紫外可見吸收光譜分析法

第五章

紫外-可見吸收光譜分析分子光譜之一根本要求：了解紫外-可見吸光光度法的特點(diǎn)，光的根本性質(zhì)，物質(zhì)對光的選擇性吸收，吸收曲線。掌握朗伯-比耳定律，以及運(yùn)用朗伯-比耳定律定量分析的方法。掌握紫外-可見分光光度計(jì)的根本結(jié)構(gòu)、工作原理，了解其主要部件的根本性質(zhì)和工作原理。掌握測量條件的選擇以及顯色反響選擇的方法。了解雙光束分光光度法的原理和應(yīng)用。了解雙波長分光光度法的原理和應(yīng)用。第一節(jié)概述

一、儀器分析方法分類〔回憶〕：電化學(xué)分析法光學(xué)分析法色譜分析法其它分析方法原子光譜法分子光譜法

X射線光譜法核磁波譜

紫外—可見光光譜法熒光光譜法紅外吸收光譜法拉曼光譜法

本章是儀器分析課程中光分析方法的第一章，光分析方法中的一些根本理論、根本概念、根本專業(yè)術(shù)語，在本章中首次出現(xiàn)并應(yīng)用。紫外－可見吸收光譜法歷史較久遠(yuǎn)，應(yīng)用十分廣泛，與其它各種儀器分析方法相比，紫外－可見吸收光譜法所用的儀器簡單、價(jià)廉，分析操作也比較簡單，而且分析速率較快。在有機(jī)化合物的定性、定量分析方面，例如化合物的鑒定、結(jié)構(gòu)分析和純度檢查以及在藥物、天然產(chǎn)物化學(xué)中應(yīng)用較多。光分析的根本過程：〔1〕能源提供能量；〔2〕能量與被測物之間的相互作用；〔3〕產(chǎn)生信號。根本特點(diǎn)：〔1〕所有光分析法均包含三個根本過程；〔2〕選擇性測量，不涉及混合物別離〔不同于色譜分析〕；〔3〕涉及大量光學(xué)元器件。電磁幅射的波長分布γ射線：5～140pm

X射線：10－3～10nm光學(xué)區(qū)：10～1000μm

遠(yuǎn)紫外區(qū)：10～200nm

近紫外區(qū)：200～380nm

可見區(qū)：380～780nm近紅外區(qū)：0.78～2.5μm中紅外區(qū)：2.5～50μm遠(yuǎn)紅外區(qū)：50～1000μm微波：0.1mm～1m無線電波：>1m紫外－可見吸收光譜是基于分子內(nèi)電子躍遷，是分子光譜。電磁輻射的根本性質(zhì)電磁輻射〔電磁波〕：以接近光速〔真空中為光速〕傳播的能量；c=λν=ν/σE=hν=hc/λc：光速=2.998×1010cm·s；λ：波長；ν：頻率；σ：波數(shù)；E：能量；h：普朗克常數(shù)＝6.624×10-34J·s電磁輻射具有波動性和微粒性；分子光譜〔帶狀光譜〕：基于分子中電子能級、振-轉(zhuǎn)能級躍遷；紫外光譜法〔UV〕；紅外光譜法〔IR〕；分子熒光光譜法〔MFS〕；分子磷光光譜法〔MPS〕；核磁共振與順磁共振波譜〔N〕；不同物質(zhì)具有不同的分子結(jié)構(gòu)，對不同波長的光會產(chǎn)生選擇性吸收，因而具有不同的吸收光譜。而各種化合物，無機(jī)化合物或有機(jī)化合物吸收光譜的產(chǎn)生在本質(zhì)上是相同的，都是外層電子躍遷的結(jié)果，但二者在電子躍遷類型上有一定區(qū)別。有機(jī)化合物吸收可見光或紫外光，σ、π和n電子就躍遷到高能態(tài)，可能產(chǎn)生的躍遷有σ→σ*、n→σ*、π→π*和n→π*。各種躍遷所需要的能量或吸收波長與有機(jī)化合物的基團(tuán)、結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，根據(jù)此原理進(jìn)行有機(jī)化合物的定性和結(jié)構(gòu)分析。

無機(jī)絡(luò)合物吸收帶主要是由電荷轉(zhuǎn)移躍遷和配位場躍遷而產(chǎn)生的。電荷轉(zhuǎn)移躍遷的摩爾吸收系數(shù)很大，根據(jù)朗伯－比爾定律，可以建立這些絡(luò)合物的定量分析方法。二、應(yīng)用：1．定量分析：

有色物質(zhì)→可見光區(qū)：340~800nm

對紫外線有吸收的無色物質(zhì)→紫外光區(qū)：

200~340nm

靈敏度ppm，精密度RSD:0.5%二、應(yīng)用：2．定性分析：提供某些分子的局部結(jié)構(gòu)信息例：苯的B帶吸收〔230~270nm間出現(xiàn)7個精細(xì)結(jié)構(gòu)的峰〕

第二節(jié)吸收定律與光譜圖一、朗伯—比耳定律㈠吸光度(A)的定義I0It當(dāng)一束平行光通過均勻的溶液介質(zhì)時，光的一局部被吸收，一局部被器皿反射。設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，透射光強(qiáng)度為It。那么吸光度(A)表示物質(zhì)對光的吸收程度，其定義為:一、朗伯-比耳定律㈡朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)是光吸收的根本定律，俗稱光吸收定律，是分光光度法定量分析的依據(jù)和根底。⒈當(dāng)C采用重量單位時，吸收定律表達(dá)為:A=abc式中：a：吸光系數(shù)，L/g*cmb：光程，cmc：濃度，g/L

可知：A與c呈線形關(guān)系，為定量分析的理論依據(jù)一、朗伯—比耳定律2.當(dāng)C采用摩爾濃度時，吸收定律表達(dá)為:

A=εbc

ε:摩爾吸光系數(shù)，L/mol·cmc:摩爾濃度，mol/L一、朗伯—比耳定律㈢透光率〔T〕I0It定義為：

那么：

應(yīng)用：儀器的調(diào)整T〔%〕：0~100〔全吸收〕〔無吸收〕A：∞~0二、紫外-可見吸收光譜圖定義：固定試樣濃度和吸收池厚度，以吸收度〔或透光率〕對波長所作的曲線。[例]0.001mol·L-1高錳酸鉀、重鉻酸鉀光譜圖。掃描-胡羅卜素咖啡因阿斯匹林丙酮幾種有機(jī)化合物的吸收光譜圖。濃度與吸收曲線紫外-可見吸收光譜圖的應(yīng)用定量：一般總有一最大吸收峰，其對應(yīng)波長稱為最大吸收波長〔λmax〕,往往以λmax作為定量分析時的單色光波長，可最大限度地提高靈敏度。簡單定性，答復(fù)“是不是〞的問題。第三節(jié)紫外-可見光分光光度計(jì)

一、分類單光束分光光度計(jì)雙光束分光光度計(jì)

單波長分光光度計(jì)

雙波長分光光度計(jì)可見光分光光度計(jì)

紫外-可見光分光光度計(jì)二、根本光路圖三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕光源單色器樣品室檢測器顯示三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕1.光源：提供穩(wěn)定的復(fù)合光

可見光區(qū)：鎢燈、碘鎢燈。其輻射波長范圍在320～2500nm。

紫外區(qū)：氫燈、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕2.單色器

作用：從光源的復(fù)合光中別離出所需單色光。組成：由色散元件和狹縫組成。光源單色器樣品室檢測器顯示三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕2.單色器①色散元件作用：將復(fù)合光分解成連續(xù)單色光。A.棱鏡〔靠折射作用分光〕可以得到波長非均勻分布的連續(xù)光譜，光強(qiáng)損失較大。400nm800nm三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕

棱鏡（Prism）：棱鏡的色散作用是基于構(gòu)成棱鏡的光學(xué)材料對不同波長的光具有不同的折射率。波長大的折射率小，波長小的折射率大。Cornu棱鏡

b

Littrow棱鏡三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ2800400500

600三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕光柵：在鍍鋁的玻璃外表刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。提供波長均勻分布的連續(xù)光譜，可用于吸收光譜的自動掃描。原理：利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干預(yù)現(xiàn)象而分光.。光柵衍射示意圖M1光屏透鏡平面透射光柵出射狹縫M2三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕

ABCDd

P0距離相對強(qiáng)度P’112光柵例：7530型紫外—可見光分光光度計(jì)。步進(jìn)馬達(dá)帶動光柵，得到勻速變化的單色光。光柵制作：機(jī)刻600～2880條/mm復(fù)制光柵〔照相，化學(xué)腐蝕〕三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕2.單色器②狹縫由銳邊金屬片組成A.入射狹縫：位于光源與色散元件之間。作用：是限制雜散光進(jìn)入色散元件。B.出口狹縫：位于色散元件與吸收池之間。作用：把額定波長單色光別離出單色器。光源樣品室檢測器顯示三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕2.單色器②狹縫

狹縫寬度可調(diào)

定性分析時，窄一點(diǎn)，單色光純，但光強(qiáng)弱。

定量分析時，寬一點(diǎn)，靈敏度高。

例：7530型分光光度計(jì)0.2nm，1.0nm，2.0nm三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕3.吸收池〔也可稱為比色皿、樣品池〕作用：盛放試液。①材料

A.普通光學(xué)玻璃：用于可見光區(qū)，因?yàn)樗兆贤夤狻?/p>

B.石英玻璃：用于紫外光區(qū)，亦可用于可見光區(qū)。三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕3.吸收池〔也可稱為比色皿、樣品池〕

②寬度：0.5cm，1cm，2cm③使用本卷須知固定使用同一比色皿，因?yàn)槊總€比色皿的壁厚、光程、吸光特性等不盡相同。三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕4.檢測器一類光電轉(zhuǎn)換元件。

常用類型有：①光電池②光電管③光電倍增管三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕4.檢測器①光電池

SeFe(Cu)h

玻璃Ag(Au)透明膜-收集極塑料--對500~600nm光靈敏，用于可見光區(qū)。容易產(chǎn)生疲勞效應(yīng)，便易。72G型光電比色計(jì)。

三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕4.檢測器②光電管90VDC直流放大陰極R-+光束e陽極絲（Ni）抽真空靈敏度比光電池大例：721型可見光分光光度計(jì)三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕4.檢測器③光電倍增管1個光子產(chǎn)生106~107個電子石英套光束柵極，Grill陽極屏蔽對光特別敏感，靈敏度比光電管高200倍。對供電量要求高，需要到達(dá)0.01～0.05%的穩(wěn)定性。一種新型檢測器：光電二極管陣列，PDASiO2窗p

型硅n型硅基pnpnpnpnpnpn0.025mm2.5mm側(cè)視(crosssection)頂視(topview)光束512個1024個三、主要部件〔以單光束分光光度計(jì)為例〕5.顯示器將檢測器產(chǎn)生的光電流用直觀的形式顯示出來。例：72G型722型7530型

電表指針顯示數(shù)字形式顯示屏幕形式顯示第四節(jié)測試條件一、分析波長1.一般情況下，選λmax作分析波長，以便獲得最高的靈敏度。2.對于高濃度樣品，為保證足夠的工作直線的線形范圍，可選用靈敏度較低的吸收峰波長。3.λmax受到其它波峰干擾時，可選用別的吸收峰波長。二、出口狹縫寬度最正確寬度的選擇方法：在A不減小時的最大狹縫寬度?！惨?yàn)椋谝欢▽挾确秶鷥?nèi)，A不變；過大時，由于干擾譜帶或非吸收光出現(xiàn)在光譜通帶內(nèi)，A減小。〕三、適宜的吸收度范圍根據(jù)吸收定律，A=0.4343時，吸收度測試量誤差最小。實(shí)際工作中，將試樣吸收度控制在0.2～0.8之間。控制方法：選擇適宜的比色皿寬度，稀釋待測樣等。第五節(jié)試樣體系條件的選擇顯色反響在分光光度分析中，利用顯色反響把待測組分X轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔?，然后再進(jìn)行測定。使試樣中的被測組分與化學(xué)試劑作用生成有色化合物的反響叫顯色反響。mX〔待測物〕＋nR〔顯色劑〕＝XmRn〔有色化合物〕顯色反響主要有配位反響和氧化復(fù)原反響，其中絕大多數(shù)是配位反響。選擇顯色反響的一般標(biāo)準(zhǔn)1、靈敏度高選擇較大(104～105)的顯色反響。2、選擇性好顯色劑僅與被測組分顯色而與其它共存組分不顯色。防止共存組分干擾。3、有色物組成固定如：Fe3++磺基水楊酸→三磺基水楊酸鐵(黃色)〔組成固定〕Fe3++SCN-→FeSCN2+、Fe(SCN)2+……〔組成不固定〕4、有色物穩(wěn)定性高其它離子干擾才小。如三磺基水楊酸鐵的Kf=1042,F-、H3PO4對它無干擾。5、顯色過程易于控制而且有色化合物與顯色劑之間的顏色差異應(yīng)盡可能大。一、酸堿度①影響顯色劑的平衡濃度和顏色

HR?H++R-nR-+Mn+?MRn②影響被測物質(zhì)的存在狀態(tài)

pH升高，M→M(OH)……M(OH)n甚至↓③影響絡(luò)合物的組成及顏色在pH＝2～3Fe(ssal)+

紫紅色在pH＝4～7Fe(ssal)22-

棕橙色

在pH＝8～10Fe(ssal)3

黃色在pH>12Fe(OH)3

沉淀一、酸堿度pH會影響顯色劑的解離，被測離子的水解等，所以，要選擇最正確酸度，并用緩沖液來控制。ApH選擇最正確pH值方法：固定試液濃度，改變pH值測A，做A-pH圖，找出對A影響最小的pH值范圍。二、顯色劑濃度1、顯色劑的用量顯色反響一般可表示為M+R?MR顯色劑用量，適當(dāng)過量。Aab(1)CRa(2)CR(3)CR二、顯色劑濃度2、最正確濃度選擇作A-C顯色劑圖，找出對A影響最小的濃度范圍。AC顯色劑三、顯色時間顯色反響有快慢，有的有色配合物容易褪色，因此不同的顯色反響需放置不同的時間，并在一定的時間范圍內(nèi)進(jìn)行比色測定。試液自參加顯色劑等且定容后開始計(jì)時，測A，制作A－t曲線，(2)、(3)用秒表控時t-minab(1)(3)t-mint-mina(2)三、顯色時間試液顏色常隨時間而變化。

1.找到對顏色變化影響最小的時間段。2.每個試液都要有相同的顯色時間。A

t四、溫度有些反響需要加熱。有些顯色劑或有色配合物在較高溫度下易分解褪色。此外溫度對光的吸收及顏色深淺也有影響，要求標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測溶液在測定過程中溫度一致。固定其它條件，改變T，作A~T曲線，尋找適宜反響溫度。TATATATATA四、溫度溫度能影響顯色反響的速度，影響顏色的穩(wěn)定性。據(jù)此可以找到最正確的溫度。有些顯色反響受溫度影響較大，這時候，要控制恒定的溫度。5、溶劑：有機(jī)溶劑可降低有色化合物的離解度。適宜的外表活性劑可增溶、增敏、增穩(wěn)。6、共存干擾離子的影響及消除：包括：正干擾〔共存離子本身有色or與顯色劑反響，在測量條件下有吸收〕和負(fù)干擾〔共存離子引起顯色反響不完全〕消除干擾的方法(a)控制酸度； (b)參加掩蔽劑；(c)改變干擾離子價(jià)態(tài)； (d)別離干擾離子。實(shí)驗(yàn)：鄰二氮菲分光光度法測定微量鐵

鐵鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0100mg/mL0.1%鄰二氮菲〔又稱鄰菲咯琳〕水溶液1%鹽酸羥胺水溶液HAc-NaAc緩沖溶液〔pH=4.6〕稱取136g優(yōu)級純醋酸鈉，加120mL冰醋酸，加水溶解后，稀釋至500mL實(shí)驗(yàn)：鄰二氮菲分光光度法測定微量鐵橙紅色配合物的最大吸收波長在508nm處，摩爾吸光系數(shù)ε508=1.1×104，反響的靈敏度、穩(wěn)定性、選擇性均較好。此反響可用于微量Fe2+的測定，如果鐵以Fe3+的形式存在，那么應(yīng)預(yù)先參加復(fù)原劑鹽酸羥胺或?qū)Ρ蕉訉e3+復(fù)原成Fe2+。4Fe3++2NH2OH—→4Fe2++N2O+4H++H2O羥胺實(shí)驗(yàn)：鄰二氮菲分光光度法測定微量鐵

Bi3+、Cd2+、Hg+、Zn2+、Ag+等離子與鄰二氮菲生成沉淀；Cu2+、Co2+、Ni2+等離子那么形成有色配合物，因此，當(dāng)這些離子共存時，應(yīng)注意它們的干擾。鋁和磷酸鹽含量大時，使反響速度慢，CN－存在將與Fe2+生成配合物，嚴(yán)重干擾測定，需預(yù)先除去。酸度高時，反響進(jìn)行慢；酸度太低，那么Fe2+水解，影響顯色，測定時的酸度是控制在pH=4-6。第六節(jié)定量分析法定量分析方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法BlankStandardSampleSample一、單組分的定量分析

〔測定樣品中某一種成分的含量〕1.工作曲線法〔適用組成較簡單的、批量的樣品〕依據(jù)：A-C呈線性關(guān)系，作A-C曲線。⑴配制一系列待測成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液C1C2C3C4C5⑵測出相應(yīng)的吸光度A1A2A3A4A5BlankStandardSampleSample⑶建立工作直線〔A→C〕①作圖法②回歸法⑷測量待測樣品，得A樣①從工作直線上找到待測成分的濃度C樣②由回歸方程計(jì)算出C樣2.增量法〔適用于組成較復(fù)雜的樣品〕①

取假設(shè)干份等體積待測液。②

參加與待測液等體積的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。③

作A-C標(biāo)曲線，此線與C標(biāo)軸交點(diǎn)即為C樣。C0=0〔試劑空白〕等體積標(biāo)液等體積待測液C0C3C2C1C4理論依據(jù)：A=εbc=εb(C樣+C標(biāo))當(dāng)A=0時，C樣=-C標(biāo)方法特點(diǎn)：適用于組成較復(fù)雜的樣品，對于批量樣品較麻煩。AC標(biāo)0〔C0〕-C樣二、多組分同時測定

〔同時測定一個樣品中的幾個組分〕溶液的總吸光度等于各組分的吸光度之和：

A=A1+A2+A3+……+An吸收峰互不重疊A、B兩組分的吸收峰相互不重疊，那么可分別在A、B處用單組分含量測定法測定組分A和B。二、多組分同時測定

〔同時測定一個樣品中的幾個組分〕〔1〕n個波長處分別測定樣品的吸光度?！布僭O(shè)測定n個組分，一般選擇各個組分的λmax〕〔2〕根據(jù)吸光度的加和性建立n個方程，解聯(lián)立方程，可得n個組分的濃度。原理：吸光度加和性例：同時測某樣品中二個組分分別在λ1、λ2處測樣品的吸光度A1、A2。〔設(shè)定光程b=1cm〕λ1:A1=ε11C1+ε12C2λ2:A2=ε21C1+ε22C2εij：波長i處，j組分的摩爾吸光系數(shù)。文獻(xiàn)，也可通過純組分的工作直線的斜率求得。例：同時測某樣品中三個組分分別在λ1、λ2、λ3處測樣品的吸光度A1、A2、A3?！苍O(shè)定光程b=1cm〕λ1:A1=ε11C1+ε12C2+ε13C3λ2:A2=ε21C1+ε22C2+ε23C3λ3:A3=ε31C1+ε32C2+ε33C3分光光度計(jì)的類型按光束分單光束分光光度計(jì)722、721、723、752雙光束分光光度計(jì)Jasco-UV/VISUV-2450/2550760CRT單波長單光束分光光度計(jì)0.575光源單色器吸收池檢測器顯示第七節(jié)雙光束分光光度計(jì)的應(yīng)用

應(yīng)用：能克服光源不穩(wěn)定造成的誤差

一、光路圖

I0I0I0I1I2樣品參比切光器單波長雙光束分光光度計(jì)比值光源單色器吸收池檢測器顯示光束分裂器二、工作原理

參比：樣品：那么：

作ΔA-C工作直線，定量。由于ΔA與I0無關(guān)，所以，能夠克服I0不穩(wěn)定所造成的誤差。

第八節(jié)雙波長分光光度計(jì)的應(yīng)用

特點(diǎn)：能消除共存干擾組分的影響；能消除渾濁試樣的干擾；能用于高濃度試樣的測量。屬于背景吸收一、光路圖

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：二個單色器.顯示器切光器（使光束交替通過）二、工作原理

λ1：A1=ε1bc+As1〔As1：λ1處的背景吸收〕λ2：A2=ε2bc+As2〔As2：λ2處的背景吸收〕如果As1=As2那么△A=A2-A1=ε2bc-ε1bc+As2-As1=〔ε2-ε1〕bc△A與c呈線性關(guān)系，可定量。.顯示器λ1λ2三、雙波長分光光度法對于吸收曲線有重疊的單組分(顯色劑與有色絡(luò)合物的吸收光譜重疊)或多組分(兩種性質(zhì)相近的組分所形成的有色絡(luò)合物吸收光譜重疊)試樣、混濁試樣以及背景吸收較大的試樣，由于存在很強(qiáng)的散射和特征吸收，難以找到一個適宜的參比溶液來抵消這種影響。利用雙波長吸光光度法，使兩束不同波長的單色光以一定的時間間隔交替地照射同一吸收池，測量并記錄兩者