生物化學 第2章 蛋白質(zhì)(2)課件

(protein)(2)

氨基酸與蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)（四）毛細管電泳

毛細管電泳技術(shù)是將養(yǎng)品點在裝有凝膠的、直徑為20-75μm內(nèi)經(jīng)的毛細管里，進行電泳。優(yōu)點是分辨率高、、樣品需要量小。電泳速度快、上樣和分離物的檢測都能夠進行自動化操作。因為毛細管散熱性能好，允許使用很高的電壓進行電泳。除分離檢測蛋白質(zhì)外，在核酸的序列分析中使用較為普遍。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)

（五）電泳后的蛋白質(zhì)檢測：

考馬斯亮藍染色是常用的一項電泳染色方法,是根據(jù)考馬斯亮藍能與蛋白質(zhì)多肽鏈定量結(jié)合的原理而建立起的。對于一個混合蛋白質(zhì)的電泳分離來說,它只能檢測樣品的分離情況；如果被檢蛋白質(zhì)的位置可以確定,可以將該蛋白質(zhì)的色帶切下之后進行脫色,測定脫色液光吸收值,能對該蛋白質(zhì)進行定量分析。

生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)活性染色：

根據(jù)有活性的目標蛋白質(zhì)特有的生物化學反應產(chǎn)生的有色物質(zhì)或另外加入某種能與產(chǎn)物生成顏色的物質(zhì)來進行檢測的.活性染色可以從一個復雜的蛋白質(zhì)樣品中檢測到目標蛋白出現(xiàn)的位置。活性染色法在同工酶(例如酯酶同工酶、谷氨酸脫氫酶同工酶、谷氨酰胺合成酶同工酶等)的檢測中非常有用。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)

免疫印跡(Immunoblotting)或蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)是檢測目標蛋白質(zhì)的一項十分有效的方法。一種蛋白質(zhì)(抗原)能與它產(chǎn)生的抗體專一地反應。在電泳之后,欲檢測目標蛋白的存在,可以先將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,然后用目標蛋白產(chǎn)生的抗體與之產(chǎn)生抗原-抗體反應,最后可用連接有堿性磷酸酯酶或辣根過氧化酶的第二抗體(通用抗體)與第一抗體反應,加入能與抗體共接的酶反應生成有色物質(zhì)的生色液,即可十分可靠地檢到的目標蛋白。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)七蛋白質(zhì)的沉降作用及超離心分離

沉降速度(ν=dx/dt)與蛋白質(zhì)分子的大小和密度有關。沉降速度法，適用于分離沉降系數(shù)不同但密度相近的蛋白質(zhì)。沉降平衡法，適用于沉降系數(shù)相近，但密度不同的蛋白質(zhì)。沉降系數(shù)：當沉降界面以恒定的速度移動時，單位離心場里的沉降速度。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)用離心法分離細胞亞微結(jié)構(gòu)

差異（速）離心：用不同的離心速度、依據(jù)被分離物的大小而將細胞亞結(jié)構(gòu)彼此分離的效果。

速度區(qū)帶離心：將樣品鋪在稀的蔗糖溶液的頂層，溶液不用于分離而用以抗對流作用，離心完成后，細胞各成分以其大小不同而在離心管中呈區(qū)帶分布，若離心時間太長，或離心力過大，細胞各成分都會沉降至管底，而達不到分離效果。

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600g,3min.上清6000g,8min.上清40000g.30min.上清100000g.90min.上清沉淀：細胞核沉淀：線粒體，葉綠體，溶酶體，過氧化酶體沉淀：細胞質(zhì)膜，高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的碎片沉淀：核糖體亞基細胞液差異（速）離心法生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)

平衡密度梯度離心：用不同的離心速度、依據(jù)被分離物的密度而進行分離的效果；通常是將沒有純化的物質(zhì)鋪在密度溶液（如蔗糖溶液，氯化銫溶液為介質(zhì)，離心管內(nèi)的溶液密度從底部到頂部是濃至稀的梯度）的頂層，通過離心（160000g，3h）細胞內(nèi)各成分不停地下沉分別達到與溶液的密度相等時的位置。其介質(zhì)的密度范圍寬于被分離組分的密度。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)差異（速）離心與平衡密度梯度離心法生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)

第五節(jié)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)和測定

（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)概述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次：

一級結(jié)構(gòu)(primarystructure)：多肽鏈內(nèi)氨基酸殘基從N端到C端的排列順序，或稱氨基酸序列。

二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）：多肽鏈主鏈不同肽段沿主軸盤旋折疊而形成的空間結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象單元。主要有α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲。

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三級結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）：多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)基礎上進一步卷曲折疊，即整個肽鏈（亞基）的空間形狀。三級結(jié)構(gòu)指的是處于充分折疊、具有生物學活性的一個完整的球蛋白的三維結(jié)構(gòu)，。

四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）：寡聚蛋白質(zhì)分子亞基之間的相互關系和空間位置。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)蛋白質(zhì)測序的一般步驟：

首先目標蛋白質(zhì)分離純化得到高度純凈的蛋白質(zhì)樣品。

（1）

測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目，末端分析，分析多肽鏈的N末端和C末端。（2）

拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈。斷裂鏈內(nèi)二硫鍵。（3）測定多肽鏈的氨基酸組成，酸水解或堿水解。（4）

多肽鏈部分裂解成肽段，專一性酶解。（5）

測定各個肽段的氨基酸順序。（6）

確定肽段在多肽鏈中的順序。（7）

確定多肽鏈中二硫鍵的位置。

二蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)

目標蛋白質(zhì)的分離純化程序主要包括:

1材料的選擇；

2組織勻漿和破碎細胞獲取粗提取液；

3蛋白質(zhì)初步提純；

4選擇一種或幾種合適的方法除去雜蛋白,直至完全純化；

5目標蛋白的鑒定。用于研究目的蛋白質(zhì)通常應保持它的生物活性。因此，在目標蛋白質(zhì)的整個分離純化過程中要在較低溫度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白質(zhì)降解的酶)的抑制劑，避免使用劇烈條件，以免蛋白質(zhì)特定的折疊結(jié)構(gòu)受到破壞。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)（一）氨基酸的組成分析蛋白質(zhì)在標準條件下經(jīng)酸水解后,進行氨基酸的組成分析.通過組成分析基本上可推測出部分水解所產(chǎn)生的肽碎片的數(shù)目。（二）末端分析(確定蛋白質(zhì)的肽鏈組成)：通常測定肽鏈的N-末端.二硝基氟苯(DNFB)法或丹磺酰氯（DNS-Cl）法是常用的方法。丹磺酰氯為一種更有效的試劑，靈敏度比DNFB法高100倍。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)丹磺酰氯分析多肽鏈的N－末端生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)水解多肽確定氨基酸組成確定N末端的氨基酸殘基苯異硫氰酸酯（PITC）Edman試劑確定N末端的氨基酸殘基剩下的多肽可以再利用。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)（三）拆開鏈間或鏈內(nèi)的二硫鍵

（1)還原法：用巰基乙醇(HSCH2CH2OH)或二硫蘇糖醇等還原性試劑使二硫鍵打開，還原生成-SH。

（2)氧化法：常用過甲酸(CHOOOH)作為氧化劑，使二硫鍵氧生成半胱氨磺酸(磺基丙氨酸殘基)

。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)（四）肽鏈的部分水解

常用胰蛋白酶法,胰凝乳蛋白酶法和溴化氰法等方法。下面是一個典型的多肽，用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶

(糜蛋白酶)和溴化氰分別處理所得到的結(jié)果：↓

↓

↓

↓

↓

↓

Ala—Arg—Arg—Met—Phe—Ala—Lys—Asp--Phe--Leu--Lys

胰酶處理：凝乳蛋白酶處理：溴化氰處理：

Ala-ArgAla-Arg-Arg-Met-PheAla-Arg-Arg-MetArgAla-Lys-Asp-PhePhe-Ala-Lys-Asp-Phe-Leu-LysAsp-Phe-Leu-LysLeu-LysMet-Phe-Ala-Lys生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)過甲酸巰基乙醇碘乙酸生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)酶法裂解胰蛋白酶R1=Lys或Arg（高度專一,水解速度快）

R2=Pro不能水解胰凝乳蛋白酶R1=Tyr、Trp、Phe（水解速度快）；

Leu、Met或His（水解速度緩慢）

R2=Pro不能水解胃蛋白酶R1和R2=Phe、Trp、Try、Leu和其它疏水性氨基酸。嗜熱菌蛋白酶R2=LeuIlePhe、Trp、TryVal或Met

R2=Pro或Gly不能水解Pro蛋白酶Pro——X

溴化氰：R1=Met（高度專一,水解速度快）生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)（五）肽碎片的氨基酸順序分析：

Edman降解法：專用試劑是苯異硫氰酸。

羧肽酶法：羧肽酶A：從C-末端依次降解末端殘基，含芳香環(huán)的或脂肪烴基較大的殘基易被水解。但該酶不能水解C-末端的Arg、Lys

和Pro。羧肽酶B能專門水解C-末端的Arg

和Lys，對其它殘基不起作用。如果C-末端第二個殘基是Pro，則酶A和酶B都不起作用。羧肽酶C能水解C-末端的Pro.

（六）片斷重疊確定整個肽鏈的氨基酸順序：胰酶：Ala-ArgArgMet-Phe--Ala-LysAsp-Phe--Leu-Lys糜酶：Ala-Arg—Arg--Met-PheAla-Lys—Asp-PheLeu-Lys全順序Ala-Arg—Arg--Met-Phe--Ala-Lys—Asp-Phe--Leu-Lys生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)例：用胰蛋白酶處理某多肽后獲得一個七肽（非羧基端肽）。這個七肽經(jīng)鹽酸完全水解后獲得Met、Glu、Phe、Ala、Pro、Lys、各1mol。該肽與二硝基氟苯反應后用鹽酸水解不能得到任何α－DNP－氨基酸。該肽用羧肽酸B處理不能得到任何更小的肽。該肽用CNBr處理得到一個四肽和一個三肽，四肽經(jīng)酸水解后得到Met、Phe和Glu。這個七肽經(jīng)糜蛋白酶處理也得到一個三肽和一個四肽，四肽的氨基酸組成是Ala、Met、Pro和Lys。根據(jù)上述信息確定這個七肽的氨基酸順序。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)1胰蛋白酶作用某肽得到非羧基端肽，說明這個肽段的羧基端殘基是賴氨酸。七肽經(jīng)酸水解得到Met、Glu、Phe、Ala、Pro、Lys、各1mol，說明Trp被破壞。2該肽與DNFB反應后，酸水解得不到任何DNP-aa.說明該肽的N端為Trp。3羧肽酶B作用，不能得到更小的肽說明，C端倒數(shù)第二個為Pro。

Trp--------------------Pro-Lys4溴化氰作用得到四肽，Met，Phe和Glu，說明四肽為Trp-（Glu，Phe）-Met

三肽為Ala-Pro-Lys5胰凝乳蛋白酶處理得到三肽和四肽，四肽為Ala，Met，Pro，Lys。顯然三肽的順序為Trp-Glu-Phe，四肽的順序為Met-Ala-Pro-Lys七肽的順序為：Trp-Glu-Phe-Met-Ala-Pro-Lys生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)（七）間接方法測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)：測定蛋白質(zhì)基因的順序可推測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)。由于近年來DNA的序列測定相對比較容易，采用測定編碼該蛋白質(zhì)的基因序列來推斷蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，這種方法適用于組織中含量低純化比較困難的蛋白質(zhì)，其前提條件就是要能夠得到編碼該蛋白質(zhì)的基因。（八）數(shù)據(jù)庫提供不同蛋白質(zhì)順序的信息在測定一種蛋白質(zhì)的氨基酸順序后，按照慣例該蛋白質(zhì)的順序信息就進入到數(shù)據(jù)庫中這些數(shù)據(jù)以及其它更專門化的內(nèi)容可經(jīng)WorldWideWeb訪問，從而了解到你所需要的有關數(shù)據(jù)。生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)三蛋白質(zhì)與生物進化

（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與生物進化以胰島素和細胞色素c為例說明。示出了細胞色素c種系發(fā)生樹。

1序列比較提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的信息同源蛋白質(zhì)(homologousproteins)進化上相關的蛋白質(zhì)，換句話說，來源不同的同一種蛋白質(zhì)，例如細胞色素C、胰島素，在不同生物體內(nèi)存在的的同一種蛋白質(zhì)。

生物化學第2章蛋白質(zhì)(2)2序列比較揭示進化上的關系細胞色素c存在所有需氧生物種類的細胞中，該蛋白質(zhì)在分子水平上提供了從進化