食品中微生物數(shù)量的檢測技術與指示菌類

第六章食品中微生物數(shù)量的檢測技術與指示菌類一、食品中的菌數(shù)檢測技術及其新進展二、指示菌類三、其他菌類數(shù)量的檢測方法第一節(jié)食品中的菌數(shù)檢測方法及其新進展一、顯微鏡直接計數(shù)法二、平皿菌落總數(shù)測定法三、最近似數(shù)測定法四、復原實驗法五、其它方法<中華人民共和國食品衛(wèi)生法>第四條指出：“食品該當無毒、無害，符合該當有的營養(yǎng)要求，具有相應的色、香、味等感官性狀〞。這一條就明確地規(guī)定了食品的衛(wèi)生要求。食品的衛(wèi)生要求檢測食品中微生物數(shù)量的衛(wèi)生學意義：可作為食品被微生物污染程度的標志〔或食品清潔形狀的標志〕。預測食品儲存期限〔保質(zhì)期〕。食品中細菌總數(shù)還能反映食品的新穎程度、能否發(fā)生蛻變。理想情況：理想的檢測方法是對一切食品都適用，并在短時間內(nèi)獲得準確結(jié)果。實踐上：至今還沒有一種通用的方法能準確測出食品中的實踐活菌數(shù)，都有一定的誤差、適用范圍和優(yōu)缺陷。一、顯微鏡直接計數(shù)法〔DMC〕1、直接涂片計數(shù)法〔1〕操作方法將0.01mL經(jīng)適當稀釋的樣品均勻涂布于載玻片上的1cm2面積的方格內(nèi)，經(jīng)枯燥、固定、革蘭氏染色后，用顯微鏡察看計數(shù)。在計數(shù)前先用物鏡測微尺測出油鏡視野的直徑，再察看計算10~15個視野的細菌總數(shù)，求出平均數(shù)。r——顯微鏡油鏡視野的半徑〔mm〕B——稀釋倍數(shù)涂片：接種環(huán)，挑取菌落，生理鹽水一滴，涂勻熱固定：經(jīng)過火焰假設干次初染：結(jié)晶紫一滴，1min，水洗媒染：碘液一滴，1min，水洗脫色：95%乙醇，約30s復染：復紅一滴，30s〔2〕特點操作簡便、快捷不能區(qū)分活菌與死菌，計數(shù)結(jié)果偏高，只適用于菌數(shù)較高的樣品只適用于計數(shù)單細胞的微生物2、血球計數(shù)板計數(shù)法將適當稀釋的樣品注入血球板的計數(shù)室中。由于計數(shù)室的容積是知的〔0.1mm3〕，計算一定微小體積內(nèi)的菌數(shù)，即可計算出每克或每毫升樣品中的菌數(shù)。菌體細胞數(shù)〔cfu/ml〕=小格內(nèi)平均菌體細胞數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)特點操作簡便、快速，可在非常鐘內(nèi)得到結(jié)果。待測標本未經(jīng)火焰固定殺死細胞，故所測結(jié)果為活菌數(shù)。此法適用于計數(shù)單細胞的酵母菌。二、平皿菌落總數(shù)測定法〔SPC〕平皿菌落總數(shù)測定法是最常用的一種活菌計數(shù)法，也是我國衛(wèi)生規(guī)范規(guī)定的公認可行的方法，因此又稱規(guī)范平皿活菌計數(shù)法。菌落總數(shù)：食品檢樣經(jīng)過處置，在一定條件下〔如培基基、培育溫度和培育時間等〕培育后，所得每g〔mL〕檢樣中構(gòu)成的微生物菌落總數(shù)。只包括一群在平板技術瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫需氧或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)不等于細菌總數(shù)。CFU：菌落構(gòu)成單位國標〔GB〕規(guī)定：在需氧條件下：細菌：PCA36±1℃48h霉菌、酵母：PDA或孟加拉紅培育基28±1℃5d酵母菌、霉菌在孟加拉紅培育基上典型特征菌落總數(shù)的測定

－－平板菌落計數(shù)法程序菌落計數(shù)選擇2～3個適當稀釋度懸液各1ml，加入無菌空培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做2～3個培養(yǎng)皿用生理鹽水進行無菌稀釋，做成幾個適當稀釋倍數(shù)的懸液每個培養(yǎng)皿中傾注約15ml熔化并冷卻到46℃左右的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，冷卻后，于37℃培養(yǎng)48h被檢樣品報告結(jié)果〔一〕樣品采集1、采樣原那么：確定性、隨機性、代表性、無菌操作、原始性2、采樣方法：無菌操作，分類操作有包裝食品應采用完好的未開封的樣品粉末狀樣品邊混合邊取樣液體樣品振搖均勻取樣冷凍樣品堅持冷凍形狀非冷凍樣品保管在0~5℃3、采樣數(shù)量和部位：〔1〕即食類預包裝食品：取一樣批次最小零售原包裝〔2〕非即食類預包裝食品：<500g或500mL取一樣批次最小零售原包裝>500mL液態(tài)食品混勻后，從一樣批次的不同容器中取≥5倍檢驗單位樣品>500g固體食品從同一包裝的不同部位分別取樣〔3〕散裝或現(xiàn)場制造食品根據(jù)食品不同類別和性質(zhì)，取≥5倍檢驗單位樣品4、采樣標志：及時、準確、明晰填寫采樣單〔包括采樣人、采樣地點、時間、樣品稱號、來源、批號、數(shù)量、保管條件等信息〕。5、采樣的儲存和運輸：應在接近原溫條件下盡快送檢，并堅持樣品完好。如不能及時運送，應在接近原溫條件下儲存。代表單位〔章〕代表單位〔章〕簽字簽字日期年月日日期年月日×××××采樣單〔二〕送檢仔細核對登記樣品信息應按要求盡快檢驗。如不能及時檢驗，應采取必要措施堅持樣品原有形狀冷凍食品45℃以下不超越15分鐘，或2~5℃不超越18h解凍后檢驗不得參與防腐劑保管〔三〕樣品的處置和稀釋1〕取樣無菌操作25g〔mL〕放入225mL無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中〔1:10稀釋液〕2〕均勻混合無菌均質(zhì)杯8000~10000r/min均質(zhì)1~2min，或用拍擊式均質(zhì)器拍打1~2min3〕稀釋4〕傾注平板稀釋液移入平皿后，將46℃左右的平板計數(shù)瓊脂培育基注入平皿約15ml，轉(zhuǎn)動平皿。5〕倒置培育瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板細菌：普通食品36±1℃48h水產(chǎn)品30±1℃72h霉菌：28±1℃5d〔四〕菌落計數(shù)法肉眼察看〔直接、放大鏡〕利用自動影像分析菌落計數(shù)儀10-1均數(shù)10-2均數(shù)描述最終結(jié)果25536均在30~300間則按計數(shù)公式2.6×103多不可計345各平板均>300，取稀釋度最高者報告，余計為多不可數(shù)3.5×104122均小于30則取稀釋度最低者報告1.2×10233029所有平板均不在30~300CFU且一部分<30或>300者以最接近30或300者報告2.9×10300所有平板均無菌落則記為<

1乘以最低稀釋倍數(shù)報告<1×10即<

10結(jié)果表述〔五〕菌落計數(shù)的報告報告單位：cfu/g(mL)1、平板菌落數(shù)的選擇：30~300cfu2、菌落數(shù)的計算：3、菌落數(shù)的報告：低于30時按實數(shù)報告100cfu以內(nèi)時按四舍五入修約，采用兩位有效數(shù)字報告≥100時第三位數(shù)四舍五入修約，取前兩位數(shù)字例：205043→210000or2.1×105先倒平板，待其凝固后，汲取0.1ml稀釋液于平板外表上，用無菌玻璃刮鏟在整個平板上均勻涂布，培育察看。涂布平板法涂布法的優(yōu)缺陷可檢測到熱敏性菌株菌落形狀比較明顯更適宜于嚴厲的好氧菌沒有傾注法簡便，易呵斥機械損傷三、最近似數(shù)測定法

〔mostprobablenumberMPN〕對未知樣品做延續(xù)的10倍稀釋，選擇3個延續(xù)的10倍稀釋液，每種稀釋液接種3管〔5管〕裝有培育基的試管中培育，根據(jù)實驗結(jié)果查MPN檢索表，得到樣品中微生物的數(shù)量。根據(jù)經(jīng)確證后的對應濃度陽性管數(shù)查MPN表MPN：最能夠數(shù)，基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法陽性管數(shù)MPN95%可信限0.100.010.001下限上限000<3.0-9.50013.00.159.61003.60.1718333>1100420-MPN的優(yōu)點：操作簡便與SPC相比，類似率較高采用選擇性培育基可檢測特殊微生物菌群特別適用于檢測食品內(nèi)含菌量較少的樣品MPN的缺陷：需求大量的玻璃器皿不能察看微生物菌落形狀要留意嚴厲的無菌操作食品冷飲大腸菌群檢驗紙片

冷飲、乳制品和調(diào)味品等大腸菌群的測定餐具大腸菌快速檢驗紙片

餐具衛(wèi)生消毒效果檢測四、復原實驗法一種估計活性微生物數(shù)量的方法原理：微生物細胞在進展生物代謝的氧化復原過程中，有的被氧化，有的被復原，測定復原才干即可推測樣品內(nèi)的菌數(shù)。某些指示劑和色素可反映這個變化，這些成分的復原時間同細菌數(shù)量成反比。三種染料：美藍：美藍〔藍色〕無色刃天青：刃天青〔藍色〕粉紅色或無色紅四氮唑〔TTC〕：紅四氮唑〔無色〕粉色或紅色美藍復原實驗表美藍褪色時間估計每毫升樣品中的細菌總數(shù)鮮乳的質(zhì)量20min內(nèi)20000000以上很差20min至2h4000000~20000000差~較差2h至5.5h500000~4000000一般~較好~好5.5h以上500000以下很好美藍：美藍〔藍色〕無色韌天青復原實驗表級別鮮乳的質(zhì)量乳的顏色相當于每毫升牛乳中的細菌總數(shù)經(jīng)20min經(jīng)60min1良好青藍色青藍色小于50萬2合格青藍色藍紫色50~400萬3不好青藍色或粉藍色粉紅色400~2000萬4很壞白色白色大于2000萬刃天青：刃天青〔藍色〕粉紅色或無色顯色形狀判別規(guī)范顯色狀態(tài)判斷顯色狀態(tài)判斷未顯色者陽性微紅色者可疑桃紅色-紅色陰性紅四氮唑〔TTC〕：紅四氮唑〔無色〕粉色或紅色運用及優(yōu)、缺陷：運用：乳品工業(yè)上原料乳中的微生物檢測優(yōu)點：簡便、快捷、經(jīng)濟缺陷：所得結(jié)果不夠準確不適用于含有復原性酶的食品五、濁度丈量法原理利用濁度計或分光光度計測定培育液中微生物的生長量。當某一波長的光線經(jīng)過混濁的液體后，光的強度被減弱。由于菌體不透光，在一定濃度范圍內(nèi)，懸液中單細胞的數(shù)量與光密度〔OD值〕成正比。當細菌濃度到達107個/ml時，培育基會渾濁優(yōu)點：樣品數(shù)量較多時，此法與SPC方法相比省時省力。缺陷：假設樣品顏色較深或含有固體顆粒時，不宜采用。菌數(shù)測定方法直接法間接法顯微鏡直接計數(shù)法平板菌落總數(shù)測定法復原實驗法最近似數(shù)測定法濁度丈量法ATP生物發(fā)光法實驗測定法電阻抗丈量法放射丈量法但至今沒有一種常用的方法能準確測出食品中的實踐活菌數(shù)，也沒有一種方法對一切的食品都適用。第二節(jié)指示菌類普通情況下，假設要直接檢查食品中的病原菌困難較大實際中，常用某些指示菌類的方法來評定食品的衛(wèi)生質(zhì)量闡明食品被糞便污染和病原菌存在的指示菌應具備的特征：指示菌必需與腸道致病菌親密相關；指示菌對不良要素的抵抗力與病原菌大致一樣；指示菌與病原菌繁衍速度大致一樣；培育、分別、鑒定方法簡便，容易檢驗1、大腸菌群〔coliforms〕衛(wèi)生細菌領域用語與糞便污染有關的細菌定義：一群在一定培育條件下可發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。典型大腸桿菌為糞便近期污染的標志其它菌屬那么為糞便陳舊污染的標志ETECEIEC陰溝腸桿菌EHEC大腸菌群耐熱大腸菌群〔糞大腸菌群〕大腸桿菌產(chǎn)氣克雷白氏菌大腸埃希氏菌檸檬酸桿菌O157：H72、大腸菌群的食品衛(wèi)生學意義作為食品被糞便污染的指示菌MPN值愈低那么闡明食品受糞便污染程度及對人體安康危害程度愈低作為食品被腸道致病菌污染的指示菌大腸菌群數(shù)量越多那么腸道致病菌存在的能夠性就越高，但兩者之間并不總是呈平行關系要求食品中大腸菌群完全不存在是不能夠的，重要的是其污染程度即菌量3、大腸菌群檢測方法與檢測結(jié)果檢測方法：MPN計數(shù)法：LST發(fā)酵實驗BGLB發(fā)酵證明實驗平板計數(shù)法：VRBA平板計數(shù)BGLB發(fā)酵證明實驗見GB/T4789.3-2021檢測結(jié)果：用每1mL(g)樣品中大腸菌群最近似數(shù)來表示，簡稱大腸菌群MPN。LST發(fā)酵實驗BGLBVRBA平板第三節(jié)其他菌類數(shù)量的檢測方法一、嗜冷菌數(shù)量測定采用SPC法，在7℃培育10d察看肉眼可見菌適用