義上的大?。╬hysicalsize）對(duì)應(yīng)。通過化學(xué)分析方法可知，F(xiàn)igure2.20所示的基因組單倍體大小為7.0×108bp，則其45%為3.15×108bp，與復(fù)性動(dòng)力學(xué)測(cè)得值吻合（在實(shí)驗(yàn)允許的誤差范圍）。所以說，慢復(fù)性組分的復(fù)雜性與它的物理長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)。慢復(fù)性組分由基因組中的單一序列（uniquesequence）構(gòu)成，其每條單鏈只能與對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列復(fù)性。單一序列是原核DNA的唯一成分，是真核生物DNA的主要成分，稱作非重復(fù)DNA（nonrepetitiveDNA）。比非重復(fù)序列復(fù)性快的成分的本質(zhì)是什么呢？在Figure2.20中，中間復(fù)性成分占基因組的30%，其化學(xué)復(fù)雜長(zhǎng)度（chemicalcomplexity）為0.3×7×108=2.1×108bp。但動(dòng)力學(xué)復(fù)雜性只有6×105bp。

中間復(fù)性成分含有350個(gè)6×105bp的單一序列（因?yàn)?50×6×105=2.1×108），其中任何一個(gè)單一序列產(chǎn)生的單鏈都能與其它單一序列產(chǎn)生的單鏈復(fù)性，這有效地提高了參與反應(yīng)的序列的濃度，所以Cot1/2較低。在一個(gè)基因組中，拷貝數(shù)不止一個(gè)的序列稱作重復(fù)DNA（repetitiveDNA），每個(gè)基因組中的拷貝數(shù)稱作重復(fù)頻率（f,repetitionfrequency）。通常重復(fù)序列可分為兩類，大致對(duì)應(yīng)Figure2.20所示的中間復(fù)性組分和快復(fù)性組分：

中等重復(fù)序列（ModeratelyrepetitiveDNA）構(gòu)成中間復(fù)性組分，其Cot值通常在10–2和非重復(fù)序列的Cot之間。

高度重復(fù)序列（HighlyrepetitiveDNA）構(gòu)成快復(fù)性組分，在Cot值到達(dá)10–2之前復(fù)性。

重復(fù)序列的復(fù)性特征代表了一種可用于描述其序列的平均狀況，未必每個(gè)特定的拷貝都符合哪些特征。

Figure2.20所示的中度重復(fù)成分長(zhǎng)度6×105bp，重復(fù)~350次，不過，這些重復(fù)序列并不是一種，也不是連續(xù)不斷的，而是由多種更短的序列組成，這些序列加起來總長(zhǎng)度為6×105bp。這些序列散在于基因組，平均重復(fù)350次，不過，有的序列重復(fù)次數(shù)多一些，有的少一些。

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，配對(duì)堿基之間的氫鍵處于不斷的斷裂和再生的動(dòng)態(tài)平衡的過程中，這種現(xiàn)象稱DNA鏈的呼吸作用。富含AT的區(qū)段，呼吸作用更為明顯，常發(fā)生瞬間的單鏈泡狀結(jié)構(gòu)，利于特定蛋白識(shí)別鏈內(nèi)信息。甲醛變性實(shí)驗(yàn)證明DNA呼吸作用，因?yàn)榧兹┲荒芨杂砂被从场?.1.4.6DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的呼吸作用1.01.45A26024（小時(shí)）Figure2.21（節(jié)選自孫乃恩等《分子遺傳學(xué)》1.5）2.1.5超螺旋影響DNA結(jié)構(gòu)coilsuopercoil超螺旋是指在螺旋基礎(chǔ)上的螺旋。（Supercoilingmeansthecoilingofacoil.）2.1.5.1超螺旋（Supercoiling,superhelix）的特性Figure2.22超螺旋是DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)。

DNA以雙螺旋形式纏繞，每條單鏈沿軸盤繞。若螺旋軸進(jìn)一步圍繞自身盤繞，就形成DNA超螺旋。Figure2.23通常，DNA超螺旋反映結(jié)構(gòu)存在張力。如果DNA軸沒有自身纏繞，我們說它處于松弛狀態(tài)（relaxedstate）。Figure2.24Positivesupercoiled（以初級(jí)螺旋為右手螺旋的DNA為例）繩子的一端向緊纏方向（overwinding）捻轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，則會(huì)產(chǎn)生一個(gè)左旋的超螺旋以解除外加的捻轉(zhuǎn)造成的脅變。這樣產(chǎn)生的超螺旋叫做正超螺旋（positivesupercoil）。Figure2.25NegativeSupercoiled繩子的一端向松纏方向（underwinding）捻轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，則會(huì)產(chǎn)生一個(gè)右旋的超螺旋以解除外加的捻轉(zhuǎn)造成的脅變。這樣產(chǎn)生的超螺旋叫做負(fù)超螺旋（negativesupercoil）。Figure2.26對(duì)于右手螺旋DNA份子來說，如果每圈初級(jí)螺旋的堿基對(duì)數(shù)小于10.5，則二級(jí)結(jié)構(gòu)處于緊纏狀態(tài)，由此產(chǎn)生的超螺旋就是正超螺旋（左旋的）。如果每圈初級(jí)螺旋的堿基對(duì)數(shù)大于10.5，則二級(jí)結(jié)構(gòu)處于松纏狀態(tài)，由此產(chǎn)生的超螺旋就是負(fù)超螺旋（右旋的）?？梢?，超螺旋總是向著抵消初級(jí)螺旋改變的方向發(fā)展。超螺旋的描述:Lk=Tw+WrLk：

linkingnumber

（連環(huán)數(shù)），是DNA兩條鏈的相交總次數(shù)。習(xí)慣上，以右手雙螺旋的連接數(shù)為正值；Tw：twistingnumber（盤繞數(shù)），DNA分子中的初級(jí)螺旋數(shù)；Wr：writhingnumber（超螺旋數(shù)，擰數(shù)），直觀上為超螺旋數(shù)目；σ:specificlinkerdifference（比連環(huán)差），每圈初級(jí)螺旋的超螺旋數(shù)，對(duì)大多數(shù)生物而言，為-0.05，即每圈右手螺旋結(jié)構(gòu)就有0.05個(gè)負(fù)超螺旋。（反應(yīng)超螺旋的密度）以一個(gè)封閉環(huán)狀DNA分子為例：若無共價(jià)鍵斷裂，Lk不變，Tw和Wr卻可因環(huán)境的改變而改變。若一個(gè)DNA分子受到外加的斷裂-再連接作用比如拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用而Lk值發(fā)生改變時(shí)，這一改變可以歸納為Tw值得改變和Wr值的改變或者二者共同改變的結(jié)果。從螺旋變化的角度，上述兩種情況均可以表示為：△Lk=△Tw+△WrFigure2.27連環(huán)數(shù)描述環(huán)狀DNA分子。一個(gè)2100bp的封閉環(huán)狀DNA分子有三種狀態(tài)：(a)松弛型的，Lk=200；(b)松弛型的，但一條鏈上有一個(gè)切刻（nick），L不確定；(c)松纏兩圈的，Lk=198。松纏也能導(dǎo)致DNA兩鏈解離。Figure2.28負(fù)超螺旋和正超螺旋。松纏或緊纏兩圈（Lk=198或202）分別形成負(fù)超螺旋和正超螺旋。注意，在這兩種情況下，DNA軸自我纏繞的方向相反。

體內(nèi)環(huán)境傾向于維持初級(jí)螺旋10.5bp/turn的狀態(tài)。若在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄中生成緊纏（每圈小于10.5bp），為維持10.5bp/turn的狀態(tài)，即必須生成正超螺旋，即Wr改變，△Wr為正，相應(yīng)的△Lk也為正；反之，若體內(nèi)反應(yīng)過程中引起DNA松纏，則引入負(fù)超螺旋。無論是正超螺旋還是負(fù)超螺旋，都比松弛形式含有更多自由能，因此超螺旋的引入是一個(gè)耗能過程。超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的固有特性。在任何細(xì)胞中都存在，并受到嚴(yán)密調(diào)控。M未酶切酶切超螺旋線型開環(huán)型Figure2.30從E.coli提取的質(zhì)粒，主要以超螺旋形式存在。_+各種構(gòu)象的質(zhì)粒的遷移速率：超螺旋型>線型>開環(huán)型瓊脂糖凝膠電泳2.1.5.2超螺旋的作用Figure2.29

（幾乎）所有生物的DNA都有負(fù)超螺旋，細(xì)胞中DNA松纏程度為5%~7%，也就是說比連環(huán)差σ=-0.05~-0.07。在溶液中或細(xì)胞內(nèi)負(fù)超螺旋會(huì)部分地轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂溑轄罱Y(jié)構(gòu)，二者處于平衡狀態(tài)。所以這種單鏈泡狀結(jié)構(gòu)也是解除松纏造成的脅變作用的結(jié)果。富含ATFigure2.31因此，負(fù)超螺旋中的單鏈比例較其它任何雙鏈形式DNA都要大。在有蛋白質(zhì)分子與單鏈結(jié)合時(shí)，單鏈泡狀結(jié)構(gòu)變得比較穩(wěn)定。這種單鏈泡狀結(jié)構(gòu)，對(duì)于DNA復(fù)制、基因的轉(zhuǎn)錄以及DNA重組等過程的起始有重要作用，這可能就是生物體內(nèi)DNA總是采取負(fù)超螺旋的主要原因。此外，真核生物DNA要形成核小體，同樣也需要負(fù)超螺旋（因?yàn)镈NA以組蛋白八聚體作為支持物盤繞，所以形成的是左手螺旋方向的負(fù)超螺旋），所以，負(fù)超螺旋有利于DNA包裝為染色質(zhì)形式。（從另一個(gè)角度看，核小體對(duì)DNA維持一定程度的負(fù)超螺旋有重要作用。）2.1.5.3拓?fù)洚悩?gòu)酶引入或消除DNA中的超螺旋

DNA的拓?fù)渥兓蓭追N原因引起。如Figure2.32所示，復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、環(huán)狀DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)物的分離，DNA包裝成核小體時(shí)等。所有這些情況都需要拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerases）處理。Figure2.32摘譯自GENESIX19.13

拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠通過瞬時(shí)斷裂（transientlybreaking）DNA的一條或兩條鏈，并使未斷裂的鏈穿過斷口，再封閉斷口，從而催化DNA拓?fù)渥兓?。在這一過程中，斷鏈末端并不游離，而是與酶共價(jià)連接。拓?fù)洚悩?gòu)酶作用沒有序列特異性，但某些酶能參與位點(diǎn)特異重組，作用方式同上，所以也是拓?fù)洚悩?gòu)酶。根據(jù)催化反應(yīng)時(shí)的機(jī)制，拓?fù)洚悩?gòu)酶可劃分為：

I型（TypeI）拓?fù)洚悩?gòu)酶瞬時(shí)斷裂一條鏈；

II型瞬時(shí)斷裂兩條鏈。一般按引入的拓?fù)渥兓念愋蛣澐滞負(fù)洚悩?gòu)酶：

旋轉(zhuǎn)酶（促旋酶，gyrases），引入負(fù)超螺旋；反向旋轉(zhuǎn)酶（reversegyrases）引入正超螺旋。

E.coli中的拓?fù)洚悩?gòu)酶有四種：分別為拓?fù)洚悩?gòu)酶I、III、IV和旋轉(zhuǎn)酶，前兩者屬于I型，后兩者屬于II型。細(xì)菌中，旋轉(zhuǎn)酶引入超螺旋，拓?fù)洚悩?gòu)酶I、IV消除超螺旋，負(fù)超螺旋總體水平就是這兩種作用平衡的結(jié)果。這是類核的重要特征，對(duì)在某些啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄具有重要影響。解決轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的超螺旋問題，同樣需要這些酶。旋轉(zhuǎn)酶把聚合酶前面生成的正超螺旋轉(zhuǎn)換成負(fù)超螺旋；拓?fù)洚悩?gòu)酶I、IV消除位于聚合酶后面的負(fù)超螺旋。與此類似，復(fù)制時(shí)亦有類似的作用，只是更復(fù)雜些。環(huán)狀分子復(fù)制，兩個(gè)子代分子會(huì)形成環(huán)連分子，環(huán)連分子由拓?fù)洚悩?gòu)酶IV消除。Figure2.32局部1環(huán)連分子（鏈狀分子）Figure2.32局部2

真核生物中，拓?fù)洚悩?gòu)酶的基本功能類似于原核生物。多數(shù)真核生物含有單一的拓?fù)洚悩?gòu)酶I，是復(fù)制叉移動(dòng)和消除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的超螺旋所必需的；在復(fù)制后染色體分離時(shí)需要拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性；在重組和修復(fù)時(shí)會(huì)涉及其它的拓?fù)洚悩?gòu)酶活性。拓?fù)洚悩?gòu)酶的共同特性體現(xiàn)在把斷裂形成的末端連接到酶分子的酪氨酸殘基。I型酶連接斷裂單鏈的一個(gè)末端；II型酶連接斷裂雙鏈中每條單鏈的一個(gè)末端。這樣，磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)至蛋白分子，調(diào)整DNA結(jié)構(gòu)后，再連接到原來的鏈上，完成拓?fù)鋵W(xué)的變化（兼具內(nèi)切酶和連接酶功能，且兩個(gè)反應(yīng)偶聯(lián)；改變連環(huán)數(shù)）。據(jù)被連接到酪氨酸上的磷酸基團(tuán)的特性，拓?fù)洚悩?gòu)酶又可分為A、B兩類。

E.coli的拓?fù)洚悩?gòu)酶均為A類，連接時(shí)使用5’磷酸基團(tuán)，細(xì)菌多數(shù)如此，幾乎沒有B類。真核生物中IA、IB、IIA和IIB均有發(fā)現(xiàn)。2.1.5.4拓?fù)洚悩?gòu)酶斷裂和封閉核酸鏈（催化機(jī)制）摘譯自GENESIX19.14右圖為拓?fù)洚悩?gòu)酶IA的作用方式。酶結(jié)合于雙鏈DNA解鏈的區(qū)域，切斷一條鏈，并使另一條鏈從斷口穿過，最后封閉斷口。無需能量輸入。每次反應(yīng)使連環(huán)數(shù)改變1，如圖顯示，單鏈每穿越一次斷口，連環(huán)數(shù)就增加一個(gè)。在一個(gè)游離的超螺旋分子中，W和T之間能相互轉(zhuǎn)換的特性使連環(huán)數(shù)的變化最終體現(xiàn)在了超螺旋數(shù)的變化上，即ΔW=+1（負(fù)超螺旋減少一圈）。Figure2.33消除負(fù)超螺旋

II型拓?fù)洚悩?gòu)酶通常對(duì)正超螺旋與負(fù)超螺旋均有作用。每次催化反應(yīng)需要1個(gè)ATP。如Figure2.34所示，一條DNA雙鏈被斷裂，產(chǎn)生4個(gè)堿基突出的末端，二聚體的酶分子的每個(gè)亞基結(jié)合每個(gè)末端的突出部分，然后另一條雙鏈分子穿過斷口，最后利用ATP，連接末端，釋放產(chǎn)物。所以抑制ATPase活性會(huì)生成包含斷鏈的“cleavablecomplex”。Figure2.34

拓?fù)洚悩?gòu)酶II每次改變底物分子的兩個(gè)連環(huán)數(shù)。其活性亦能生成或消除環(huán)連分子和打結(jié)分子。水解ATP生成的能量可能是驅(qū)動(dòng)酶的構(gòu)象改變，從而帶動(dòng)DNA雙鏈穿過斷口。

細(xì)菌的旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）屬于II型拓?fù)洚悩?gòu)酶，能夠向松弛型的閉合環(huán)狀分子引入負(fù)超螺旋，可以向同一個(gè)分子連續(xù)引入負(fù)超螺旋。每個(gè)旋轉(zhuǎn)酶分子每分鐘能引入~100個(gè)負(fù)超螺旋。需ATP供能，如無ATP，則只能消除負(fù)超螺旋，但速度較慢。

E.Coli的旋轉(zhuǎn)酶是一個(gè)四聚體，包括兩類亞基，抑制這兩類亞基的抗生素（最常用的是nalidixicacid，可抑制GyrA，novabiocin可抑制GyrB），能夠抑制復(fù)制過程，表明DNA合成依賴旋轉(zhuǎn)酶。2.1.5.5旋轉(zhuǎn)酶通過螺旋反轉(zhuǎn)行使功能摘譯自GENESIX19.15符號(hào)倒轉(zhuǎn)模型（signinversion）：酶分子結(jié)合DNA，使之呈相當(dāng)于正超螺旋的交叉構(gòu)型，這引起未被結(jié)合的DNA區(qū)域代償性地形成一個(gè)負(fù)超螺旋。再由酶在正超螺旋的交叉處斷裂雙鏈，使另一鏈穿過斷口，再封閉切口，實(shí)現(xiàn)超螺旋由正到負(fù)的轉(zhuǎn)換。每次反應(yīng)時(shí)連環(huán)數(shù)減少2（引入兩個(gè)負(fù)超螺旋）。Figure2.35—+——

旋轉(zhuǎn)酶釋放形成的負(fù)超螺旋在DNA分子上重新分布，引起T和或W的變化。同時(shí)下一輪反應(yīng)重新開始。相同的拓?fù)浞磻?yīng)在環(huán)連分子和打結(jié)分子的形成時(shí)亦存在。

ATP可能幫助酶分子恢復(fù)構(gòu)象（酶周轉(zhuǎn)，enzymeturnover），以進(jìn)行下一輪反應(yīng)，不能被水解的ATP類似物，不能抑制第一輪反應(yīng)，但可抑制第二輪反應(yīng)。拓?fù)洚悩?gòu)酶or溴化乙錠負(fù)超螺旋松弛DNA正超螺旋除拓?fù)洚悩?gòu)酶外，能夠嵌入堿基片層之間的試劑，特別是一些片狀染料分子，比如DNA電泳時(shí)用于染色的溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）也能改變DNA的拓?fù)錉顟B(tài)，所以EB是致癌物質(zhì)。Figure2.362.1.5.6某些片狀染料分子可改變DNA拓?fù)錉顟B(tài)拓?fù)洚悩?gòu)酶or溴化乙錠DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（DNATOPOLOGY）

DNA的結(jié)構(gòu)很靈活，其分子結(jié)構(gòu)的參數(shù)受周圍離子環(huán)境影響，也受DNA上所結(jié)合蛋白的性質(zhì)影響。

DNA線性分子（linearDNA）由于末端是游離的，所以分子能夠自由旋轉(zhuǎn)（rotate），以適應(yīng)雙螺旋的兩條單鏈相互纏繞次數(shù)的變化。附：摘譯自Watsonetal.<Molecularbiologyofthegenes>5/EChapter6但是，如果兩端共價(jià)連接起來成環(huán)狀DNA分子（circularDNA），而且兩鏈的磷酸-核糖骨架上沒有斷裂處，那么，兩鏈相互纏繞的絕對(duì)次數(shù)就不會(huì)發(fā)生改變。這樣一種共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA分子（covalentlyclosed,circularDNA,cccDNA）就是拓?fù)涫`狀態(tài)的（topologicallyconstrained）。即使真核生物染色體這樣的線性DNA分子也處于拓?fù)涫`狀態(tài)，這是因?yàn)樗L(zhǎng)，又呈染色質(zhì)形式，而且與細(xì)胞內(nèi)其它成分相互作用。盡管有這些束縛作用，DNA還是要參與細(xì)胞內(nèi)各種動(dòng)態(tài)的過程（dynamicprocess）。比如，在DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，或作為模版轉(zhuǎn)錄出RNA時(shí)，雙螺旋中相互纏繞的兩鏈必須迅速解開。所以了解DNA的拓?fù)涮匦裕约凹?xì)胞在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及其它的涉及染色體的活動(dòng)中是如何適應(yīng)和利用拓?fù)涫`作用的，是分子生物學(xué)一個(gè)重要的基礎(chǔ)內(nèi)容。一、cccDNA的連環(huán)數(shù)這一拓?fù)涮匦允遣蛔兊?/p>

（LinkingnumberisaninvarianttopologicalpropertyofcovalentlyclosedcircularDNA）我們來看一看cccDNA的拓?fù)涮匦?。由于兩條多核苷酸鏈上都沒有斷裂處，所以這兩條單鏈要彼此分開，就必須發(fā)生共價(jià)鍵斷裂。若想分離這兩條環(huán)狀單鏈，而又不一直斷裂骨架上的某個(gè)共價(jià)鍵，就必須把一條單鏈反復(fù)穿過另一條。在兩鏈完全分離的過程中，一條單鏈必須反復(fù)穿過另一條單鏈的次數(shù)稱作連環(huán)數(shù)（linkingnumber），見FigureS2-1。連環(huán)數(shù)一般總是整數(shù)（integer），對(duì)cccDNA分子而言，不管因形變而有多少種形狀（只要不發(fā)生共價(jià)鍵斷裂），連環(huán)數(shù)這一拓?fù)涮匦允遣蛔兊摹igureS2-1cccDNA分子的拓?fù)錉顟B(tài)。圖中顯示松弛狀態(tài)（a）向負(fù)超螺旋狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。超螺旋的張力可以被進(jìn)一步纏繞（supertwisting）吸收（b），也可被局部解鏈吸收（c）。連環(huán)數(shù)由兩個(gè)幾何分量（geometriccomponents）——盤繞數(shù)（twist）和超螺旋數(shù)（writhe）——組成。先來看盤繞數(shù)。盤繞數(shù)就是一條單鏈圍繞另一條單鏈的螺旋圈數(shù)，也即一條鏈完全盤繞另一條的次數(shù)。試以平鋪的cccDNA分子為例，在這樣的平面構(gòu)象中，連環(huán)數(shù)完全由盤繞數(shù)構(gòu)成。確實(shí)，數(shù)一數(shù)兩條單鏈互相鏈繞的次數(shù)就很容易地確定盤繞數(shù)（FigureS2-1a）。螺旋交叉（盤繞）以右手方向?yàn)檎?，所以DNA的盤繞數(shù)是正值。二、連環(huán)數(shù)由盤繞數(shù)和超螺旋數(shù)組成（Linkingnumberiscomposedoftwistandwrithe）但cccDNA分子一般不是平鋪的，而通常是具有扭轉(zhuǎn)應(yīng)力的（torsionallystressed），所以雙螺旋的長(zhǎng)軸在三維空間內(nèi)會(huì)自身纏繞（crossover,交叉），且往往重復(fù)多次地纏繞，如FigureS2-1b所示。這種現(xiàn)象稱作writhe。想象電話聽筒連線的過渡纏繞，可以想見扭轉(zhuǎn)應(yīng)力引起的形變。

writhe有兩種形式。一種是interwound或plectonemic（具絞旋線的）writhe，DNA長(zhǎng)軸圍繞自身纏繞，如FigureS2-1b和FigureS2-2a所示；另一種是toriod或spiral（螺旋形的），長(zhǎng)軸按cyclindrical形式纏繞，通常DNA圍繞蛋白時(shí)是這種形式（FigureS2-2b）。writhemumber（擰數(shù)，超螺旋數(shù)）是指cccDNA分子interwoundwrithe或spiralwrithe的總次數(shù)。比如FigureS2-1b所示分子的擰數(shù)為4。FigureS2-2超螺旋中的writhe的兩種形式。長(zhǎng)度相同的cccDNA的interwound形式（a）和spiral形式（b）。（a）所示為雙螺旋分子進(jìn)一步自身盤繞形成。（b）為一個(gè)cyclindricalcoils。從拓?fù)鋵W(xué)角度看，interwoundwrithe和spiralwrithe。是等同的，同時(shí)，這兩種幾何特性彼此之間的轉(zhuǎn)換也很容易。而且twist與writhe之間也能相互轉(zhuǎn)換（interconvertible）。一個(gè)cccDNA分子很容易就能通過形變把twist轉(zhuǎn)換成writhe，或反之，并且不斷裂任何的共價(jià)鍵。唯一的限制就是twistnumber（Tw）和writhenumber（Wr）之和必須等于連環(huán)數(shù)（Lk）：

Lk=Tw+Wr三、LkO是完全松弛型cccDNA分子在生理?xiàng)l件下的連環(huán)數(shù)（LkOisthelinkingnumberoffullyrelaxedcccDNAunderphysiologicalconditions）現(xiàn)在來分析不含超螺旋的cccDNA分子（即松弛型的），其盤繞狀況與生理?xiàng)l件下的溶液中B-型DNA是對(duì)應(yīng)的（每圈螺旋約10.5個(gè)堿基對(duì)）。這種cccDNA分子在生理?xiàng)l件下的連環(huán)數(shù)記作LkO

。這種分子的連環(huán)數(shù)就是堿基對(duì)數(shù)目除以10.5。比如一個(gè)10,500bp的cccDNA，連環(huán)數(shù)為+1,000（由于DNA按右手方向盤繞，所以符號(hào)為正）?？梢赃@樣想象，這個(gè)10,500bp的cccDNA分子的一條單鏈?zhǔn)且粋€(gè)平鋪的環(huán)，另一條單鏈圍繞這個(gè)環(huán)1,000次。如果一個(gè)cccDNA分子不是松弛型的，那怎樣才能去除它的超螺旋呢？一個(gè)方法是使用DNaseI溫和地處理，使每個(gè)分子平均有一個(gè)（或很少幾個(gè)）磷酸二酯鍵斷裂。一旦DNA上出現(xiàn)這樣的切刻（nick），就不再受拓?fù)涫`，單鏈可自由旋轉(zhuǎn)，writhe就會(huì)消散（FigureS2-3）。FigureS2-3DNaseI可使DNA變得松弛。如果切刻隨后得到修復(fù)，那么變成松弛型，平均連環(huán)數(shù)Lk等于LkO（由于切刻修復(fù)時(shí)，單鏈旋轉(zhuǎn)次數(shù)的波動(dòng)性，生成的cccDNA分子中有的連環(huán)數(shù)可能大于LkO，有的可能小于LkO，所以這個(gè)處理形成的Lk有一個(gè)較窄的波動(dòng)范圍，但平均值Lk等于LkO）。四、細(xì)胞中的DNA是負(fù)超螺旋形式的DNAincellsisnegativleysupercoiled超螺旋的程度可通過Lk與LkO之間的差來衡量，這個(gè)差稱為linkingdifference(連環(huán)差):

ΔLk=Lk－LkO

。

如果cccDNA的ΔLk明顯不等于零，說明DNA具有扭曲張力，因而是超螺旋的。若Lk＜

LkO，ΔLk＜0，DNA處于負(fù)超螺旋狀態(tài)；反之，Lk＞

LkO，ΔLk＞0，DNA處于正超螺旋狀態(tài)。

比如FigureS2-1b所示分子是負(fù)超螺旋的，連環(huán)差為-4，因?yàn)槠溥B環(huán)數(shù)是32，比FigureS2-1a所示松弛型分子的連環(huán)數(shù)36少4。Lk和LkO都依賴于DNA分子長(zhǎng)度，所以對(duì)超螺旋程度進(jìn)行歸一化處理后，更為方便（比較）。用σ表示超螺旋密度：σ=ΔLk/LkO。

從細(xì)菌和真核生物中純化的環(huán)狀DNA分子通常都是負(fù)超螺旋形式的，σ值約為-0.06。Figure

S2-4

給出的電鏡圖比較了噬菌體DNA的松弛型和超螺旋形式的結(jié)構(gòu)。FigureS2-4噬菌體PM2的DNA電鏡圖。上圖為松弛形式，下圖為超螺旋形式。

（生物保持一定程度的）超螺旋密度的生物學(xué)意義是什么呢？可以這樣認(rèn)為，負(fù)超螺旋儲(chǔ)存了一定的自由能，有助于那些需要兩鏈解離的過程，比如DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。由于Lk=Tw+Wr，負(fù)超螺旋能夠轉(zhuǎn)換成雙螺旋兩鏈解離（見FigureS2-1b和c），因而，負(fù)超螺旋區(qū)域有部分解鏈的傾向。所以，負(fù)超螺旋形式的DNA比松弛形式的DNA更易解鏈。

已知的具有正超螺旋的生物是一些嗜熱生物（thermophiles），是一些生活在極端高溫條件下比如溫泉的生物。在這種情況下，正超螺旋儲(chǔ)存一定的自由能，防止DNA在高溫下解鏈變性。在這種情況下，由于正超螺旋可以轉(zhuǎn)換為更多的兩鏈盤繞（正超螺旋可以視為緊纏），因此，兩鏈解離時(shí)，嗜熱生物的DNA比（普通生物中）負(fù)超螺旋DNA需要更多的能量。五、真核生物中核小體引入負(fù)超螺旋Nucleosomesintroducenegativesupercoilingineukaryotes后面將會(huì)講到，真核細(xì)胞的核內(nèi)DNA是包裝成小顆粒形式，這就是核小體（nucleosome）——雙螺旋DNA在蛋白構(gòu)成的核心上纏繞近兩圈。這種纏繞是toriod或spiral（螺旋形的）式的，而且左手螺旋形式。左手spiral形式的writhe相當(dāng)于負(fù)超螺旋。所以，DNA包裝成核小體是引入了負(fù)超螺旋。六、拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠松弛超螺旋DNATopoisomerasesDNAcanrelaxsupercoiledDNA我們已經(jīng)知道，DNA處在拓?fù)涫`狀態(tài)時(shí)，其連環(huán)數(shù)是不變的；只有在斷裂磷酸核糖骨架時(shí)才能改變。一類被稱作拓?fù)洚悩?gòu)酶的酶類能夠通過在單鏈或雙鏈瞬時(shí)引入斷裂，改變連環(huán)數(shù)。拓?fù)洚悩?gòu)酶分作兩大類：

II型拓?fù)洚悩?gòu)酶每次作用能使連環(huán)數(shù)改變2。它瞬時(shí)斷裂DNA雙鏈，并使未斷裂的DNA穿過斷口，然后封閉斷口，如FigureS2-5。II型拓?fù)洚悩?gòu)酶需要ATP水解供能。FigureS2-5與II型拓?fù)洚悩?gòu)酶不同，I型拓?fù)洚悩?gòu)酶每次作用能使連環(huán)數(shù)改變1。它瞬時(shí)斷裂DNA單鏈，并使未斷裂的DNA穿過切刻，然后封閉切刻，如FigureS2-6。不同與II型拓?fù)洚悩?gòu)酶，I型拓?fù)洚悩?gòu)酶作用不需要ATP供能。FigureS2-62.2.1原核生物與真核生物（prokaryotesandeukaryotes）生物界的細(xì)胞可分為兩類：原核細(xì)胞與真核細(xì)胞。2.2染色體摘譯自Lodishetal.MolecularCellBiology(5/E)1.1；節(jié)選自孫乃恩等《分子遺傳學(xué)》2.1類核Figure2.37E.coli薄切片的電鏡圖。含有DNA的類核沒有膜。E.coli和其它的一些細(xì)菌是兩層膜，這兩層膜由周質(zhì)空間（periplasmicspace）隔開，胞壁較薄，緊鄰內(nèi)膜。

原核細(xì)胞（prokaryoticcell）是一個(gè)由質(zhì)膜圍成的封閉區(qū)室（compartment），沒有細(xì)胞核，內(nèi)部結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。

所有原核生物都是這類細(xì)胞。細(xì)菌——種類最多的原核細(xì)胞——都是單細(xì)胞的；藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)綠藻類）有時(shí)為單細(xì)胞，有時(shí)為多細(xì)胞（canbeunicellularorfilamentouschainsofcells.）。盡管細(xì)菌細(xì)胞不具有由膜包圍成的區(qū)室結(jié)構(gòu)，但許多蛋白在胞質(zhì)中是精確定位的，表明細(xì)菌是有內(nèi)部組織方式的。一個(gè)E.coli的干重約為25×10-14g。就一個(gè)普通體重的人來說，細(xì)菌約占

1–1.5kg。地球上細(xì)菌的數(shù)目約為5×1030，有1012kg。在海洋7英里深處、40英里的高空都有細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)，它們具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力！細(xì)菌中儲(chǔ)藏的碳幾乎與植物中相當(dāng)。Figure2.38大腸桿菌

真核細(xì)胞（eukaryoticcells）與原核細(xì)胞不同，它具有膜圍成的細(xì)胞核和大量的內(nèi)膜系統(tǒng)構(gòu)成的區(qū)室——細(xì)胞器。Figure2.39白細(xì)胞的電鏡圖。細(xì)胞由一層膜（palsmamemberane）包裹；細(xì)胞內(nèi)是許多由膜圍成的區(qū)室（細(xì)胞器）。真核細(xì)胞的特征是細(xì)胞的DNA被隔離在雙層膜形成的細(xì)胞核內(nèi)，其外膜與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（蛋白裝配的場(chǎng)所）相連續(xù)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)真核細(xì)胞大小一般為10–100μm，比細(xì)菌大得多。一個(gè)典型的人成纖維細(xì)胞（fibroblast）（一種結(jié)締組織細(xì)胞）大小約15μm，體積和干重都是E.coil細(xì)胞的幾千倍。阿米巴蟲（一種單細(xì)胞原生動(dòng)物）0.5mm長(zhǎng)；鴕鳥卵最初也是肉眼可見的一個(gè)細(xì)胞。

真核生物包括所有的植物和動(dòng)物，包括真菌（fungi）（有多細(xì)胞的如霉菌和單細(xì)胞的如酵母），還包括原生動(dòng)物（protozoans，均是單細(xì)胞的）。Figure2.40（體外培養(yǎng)的）小鼠的成纖維細(xì)胞NIH3T3。由于所有細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和分子都具有極大的相似性，推測(cè)所有細(xì)胞由一個(gè)共同的祖先進(jìn)化而來。近些年，對(duì)各種原核生物的DNA序列更為詳細(xì)的研究揭示，原核可分為兩類：即所謂的真細(xì)菌（eubacteria）和古細(xì)菌（archaea,archaebacteria或archaeans）。具有的相似基因越多，有機(jī)體之間的親緣關(guān)系越近，基于這樣的假設(shè)，研究人員繪制了進(jìn)化譜系樹（evolutionarylineagetree）。根據(jù)進(jìn)化樹，古細(xì)菌和真核生物的分離發(fā)生在它們與真細(xì)菌分離之后。真細(xì)菌真核生物古細(xì)菌Figure2.41從簡(jiǎn)單的細(xì)菌到復(fù)雜的哺乳動(dòng)物可能都是由一個(gè)共同的單細(xì)胞祖先進(jìn)化而來。

許多古細(xì)菌生長(zhǎng)在不同尋常的甚至極端的環(huán)境中，這樣的環(huán)境可能更類似地球上最初出現(xiàn)生命時(shí)的狀況，比如，嗜鹽菌（halophiles）需要在高鹽濃度環(huán)境才能生存；嗜酸嗜熱菌（thermoacidophiles）生長(zhǎng)在的80℃含硫溫泉，環(huán)境pH往往小于2。還有一些古細(xì)菌生長(zhǎng)在缺氧的環(huán)境，能夠利用水和二氧化碳產(chǎn)生甲烷。原核生物（Prokaryotes）細(xì)胞內(nèi)沒有真正的細(xì)胞核，遺傳物質(zhì)存在于整個(gè)細(xì)胞之中，有時(shí)雖然有相對(duì)集中的核區(qū)，但并無核膜圍繞。

其遺傳物質(zhì)以裸露的核酸分子存在，雖與少量蛋白結(jié)合，但不能形成染色體結(jié)構(gòu)。習(xí)慣上，也稱其為染色體。真核生物（Eukaryotes）由真核細(xì)胞構(gòu)成的生物叫真核生物。真核細(xì)胞（Eukaryoticcell）遺傳物質(zhì)在有膜包圍的細(xì)胞核中，并與特定的蛋白質(zhì)相結(jié)合，經(jīng)過一定的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成染色體；發(fā)達(dá)的細(xì)胞內(nèi)膜形成了許多功能區(qū)隔。區(qū)別原核細(xì)胞真核細(xì)胞大小細(xì)胞核染色體形狀數(shù)目

1組成DNA序列基因表達(dá)細(xì)胞分裂內(nèi)膜鞭毛構(gòu)成光合與呼吸酶分布核糖體營(yíng)養(yǎng)方式細(xì)胞壁1-10μm10-100μm無核膜包圍，稱為擬核有雙層的核膜環(huán)狀DNA分子線性DNA分子＞1DNA裸露或結(jié)合少量蛋白質(zhì)DNA同組蛋白和非組蛋白結(jié)合無或很少有重復(fù)序列有重復(fù)序列RNA和蛋白質(zhì)在同一區(qū)間合成RNA在核中合成和加工；蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中合成二分或出芽有絲分裂和減數(shù)分裂，少數(shù)出芽生殖。無獨(dú)立的內(nèi)膜有，分化成各種細(xì)胞器鞭毛蛋白微管蛋白質(zhì)膜線粒體和葉綠體70S(50S+30S)80S(60S+40S)吸收，光合作用，內(nèi)吞吸收，有的行光合作用肽聚糖，蛋白質(zhì)，脂多糖，脂蛋白纖維素（植物細(xì)胞）Table2.2原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的區(qū)別

原核生物與真核生物的劃分在分子生物學(xué)上十分重要，因?yàn)樗鼈冞z傳信息的表達(dá)存在很大差異。單細(xì)胞的酵母菌與單細(xì)胞的大腸桿菌的蛋白合成機(jī)制迥異，而是與復(fù)雜的高等生物相似，因?yàn)榻湍妇钦婧松?。切相關(guān)，噬菌體適應(yīng)原核生物的遺傳策略，病毒使用真核生物的遺傳法則。Figure2.42

噬菌體（Phage）和病毒（Virus）等有機(jī)體，既不是原核生物也不是真核生物，以超分子的亞生命形式存在，其繁殖必須在寄主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，所以其遺傳機(jī)制與寄主密2.2.2關(guān)于染色體的引言譯自GENESIX28.1;GENESX9.1

細(xì)胞遺傳物質(zhì)的組織有一個(gè)顯著的基本原則：以一種致密狀態(tài)存在于一個(gè)限定的空間內(nèi)，其各種活動(dòng)，比如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄必須在此空間內(nèi)完成，其組織特性必須適應(yīng)遺傳物質(zhì)的活性和非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)換。

核酸的這種致密狀態(tài)源于它與堿性蛋白的結(jié)合，這些蛋白的正電荷中和了核酸的負(fù)電荷。這種核蛋白（nucleoprotein）的結(jié)構(gòu)由蛋白與DNA（或RNA）的相互作用（interaction）決定。

把DNA包裝進(jìn)噬菌體、病毒、細(xì)菌和真核細(xì)胞核時(shí)存在一個(gè)共同問題，若分子呈伸展?fàn)顟B(tài)，有限的空間無法容納，因而必須緊密壓縮。所以與習(xí)見的DNA伸展?fàn)顟B(tài)的圖像不同，DNA無一例外地都要發(fā)生彎曲或折疊等結(jié)構(gòu)上的形變，形成緊湊形式。核酸長(zhǎng)度與其所在區(qū)室大小的差異見Table2.3。噬菌體或病毒的基因組，不論是單鏈還是雙鏈，也無論是DNA還是RNA，都充分填滿了其所在區(qū)域（桿狀或球狀）。Table2.3

Thelengthofnucleicacidismuchgreaterthanthedimensionsofthesurroundingcompartment.腺病毒線粒體對(duì)于細(xì)菌或真核細(xì)胞區(qū)室而言，因?yàn)镈NA存在于一個(gè)只占區(qū)室一部分的致密區(qū)域，所以核酸長(zhǎng)度與其所在區(qū)室大小的差異不太容易計(jì)算。遺傳物質(zhì)在細(xì)菌以類核形式，在真核細(xì)胞核以染色質(zhì)團(tuán)塊形式（細(xì)胞分裂間期），或以最為致密的染色體形式存在（細(xì)胞有絲分裂時(shí)）。

DNA在這些區(qū)域的密度很高，細(xì)菌中約為10mg/ml，在真核細(xì)胞核約為~100mg/ml，在T4噬菌體（phage）約為>500mg/ml，溶液中這樣的密度相當(dāng)于非常粘稠的凝膠，我們并不能確知其生理意義，比如對(duì)于蛋白發(fā)現(xiàn)其在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)有何作用。染色質(zhì)包裝形式靈活，在真核細(xì)胞周期有變化。有絲或減數(shù)）分裂時(shí)，包裝變得更致密，各條染色體變得可識(shí)別。描述DNA總的壓縮情況的參數(shù)是包裝比（packingratio），即DNA長(zhǎng)度除以包裝單位的長(zhǎng)度。比如人類最小的染色體有~4.6×107bp，其DNA伸展時(shí)相當(dāng)于14,000μm（=1.4cm），有絲分裂時(shí)包裝最為致密，長(zhǎng)約~2μm，所以包裝比達(dá)7000。由于染色質(zhì)整體結(jié)構(gòu)往往無定型，所以包裝比并不能精確的計(jì)算，但通?？砂慈旧w長(zhǎng)度的5-10倍計(jì)算染色質(zhì)的長(zhǎng)度，所以染色質(zhì)的包裝比約為1000-2000。

關(guān)于高級(jí)包裝的特異性（thespecificityofhigher-orderpackaging）這一主要問題尚無明確解釋。DNA是折疊成一個(gè)特定樣式，還是基因組中（染色體的）各個(gè)拷貝有所不同？當(dāng)一段DNA進(jìn)行復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)包裝模式如何變化？2.2.3

病毒基因組包裝在核衣殼內(nèi)

譯自GENESIX28.2;GENESX9.2從具體序列的包裝角度而言，細(xì)胞基因組和病毒有一個(gè)重要區(qū)別。細(xì)胞基因組的大小基本不確定，具體序列的數(shù)目、位置都能因復(fù)制、刪除和重排而變化。所以要求有一種通用的方法包裝其DNA，才能對(duì)序列的總量和定位不敏感。與此相反，有兩個(gè)條件限制了病毒的包裝：被包裝的核酸的數(shù)量已由基因組大小決定；而且，必須包裝進(jìn)由病毒基因編碼的蛋白組裝成的衣殼。病毒粒子看似簡(jiǎn)單，其基因組被包裝在一個(gè)對(duì)稱或近似對(duì)稱的衣殼，衣殼有一種或幾種蛋白構(gòu)成。感染所需的其它裝置（structure）附著于衣殼或位于衣殼內(nèi)。

病毒粒子結(jié)構(gòu)緊密，內(nèi)部空間略大于基因組所占空間，一般差距不超過兩倍，常常是僅夠容納基因組。

病毒最為極端的形式是衣殼只能由病毒基因編碼的蛋白構(gòu)成，這意味著這個(gè)外殼僅有一種亞基組成。同種亞基組裝成封閉結(jié)構(gòu)，只能形成兩種形式中的一種：蛋白亞基按螺旋上升模式順序疊加成纖維狀或桿狀；或形成類似球狀的二十面體對(duì)稱的球面體。有些病毒衣殼由不止一種蛋白構(gòu)成，盡管細(xì)微結(jié)構(gòu)變化，但形成結(jié)構(gòu)仍是上述兩類。

組裝容納核酸的衣殼的方案有兩種：

蛋白圍繞核酸，在組裝過程中通過蛋白與核酸的相互作用來壓縮DNA或RNA?；蛘咭職び善錁?gòu)成成分先形成空殼，然后再注入核酸，注入時(shí)被壓縮。

對(duì)于RNA病毒來說，衣殼的組裝是圍繞單鏈RNA分子進(jìn)行的。組裝的原則是RNA的位置直接取決于對(duì)衣殼蛋白的結(jié)合。最為明確的例子是煙草花葉病毒（TMV,tobaccomosaicviru