橙皮中黃酮類化合物的提取研究

畢業(yè)論文題目名稱：橙皮中黃酮類化合物的提取研究學(xué)生姓名：院(系)：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)班級：指導(dǎo)教師：輔導(dǎo)教師：時(shí)間：目錄TOC\o"1-2"\h\z\u畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）任務(wù) Ⅰ開題報(bào)告 Ⅱ指導(dǎo)教師評審意見 Ⅲ評閱老師評語 Ⅳ答辯會議記錄 Ⅴ中文摘要 Ⅵ英文摘要 Ⅶ1前言 11.1黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)簡介 11.2黃酮類化合物的生物活性 21.3黃酮類化合物的提取和測定方法的研究現(xiàn)狀 41.4國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢 51.5本課題研究的目的和意義 62材料與方法 72.1試驗(yàn)材料及藥品 72.2試驗(yàn)主要儀器及設(shè)備 72.3試驗(yàn)方法 73結(jié)果與分析 83.1單因素實(shí)驗(yàn) 83.2黃酮提取工藝中影響因素的正交試驗(yàn) 124討論與結(jié)論 14參考文獻(xiàn) 14致謝 16橙皮中黃酮類化合物的提取研究[摘要]我國擁有豐富的柑橘資源，橘皮作為柑橘主要的副產(chǎn)物，約占果中的20%。本文主要以橙皮為原料，研究堿液提取黃酮類化合物的最佳工藝。通過單因素實(shí)驗(yàn)，考查浸泡時(shí)間、提取液pH、固液質(zhì)量比、超聲處理時(shí)間對黃酮得率的影響。單因素實(shí)驗(yàn)中各個(gè)因素的最優(yōu)條件范圍分別為22.5倍原料干重提取液，pH為11.0左右的石灰水，常溫侵泡9h后，超聲處理15min。連續(xù)提取3次，提取液需要用鹽酸調(diào)節(jié)pH8.0-9.0長時(shí)間靜置使溶解的果膠以果膠酸鈣的形式沉淀，在過濾出去。然后再4000rpm下離心20min，大孔樹脂吸附，分別取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2mL提取液經(jīng)NaNO-Al(NO)3顯色后，在波長510nm下測吸光度。并選用L(3)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果：最佳提取工藝為，浸泡時(shí)間8h、提取液pH為11.0、提取液體積45ml、超聲處理時(shí)間15min時(shí)，黃酮提取率最高，為3.586%。影響黃酮提取率的最主要因子是提取液pH，最次要因子是超聲處理時(shí)間。即黃酮的提取工藝影響程度為提取液pH>固液質(zhì)量比>浸泡時(shí)間>超聲處理時(shí)間。[關(guān)鍵詞]橙皮，黃酮類化合物，提取，超聲處理ToextractflavonoidsfromtheorangepeeloftheresearchStudent:Xujiangyan,CollegeofLifeScience,YangtzeUniversityTutor:SunWeiqing,CollegeofLifeScience,YangtzeUniversity[abstract]Ourcountryisrichincitrusresources,orangepeelasmainbyproductofcitrus,accountsforabout20%ofthefruit.Inthisstudy,lyewithorangepeelasrawmaterials,andoptimumprocessofextractingflavonoidsflavonoidspurificationresearch.Throughsinglefactorexperiment,thetestofsoakingtime,extractingliquidph,massratioofsolidandliquid,ultrasonictreatmenttimeontheyieldofflavonefromimpact.Themethodtoextractthebesttechnologyoforangepeelmediumyellowketonesubstanceis22.5timesthedryweightofextractrawmaterials,phofaround11.0limewater,coldinvasionbubbleafter10h,ultrasonictreatmentfor15min.Extracting3timesinarow,extractwithhydrochloricacidtoadjustpH8.09.0letstandforalongtimemakesdissolvedinpectinprecipitationintheformofpecticacidcalcium,thefilteredout.Getcontentinabout50%ofthecrudeproducts,rawandthendissolvedin50%isopropylalcohol0.1mol/LNaOHfilter,byuv-spectrophotometertomeasuretheabsorbancemeasurement,todeterminethebestextractionprocess.Orthogonalexperimentresults,Optimumextractionprocessfor,soaktime8h,extractpH11.0,fluidvolume45mlofextraction,ultrasonicprocessingtimeis15min.IsthemostimportantfactoraffectingflavonoidsextractionyieldofextractpH,thesecondaryisultrasonicprocessingtime.theextractionprocessofflavonoidsinfluencedegreeforthequalityofextractpH>solid-liquidratio>soakingtime>ultrasonicprocessingtime.[keywords]OrangepeelflavonoidsextractUltrasonicprocessing前言第1頁（共16頁）橙皮中黃酮類化合物的提取研究1前言1.1黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)概述黃酮類化合物是柑橘皮中含有的一類重要生物活性物質(zhì)。柑橘中鑒定出來的黃酮類化合物有60余種，其主要成分是黃烷酮、黃酮，黃酮醇，它們大多以糖苷的形式存在。常見的有柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、蕓香苷等二氫黃酮類。1.1.1黃酮類物質(zhì)的來源黃酮類化合物廣泛存在于植物的所有部分，包括根、莖、心材、樹皮、葉、花、果實(shí)中。黃酮類化合物大多存在于一些有色植物中，如在甘草油性提取物、洋蔥提取物、柑橘皮提取物、松樹提取物、綠茶提取物、銀杏葉提取物、紅花提取物中都發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物的存在,許多藥食兩用的植物中也存在多種的黃酮類化合物。我們?nèi)粘z取的食物中亦含有黃酮類化合物，下列食物中的含量較為豐富：洋蔥、楊梅、芹菜、韭菜、洋蔥、茶葉、番茄、蜂蜜、蘋果、葡萄、蕎麥葉、柑橘和檸檬、櫻桃、青椒、可可豆、紅葡萄酒等。1.1.2黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分類黃酮類化合物是植物光合作用產(chǎn)生的一類重要的天然有機(jī)化合物，泛指由兩個(gè)苯環(huán)(A環(huán)和B環(huán))通過三個(gè)碳鏈相互連接而成的一系列化合物(C6-C3-C6)。根據(jù)中央三碳的氧化程度，B環(huán)連接位置，以及三碳鏈?zhǔn)欠駱?gòu)成環(huán)狀等特點(diǎn)，可將主要的天然黃酮類化合物分類，分別是黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類、二氫黃酮醇類、花色素類等。1.1.3黃酮類物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)（1）黃酮類化合物的形態(tài)黃酮類化合物多數(shù)為結(jié)晶性固體，少數(shù)為無定型粉末。（2）黃酮類化合物的顏色在通常情況下，黃酮、黃酮醇及其苷類多呈灰黃至黃色，查耳酮為黃至橙黃色，橙皮中黃酮類化合物的提取研究第2頁（共16頁）而二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮類，因在分子結(jié)構(gòu)中不存在交叉共扼體系，故不呈黃色，幾乎為無色?；ㄉ厮@的顏色，隨pH不同而改變，一般pH小于7顯紅色，pH等于8.5顯紫色，pH大于8.5顯藍(lán)色。（3）黃酮類化合物的存在形式植物中的黃酮類化合物多以苷類形式存在，并且由于糖的種類、數(shù)量、連結(jié)位置及連接方式不同，可以組成各種各樣的黃酮苷類。（4）黃酮類化合物的溶解性一般黃酮游離苷元難溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑和稀堿溶液中。黃酮類化合物的羥基被糖苷化后，水溶性增加，脂溶性降低，易溶于熱水、甲醇、乙醇和稀堿溶液中，而難溶或不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等有機(jī)溶劑中，糖鏈越長，則水溶性越大。（5）黃酮類化合物的酸堿性黃酮類化合物因分子具有酚羥基，故顯酸性，可溶于堿性水溶液、吡啶中。同時(shí)其分子中Y-吡喃酮環(huán)上的1-氧原子，因有未共用電子對，故表現(xiàn)出微弱的堿性，可與強(qiáng)無機(jī)酸、生成鹽類，該鹽極不穩(wěn)定，加水后即分解。（6）黃酮類化合物的顯色反應(yīng)黃酮類物質(zhì)具有一些特征的顯色反應(yīng):如鹽酸一鎂粉，氨水反應(yīng)，結(jié)構(gòu)中帶有3-OH.5-OH或鄰位羥基的黃酮類化合物，均能與金屬鹽類試劑如鋁鹽、鎂鹽、鐵鹽等形成顏色較深的絡(luò)合物。各種黃酮類物質(zhì)的顏色反應(yīng)1.2黃酮類化合物的生物活性黃酮類化合物廣泛存在于牧草、水果、蔬菜和藥用植物中,植物長期自又選擇過程中產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物。迄今為止,在植物中已發(fā)現(xiàn)近10000種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的黃酮類化合物。黃酮類化合物不僅結(jié)構(gòu)樣多,且不同類型的還表現(xiàn)出了不同的生物功能和活性。（1）抗氧化自由基作用老年性癡呆、震顫麻痹癥、人類心腦血管疾病、腫瘤、老年性癡呆等疾病幾乎都與氧自由基有關(guān)。合成的傳統(tǒng)抗氧化劑有一定的毒性,可導(dǎo)致癌癥、畸形，國外開始禁止使用一些合成抗氧化劑。而黃酮類化合物因其抗氧化活性強(qiáng)，毒副作用低，在自前言第3頁（共16頁）然界分布廣現(xiàn)備受關(guān)注。黃酮化合物的抗氧化作用。表現(xiàn)以下幾個(gè)方面:清除超氧化物、清除羥基自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、清除自由基。它的經(jīng)基自由基清除能力由其結(jié)構(gòu)所決定。（2）抗炎、抗過敏、抗菌、抗病毒活性生物類黃酮具有抗炎、抗過敏作用，抗炎機(jī)制可能在于其抑制了前列腺素(PG)生物合成過程中的脂氧化酶(LOX)，抗過敏機(jī)制可能不在于其改善靶器官和細(xì)胞的反應(yīng)性，也不在于其競爭靶細(xì)胞受體從而拮抗生物活性物質(zhì)，而可能在于其抑制抗原的結(jié)合或在抑制介質(zhì)釋放等環(huán)節(jié)上產(chǎn)生效應(yīng)，臨床上常用生物類黃酮藥物治療膿腫、潰瘍和過敏等癥。生物類黃酮還有抗菌、抗病毒活性，槲皮素、鼠李素、黃芩苷、木犀草素和石吊藍(lán)苷等有抗菌活性，二氫槲皮素、山萘酚有抗病毒的活性，甘草查爾酮對HIV病毒有一定的抑制作用。紅薯莖葉黃酮提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀桿菌、葡枝根霉和黑曲霉的有明顯的抑制效果（3）護(hù)肝活性黃酮類化合物課調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)。保護(hù)細(xì)胞和護(hù)肝解毒的作用。其護(hù)肝機(jī)理,與黃酮類化合物的膜穩(wěn)定作用可能有關(guān),因?yàn)樗苡行У匾种茩C(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),從而起到了解毒護(hù)肝的作用。（4）黃酮類化合物和維生素C在生物學(xué)系統(tǒng)中存在著相互作用的關(guān)系。如黃酮類化合物可以作為維生素C的抗氧化劑。植物黃酮類化合物可以顯著地推遲維生素C被氧化成脫氫抗壞血酸的過程。其保護(hù)維生素C的作用機(jī)理主要為:①具有游離基受體的作用,和游離基結(jié)合,維生素C的氧化得到抑制。②可以和銅及其它微量金屬發(fā)生螯合反應(yīng),繼而延緩金屬催化的維生素C的氧化反應(yīng)，對維生素C在生理學(xué)上的作用主要表現(xiàn)在:①促進(jìn)維生素C的吸收，②促進(jìn)維生素C的穩(wěn)定，③阻止維生素C被氧化，④減少維生素C的代謝。（5）雌激素作用黃酮類化合物具有雌性激素的興奮和抑制雙重效應(yīng)。興奮機(jī)制在于生物黃酮類化合物與雌激素受體的親和性，雌激素樣作用強(qiáng)度與親和力強(qiáng)度相一致；抑制機(jī)制可能除了與雌激素受體有關(guān)外，還與子宮組織中的一種過氧化酶(該酶濃度隨雌激素的加入而升高)有關(guān)，它直接抑制了多種酶活性。此外，黃酮類化合物與生長因子一樣有促進(jìn)生長的作用，它通過控制促性腺激素的釋放或促性腺作用，阻礙雌激素代謝，提橙皮中黃酮類化合物的提取研究第4頁（共16頁）高雌激素活性等途徑加快子宮的生長，從三葉草、大豆中得到的黃酮具有雌激素樣作用。（6）抗癌活性黃酮類化合物主要通過3個(gè)途徑達(dá)到抗癌、防癌作用，即抗自由基作用、直接抑制癌細(xì)胞生長和對抗致癌因子。致癌因子使體內(nèi)產(chǎn)生自由基，并以自由基的形式富集于脂質(zhì)細(xì)胞膜的周圍，引起脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞的DNA而致癌，黃酮類化合物是自由基碎滅劑和抗氧化劑，能有效阻止脂質(zhì)過氧化引起的細(xì)胞破壞，起到抗癌、防癌的作用。牡荊素、桑色素、兒茶素和黃柏素具有較強(qiáng)的抗腫瘤和抗癌活性。特別是近年來,植物黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用引世人矚目。掀起了開發(fā)的熱潮,隨著對它研究工作的不斷深入,研發(fā)出了一大批黃酮類藥物。分子結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,作用位點(diǎn)較多,因而對一些病癥的選擇性和針對性缺乏,從而延緩了黃酮類藥物的進(jìn)一步開發(fā)和利用。因此,利用多學(xué)科交叉的優(yōu)勢,從大自然植物中不斷尋找探索新作用機(jī)制的黃酮或新結(jié)構(gòu)類型先導(dǎo)物,加強(qiáng)研究弄清其構(gòu)效關(guān)系。再對先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造、結(jié)構(gòu)優(yōu)化或人工合成,使其具有高效性和針對性,必將對新藥的幵發(fā)產(chǎn)生非常重大的影響。1.3黃酮類化合物的提取和測定方法的研究現(xiàn)狀1.3.1黃酮類化合物的提取方法（1）溶劑提取法目前國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道最多的黃酮提取法是在常壓下用索氏提取器，常用的溶劑為乙醇或丙酮等，根據(jù)溶劑的極性不同，常用的提取方法有乙醇提取法，熱水浸提法，乙酸乙酯提取法，常壓溶劑提取法，高雅榮記提取法，氯仿提取法。此類方法簡單，所需溫度不高，某些易揮發(fā)，易失活的物質(zhì)不易失活，但是提取時(shí)間過長，索氏提取器的優(yōu)點(diǎn)是多次萃取，提高提取液中物質(zhì)的濃度，缺點(diǎn)是過高的溫度容易造成有效成分的氧化變質(zhì)。（2）超聲波提取法超聲波是頻率大于20kHz以上的聲波，不能引起聽覺，應(yīng)用超聲波強(qiáng)化提取植物中的有效成分，是一種物理破碎過程。超聲波對媒質(zhì)主要產(chǎn)生獨(dú)特的機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用，其振動(dòng)能產(chǎn)生強(qiáng)大的能量，給予媒質(zhì)點(diǎn)以很大的速度和加速度，加速度前言第5頁（共16頁）隨著聲波頻率的增大而增大，聲波在植物組織細(xì)胞里，比電磁波穿透更深，停留時(shí)間也較長。高能量的超聲波作用于液體使其被撕裂成很多小空穴，小空穴閉合時(shí)產(chǎn)生高達(dá)幾千個(gè)大氣壓的瞬時(shí)壓力，作用于細(xì)胞組織，加速原料中有效成分進(jìn)入溶劑，增加有效成分的提取率。除了此作用外超聲波還具有機(jī)械震動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎等多級反應(yīng)，有利于使植物中有效成分的轉(zhuǎn)移，并充分和溶劑混合，促進(jìn)提取的進(jìn)行。研究表明，超聲波在提取植物活性物質(zhì)方面取得了良好的效果，用超聲波提取桔皮黃酮，甘草黃酮，黃芪黃酮，葛根黃酮，得到了較高的提取率。（3）石灰水提取法橙皮中分離出的主要黃酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中大都含有酚羥基，易溶于堿溶液，而在水中的溶解度小，尤其是橙皮苷在常溫下的甲醇中的溶解度也比較小，而易溶解于堿性溶液，采用強(qiáng)堿提取法在提高提取率的同時(shí)，脂肪和果膠等物質(zhì)的溶解度相應(yīng)增加，產(chǎn)品雜質(zhì)多，純化困難。（4）超臨界CO2流體萃取法超臨界流體萃取就是利用某些溶劑在臨界值以上具有的特性來提取混合物中可溶性組分的一門新的分離技術(shù)。目前人們使用最多的超臨界CO2流體，該法需要配置昂貴的設(shè)備，儀器占地比較大，儀器維護(hù)復(fù)雜，但它具有產(chǎn)品純度高，無溶劑殘留，成分活性保持好等顯著特點(diǎn)。現(xiàn)在已經(jīng)從理論研究轉(zhuǎn)向工業(yè)化生產(chǎn)，與國際應(yīng)用接軌。1.2.2黃酮類化合物的常用測定方法黃酮類化合物的測定可分為定性和定量檢測，定性分析方法主要有紙層析法、薄層層析法、波譜法等，定量檢測方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等。1.4國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢目前在我國，作為橙子加工業(yè)的副產(chǎn)品一橙皮和作為亞熱帶產(chǎn)量豐富的水果食用后的果皮一袖皮主要用作動(dòng)物飼料和當(dāng)作垃圾掩埋,這造成了自然資源的嚴(yán)重浪費(fèi)和一定程度的環(huán)境污染。與發(fā)達(dá)國家相比,國內(nèi)多數(shù)企業(yè)從橙皮皮中提取的色素、果膠含有大量的雜質(zhì)和溶劑殘留,達(dá)不到國外產(chǎn)品指標(biāo),在國際市場上價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均價(jià)格,只作為半成品賣給國外技術(shù)成熟的公司進(jìn)行精致,大量的利潤轉(zhuǎn)移出去；很多食品加工企業(yè)的果膠需要進(jìn)口。國外己經(jīng)開發(fā)處溶解性好的葡糖普橙皮普,使橙皮營的溶解性提高近一萬倍。國內(nèi)多數(shù)研究人員停留在對黃酮類化合物、類檸檬苦素粗制品的研究上,多數(shù)公司經(jīng)營HLPC純度的黃酮類化合物或它們的改性物多是國外產(chǎn)品。對癌細(xì)胞有很好抵抗作用的多甲氧基黃酮,價(jià)格昂貴,國內(nèi)還沒有純度達(dá)標(biāo)產(chǎn)品。另外,橙皮中含有豐富的類胡蘿卜素,是很好的生理活性物質(zhì),它們價(jià)格不菲,是很有開發(fā)前途的產(chǎn)品。從橙皮中提取的辛弗林、橙皮昔已經(jīng)作為藥物應(yīng)用于臨床；黃酮類化合物可以改善飲料的品味,橙皮普氫化后產(chǎn)物的甜度是蔗糖1500倍；類似于銀杏黃酮、大豆黃酮的保健品也已經(jīng)在國內(nèi)外市場上上市。歐美、日本、等國家或地區(qū)把黃酮類化合物、類檸檬苦素在清除人體內(nèi)有害自由基、殺死癌細(xì)胞的藥用研究看作醫(yī)學(xué)界一個(gè)熱點(diǎn),美國研究者利用總黃酮的強(qiáng)抗氧化作用,已將它成功應(yīng)用于功能性食品的開發(fā)中,目前已在全球銷售。我國的很多大學(xué)、醫(yī)院、研究所的科學(xué)工作者也己嘗試這方面研究。1.5本課題研究的目的和意義黃銅類化合物是一種天然的抗氧化劑，具有很高的藥用價(jià)值，如抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、消炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用。黃酮類化合物還在食品、化妝品、藥品等行業(yè)中廣泛應(yīng)用。黃酮類化合物的抗氧化作用，主要表現(xiàn)為減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基兩個(gè)方面。一般情況下，還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)。測定物質(zhì)的還原能力可以反映其抗氧化活性。自由基，從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看是指含未配對電子的基團(tuán)、原子或分子。大量研究表明，由于自由基具有高度的化學(xué)活性，一方面它是機(jī)體有效的防御系統(tǒng)的一部分，在正常的情況下，體內(nèi)自由基處于不斷產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡之中，并在代謝中發(fā)揮著重要作用，參與一些酶和前列腺素的合成，增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬活性，提高殺菌效果等。另一方面它又是造成許多疾病的原因，當(dāng)人體內(nèi)的自由基產(chǎn)生過多或清除過慢，就會攻擊各種細(xì)胞、器官并使之受到損傷，加速機(jī)體的衰老過程并誘發(fā)各種疾病。在眾多自由基中，OH?是最活潑的，是對機(jī)體危害最大的自由基，它可和活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損傷，而且反應(yīng)速度極快，被破壞的分子遍及糖類、氨基酸、磷脂、核苷和有機(jī)酸等。O2－·的毒性是機(jī)體發(fā)生氧中毒的主要原因，由它引起的損傷表現(xiàn)在使核酸鏈斷裂、多糖解聚及不飽和脂肪酸過氧化作用，進(jìn)而造成膜損傷、線粒體氧化磷酸化作用的改變及其他一系列的變化?；诒Ｗo(hù)環(huán)境，充分利用資源，提高經(jīng)濟(jì)效益的理念。本研究中所用原料為橙子副產(chǎn)物—橙皮，橙皮的任意丟棄為環(huán)境也帶來了巨大的壓力，如果不能對橙子的副產(chǎn)物做好妥善的處理，這將成為制約橙子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。將橙子的副產(chǎn)物—橙皮應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)提取生物黃酮，這在帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也緩解了環(huán)境的壓力。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究飽和石灰水法提取橙皮中黃酮類化合物的最佳工藝，掌握一些實(shí)驗(yàn)的思想，熟練一些實(shí)驗(yàn)操作的方法。加深人們對黃酮類化合物價(jià)值的認(rèn)識。2材料與方法2.1試驗(yàn)材料及藥品實(shí)驗(yàn)材料：橙子皮藥品：飽和石灰水，鹽酸，氫氧化鈉，石油醚(30-60)，乙醚，乙醇，正丁醇，大孔樹脂。2.2試驗(yàn)主要儀器及設(shè)備真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀鄭州長城科工貿(mào)有限公司，R-1001N紫外一可見分光光度計(jì)日本島津公司，UV一1700普通家用冰箱 中國海爾DHG-9023A電子熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科技有限公司PL303電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司HHS-2S數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司超聲波發(fā)生器 KQ-250E型微型高速萬能試樣粉碎機(jī) 上海申生科技有限公司2.3試驗(yàn)方法2.3.1飽和石灰水提取橙皮中黃酮類化合物的工藝流程篩選好的柑橘皮→洗凈→干燥→粉碎→加入飽和石灰水浸泡→超聲處理→過濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→解吸→大孔樹脂吸附→解吸→定容→測其吸光度→計(jì)算提取率2.3.2實(shí)驗(yàn)過程試驗(yàn)選定浸泡時(shí)間、pH值、固液質(zhì)量體積比、超聲時(shí)間四個(gè)因素來研究黃酮類化合物的溶解性。在每組試驗(yàn)中，用電子天平稱量5份原料粉末于150ml廣口玻璃瓶中，每份2.00g。然后加入飽和的石灰水調(diào)節(jié)pH值的一定體積、一定濃度的水溶液，靜態(tài)浸泡，超聲一段時(shí)間后，過濾。然后在4000rpm下離心20min，大孔樹脂吸附，取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2mL提取液經(jīng)NaNO-Al(NO)3顯色后，在波長510nm下測吸光度。2.3.3黃酮含量的測定方法取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（0.115mg.ml）精確吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml置于25ml試管中,加5%亞硝酸鈉0.3ml，放置6min,再加入10%硝酸鋁0.3mL,放置6min,加入4%氫氧化鈉4.0ml，加水至10ml刻度,搖勻。510nm處測定吸光值。以吸光值（A）為縱坐標(biāo)y，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。得到蘆丁質(zhì)量濃度x與吸光度y關(guān)系曲線的回歸方程為：y=8.3437x+0.0033，R=0.9932.（1）圖1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線提取液中總黃酮的含量測定：稱取脫脂柑橘皮粉2.00g，提取完畢后，容量瓶定容至100ml，取2ml提取液測其吸光度，測定方法同上。根據(jù)公式（1）計(jì)算由標(biāo)準(zhǔn)曲線換得的總黃酮的濃度，計(jì)算公式：C=（2）y—單因素試驗(yàn)或正交試驗(yàn)中測得的吸光度（A）根據(jù)公式（2）計(jì)算提取液中總黃酮提取率，計(jì)算公式：W（%）= （3）W—柑橘皮總黃酮提取率（%）C—由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得的總黃酮濃度（mg/ml）2.3.4實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)（1)浸泡時(shí)間浸泡時(shí)間的延長有利于柑橘皮細(xì)胞的破裂和黃酮類化合物的溶出。但時(shí)間太長,溶解的雜質(zhì)含量增加，黃酮類化合物也容易發(fā)生氧化變質(zhì)，所以選擇密封條件下浸泡半天為宜。（2）提取提取液需要用鹽酸調(diào)節(jié)pH8.0-pH9.0長時(shí)間靜置使溶解的果膠以果膠酸鈣的形式沉淀，再過濾除去。（3）超聲處理時(shí)間超聲處理時(shí)間不易太長這樣儀器發(fā)熱有損儀器，超聲處理后期增長不明顯得不償失。3結(jié)果與分析3.1單因素實(shí)驗(yàn)3.1.1浸泡時(shí)間對黃酮提取率的影響稱取相同質(zhì)量的橙皮粉末5份各2.00g，設(shè)定提取液體積50ml，pH值11.0，超聲時(shí)間15min，浸泡時(shí)間分別為1h，3h，6h，9h,12h。然后再4000rpm下離心20min，大孔樹脂吸附，分別取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2ml提取液經(jīng)NaNO-Al(NO)3顯色后，在波長510nm下測吸光度。圖2浸泡時(shí)間對黃酮提取液吸光度的影響從圖可以看出,提取液的吸光度隨著浸泡時(shí)間的延長一直增大,變化速度先是增大，后來減小。隨著浸泡時(shí)間的增加，黃酮浸出量增加，浸泡時(shí)間增加到大約9h時(shí)由圖課看出黃酮浸出量幾乎沒有增加，綜合考最優(yōu)佳浸泡時(shí)間范圍為8h-10h。3.1.2提取液pH對黃酮提取率的影響稱取相同質(zhì)量的橙皮粉末5份各2.00g，設(shè)定提取液體積50ml，浸泡時(shí)間9h，超聲處理時(shí)間15min，石灰水pH值分別為9.0，10.0，11.0，12.0，12.5，然后再4000rpm下離心20min，大孔樹脂吸附，分別取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2mL提取液經(jīng)NaNO-Al(NO)3顯色后，在波長510nm下測吸光度。圖3提取液pH值對黃酮提取液吸光度的影響由圖課看出，pH值增大有利于黃酮類物質(zhì)的溶出,大約在11-12之間達(dá)到最大，堿濃度過大反而使吸光度下降，原因可能是脂肪酸和果膠類物質(zhì)的溶解影響了黃酮類物質(zhì)的溶解性。綜合考慮確定最優(yōu)提取液pH范圍為11.0-12.03.1.3固液質(zhì)量比對黃酮提取效率的影響稱取相同質(zhì)量的橙皮粉末5份各2.00g，設(shè)定浸泡時(shí)間衛(wèi)9h，pH值11.0，超聲處理時(shí)間15min，提取液體積分別為30ml，45ml，60ml，80ml，100ml，然后再4000rpm下離心20min，大孔樹脂吸附，分別取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2mL提取液經(jīng)NaNO-Al(NO)3顯色后，在波長510nm下測吸光度。圖4提取液體積對黃酮提取液吸光度的影響由圖可看出隨著提取液體積的增大，吸光度有短暫的上升，隨后下降趨于平穩(wěn)，提取液體積增加到一定程度時(shí)，利于擴(kuò)散的黃酮的提取率已經(jīng)趨于穩(wěn)定,有效成分已基本溶出，綜合考慮最優(yōu)提取液體積范圍為30ml-50ml。3.1.4超聲處理時(shí)間對黃酮提取效率的影響稱取相同質(zhì)量的橙皮粉末5份各2.00g，設(shè)定提取液體積50ml，浸泡時(shí)間9h，pH值11.0，超聲處理時(shí)間分別為3min，6min，9min，12min，15min，然后再4000rpm下離心20min，大孔樹脂吸附，分別取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2mL提取液經(jīng)NaNO-Al(NO)3顯色后，在波長510nm下測吸光度。圖5超聲時(shí)間對黃酮提取液吸光度的影響由圖可看出，隨著超聲時(shí)間的延長，吸光度提高，而吸光度增長率在0min-5min最為明顯。而超聲處理一段時(shí)間后吸光度趨于平穩(wěn)，這可能是由于時(shí)間太長后超聲波產(chǎn)生的熱量過多,且會降低質(zhì)點(diǎn)間的能量傳遞。并且時(shí)間太長儀器過熱影響使用壽命，綜合考慮最優(yōu)超聲處理時(shí)間范圍為13min-15min。3.2黃酮提取實(shí)驗(yàn)中影響因素的正交試驗(yàn)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是研究多種影響因素的一種分式析因設(shè)計(jì)的主要方法，它根據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這些點(diǎn)具備了齊整可比,均勻分散的特點(diǎn)。而單因素試驗(yàn)的結(jié)果存在一定的出入，根本原因在于單因素試驗(yàn)是在固定其他因素的前提下只考慮由某一因素的變化而帶來的影響；而正交試驗(yàn)則是同時(shí)考察多個(gè)因素的影響，最終得到一組包含有各個(gè)因素的最優(yōu)組合，結(jié)果全面，信息量大。在試驗(yàn)研究中，對于單因素或兩因素試驗(yàn)，因其因素少，試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、實(shí)施與分析都比較簡單。但在實(shí)際工作中，常常需要同時(shí)考察3個(gè)或3個(gè)以上的試驗(yàn)因素，若進(jìn)行全面試驗(yàn)，則試驗(yàn)的規(guī)模將很大，往往因試驗(yàn)條件的限制而難于實(shí)施。正交設(shè)計(jì)就是安排多因素試驗(yàn)、尋求最優(yōu)水平組合的一種高效率試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。正交設(shè)計(jì)的基本特點(diǎn)是：用部分試驗(yàn)來代替全面試驗(yàn)，通過對部分試驗(yàn)結(jié)果的分析，了解全面試驗(yàn)的情況。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是試驗(yàn)優(yōu)化的常用方法。所謂試驗(yàn)優(yōu)化，是指在最優(yōu)化思想的指導(dǎo)下，進(jìn)行最優(yōu)設(shè)計(jì)的一種優(yōu)化方法。它從不同的優(yōu)良性出發(fā)，合理設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，有效控制試驗(yàn)干擾，科學(xué)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，全面進(jìn)行優(yōu)化分析，直接實(shí)現(xiàn)優(yōu)化目標(biāo)，已成為現(xiàn)代優(yōu)化技術(shù)的一個(gè)重要方面。本文采用3水平的L9(34）四因素三水平的正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝。表1黃酮提取工藝中的影響因素和水平水平A浸泡時(shí)間/hB提取液pHC固液比D超聲處理時(shí)間/min1810.02：40142911.02：451531012.02：5016表6正交試驗(yàn)表試驗(yàn)號ABCD吸光度A111110.760212220.920313330.810421230.780522310.800623120.860731320.730832130.790933210.950K12.4902.2702.4102.510K22.4402.5102.6502.510K32.4702.6202.3402.380k10.8300.7570.8030.837k20.8100.8370.8830.837k30.8230.8730.7800.793R0.0200.1160.1030.044由表5，6可看出，提取液pH對黃酮的提取影響最大，其次是固液質(zhì)量比、浸泡時(shí)間，影響最小的是超聲處理時(shí)間。既影響提取的主次因素為B>C>A>D。最佳因素水平為A1B3C2D2,即最佳提取工藝為浸泡時(shí)間8h、提取液pH12、體積45ml、超聲處理時(shí)間15min。4討論本研究以澄清石灰水為溶劑從橙皮中提取黃酮類化合物，以浸泡時(shí)間、提取液pH、固液質(zhì)量比、超聲處理時(shí)間為影響因素，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間太短，黃酮類化合物不能完全浸出，但是時(shí)間過長可能會由于長時(shí)間在強(qiáng)堿性環(huán)境下黃酮類成分遭到破壞，使提取率幾乎沒有增加；隨著pH增大，提取率也增大，當(dāng)pH增大到一定值之后，可以發(fā)現(xiàn)黃酮提取率有所下降，可能由于強(qiáng)堿性環(huán)境破壞了溶解平衡。隨提取液體積的增加到，黃酮提取率有短暫的上升，隨后下降趨于平穩(wěn)，提取液體積增加到一定程度時(shí)，利于擴(kuò)散的黃酮的提取率已經(jīng)趨于穩(wěn)定,有效成分已基本溶出；橙皮中黃酮提取率隨著超聲處理時(shí)間的增加而增加，顯然超聲處理有利于黃銅的提取，而超聲處理一段時(shí)間后黃酮提取率趨于平穩(wěn)，這可能是由于時(shí)間太長后超聲波產(chǎn)生的熱量過多,且會降低質(zhì)點(diǎn)間的能量傳遞。5結(jié)論（1）單因素實(shí)驗(yàn)中各個(gè)因素的最優(yōu)條件范圍分別為22.5倍原料干重提取液，pH為11.0左右的石灰水，常溫侵泡9h后，超聲處理15min。（2）在正交試驗(yàn)中優(yōu)組合為，浸泡時(shí)間8h、提取液pH為11.0、提取液體積45ml、超聲處理時(shí)間15min。黃酮的提取工藝影響程度為提取液pH>固液質(zhì)量比>浸泡時(shí)間>超聲處理時(shí)間。優(yōu)組合時(shí)，黃酮提取率最高，為3.586%。參考文獻(xiàn)[1]陳復(fù)生，左錦靜等.大孔樹脂吸附和分離陳皮中黃酮類化合物的研究[J].食品科技.2006,7:121-124.[2]齊海鷗等.柑橘皮的綜合利用[J].浙江柑橘,2003,20(3):31-35.[3]周大勇，徐青，薛興亞等.高效液相色譜質(zhì)譜一電噴霧質(zhì)譜法測定積殼中黃酮普類化合物.分析化學(xué)研究報(bào)告[J].2006，（4）：31-35.[4]藍(lán)航蓮.柑橘類黃酮的生理活性和研究進(jìn)展[J].2001.[5]岳紅.超臨界二氧化碳萃取柿葉黃酮的工藝研究[J].2005,25(3):55一58.[6]劉文娟，耿秋菊等.積實(shí)藥材中總黃酮提取工藝的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006,17（11）：2233-2234.[7]陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等．植物中黃酮類化合物的提取方法研究概況[J]．生物質(zhì)化學(xué)工程，2007，41(5)：42-45．[8]廖傳華，超臨界C02流體萃取技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004，7（1）118-212.[9]何擴(kuò)等.超臨界流體萃取銀杏葉中黃酮類化合物的研究[J].山西食品工業(yè),2005,24(4):31-35.[10]劉均玉，許晨等.不同品種橘皮中的黃酮分析.中國食品添加劑[J],2008，vol.90，NO.52008:160.[11]胡燕飛，王