細(xì)胞治療工藝人必讀慢病毒生產(chǎn)詳解

細(xì)胞治療工藝人必讀慢病毒生產(chǎn)詳解摘要慢病毒載體(LV)在獲得性及遺傳性疾病的基因治療中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。這篇綜述介紹了生產(chǎn)這些載體最前沿的技術(shù)，尤其是涉及到臨床應(yīng)用的大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)。相比較于在穩(wěn)定細(xì)胞系生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，臨床級(jí)別的慢病毒大多是通過(guò)在細(xì)胞工廠(chǎng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293或293T細(xì)胞生產(chǎn)的。然而，最近的進(jìn)展傾向于采用中空纖維管反應(yīng)器、懸浮培養(yǎng)及改進(jìn)的穩(wěn)定細(xì)胞系生產(chǎn)。正如生物技術(shù)行業(yè)的慣例一樣，慢病毒生產(chǎn)已經(jīng)建立了比較復(fù)雜的下有處理規(guī)程，包括去除任何過(guò)程來(lái)源的污染如質(zhì)粒、宿主細(xì)胞DNA或蛋白。這篇綜述比較了已發(fā)表的慢病毒大規(guī)模生產(chǎn)和純化工藝并介紹了它們的優(yōu)缺點(diǎn)。此外，穩(wěn)定細(xì)胞系領(lǐng)域的進(jìn)展及它們作為臨床材料生產(chǎn)載體的進(jìn)展也一并介紹。前言隨著歐洲第一個(gè)批準(zhǔn)AAV1載體用于治療脂蛋白脂酶缺乏(Glybera)，基于病毒載體的基因治療將會(huì)越來(lái)越多地應(yīng)用到罕見(jiàn)、獲得性疾病的治療。根據(jù)治療的目的及靶向細(xì)胞或組織的不同，會(huì)優(yōu)先選擇一種質(zhì)粒系統(tǒng)。如果應(yīng)用在分裂的細(xì)胞或組織中，為了達(dá)到轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)效表達(dá)一般需要用整合型載體。傳統(tǒng)上，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是很好的選擇，因?yàn)樗鼈兛梢詫⒒蚍€(wěn)定整合到細(xì)胞中。目前開(kāi)發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)主要有兩種：來(lái)源于貓白血病病毒的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒(MLV)和主要來(lái)源于HIV-1的慢病毒載體(LV)。過(guò)去很多成功的臨床實(shí)驗(yàn)采用的是基于MLV的載體，雖然現(xiàn)在這個(gè)載體還在用，但是趨勢(shì)是傾向于采用慢病毒載體。這種轉(zhuǎn)變的原因由很多：(i)與γ逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒因?yàn)榭梢钥邕^(guò)細(xì)胞膜所以可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞。(ii)慢病毒的整合模式有別于MLV載體，在引入插入突變方面似乎比MLV安全。(iii)慢病毒可以獲得比較高的滴度。這些就是逐漸由MLV轉(zhuǎn)向LV的主要原因，只是目前LV載體整體的生產(chǎn)條件還沒(méi)有達(dá)到最大潛能及MLV載體的水平。LV載體已經(jīng)成功地應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)，尤其是免疫缺陷、神經(jīng)退行性貯藏疾病等罕見(jiàn)病的治療。然而，LV在治療遺傳或獲得性疾病包括β-地中海貧血、帕金森氏癥及用于治療癌癥的基于嵌合抗原受體的免疫治療在臨床已經(jīng)獲得評(píng)價(jià)并獲得了令人驚喜的結(jié)果。這意味著，鑒于這些新療法的逐漸變?yōu)槌Ｒ?guī)使用，其生產(chǎn)技術(shù)成為一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題?；诎l(fā)表的公共信息資源，這篇綜述介紹了LV載體生產(chǎn)的實(shí)際水平、實(shí)際操作規(guī)程及儀器設(shè)備的優(yōu)缺點(diǎn)、所能達(dá)到的最高的生產(chǎn)水平，最后對(duì)以后的發(fā)展進(jìn)行了展望。LV載體系統(tǒng)LV載體系統(tǒng)的原型是已經(jīng)深入研究的人類(lèi)病毒，HIV-1。除了HIV-1之外，其它慢病毒也被作為基因轉(zhuǎn)移載體（TV）來(lái)開(kāi)發(fā)，但是它們絕大多數(shù)沒(méi)有達(dá)到臨床研究的水平，例如HIV-2、猿免疫缺陷病毒、非靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒包括貓免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒。只有基于馬傳染性貧血病毒的載體被開(kāi)發(fā)到臨床應(yīng)用。下面這篇綜述將聚焦在基于HIV-1的LV載體。

四質(zhì)粒系統(tǒng)主要是考慮到HIV-1對(duì)人的病原性及相關(guān)的安全考慮，研究人員開(kāi)發(fā)了不同代的LV載體系統(tǒng)，其中目前第三代被廣泛應(yīng)用在研發(fā)及臨床中。它是一個(gè)4質(zhì)粒系統(tǒng)，包括三個(gè)輔助質(zhì)粒和一個(gè)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。輔助質(zhì)粒的選擇取決于對(duì)分裂基因組進(jìn)行包裝合理設(shè)計(jì)，參見(jiàn)Dull的描述21。這個(gè)生產(chǎn)系統(tǒng)與臨床安全應(yīng)用的所有必需特性相關(guān)聯(lián)（采用非重疊的、分裂基因組包裝載體來(lái)最大程度地減少潛在的重組事件，這種重組事件可能導(dǎo)致有復(fù)制能力的病毒的產(chǎn)生）。HIV-1所有非必需基因(vif,vpr,vpu,nef)僅僅在第一代載體中保留，第三代慢病毒載體已經(jīng)將它們?nèi)コ?。與此類(lèi)似，在第二代慢病毒載體中保留的調(diào)節(jié)性的tat基因在第三代中被去除，因?yàn)樗姆词郊せ罟δ懿皇潜匦璧模驗(yàn)檗D(zhuǎn)移載體中5’長(zhǎng)末端重復(fù)中的U3啟動(dòng)子已經(jīng)被一個(gè)組成型激活的啟動(dòng)子序列所替代，如巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒啟動(dòng)子加可選擇的增強(qiáng)子或者可誘導(dǎo)/抑制的啟動(dòng)子序列，如7tetO26。這通常被說(shuō)成是pRRL設(shè)計(jì)(轉(zhuǎn)移載體包含嵌合勞氏肉瘤病毒，(RSV)-HIV5’LTRs)或者pCCL設(shè)計(jì)((CMV)-HIV5’LTR)。這些修改產(chǎn)生了需要輔助質(zhì)粒的慢病毒系統(tǒng)，這些輔助質(zhì)粒是基于來(lái)源于HIV-1的gag-pol（編碼結(jié)構(gòu)蛋白和病毒酶）和rev(編碼翻譯后調(diào)控元件)及env。雖然慢病毒載體可以用不同的異源膜糖蛋白包裹成假病毒，但是所有大規(guī)模(臨床級(jí))制備的載體所用的糖蛋白都是水泡性口炎病毒膜蛋白(VSV-g)，這是因?yàn)樗谙掠翁幚頃r(shí)穩(wěn)定性高以及比較廣的轉(zhuǎn)染譜。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒是唯一轉(zhuǎn)移進(jìn)靶細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，包括待轉(zhuǎn)的基因表達(dá)盒、包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所必需的順式作用原件。考慮到提高生物安全性，自我失活的慢病毒載體也被開(kāi)發(fā)出來(lái)，在這個(gè)載體中，3’LTR中的U3元件引入了缺失突變。這種載體一旦被轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞就喪失了病毒LTR的轉(zhuǎn)錄活性，從而使得產(chǎn)生有復(fù)制能力的重組子的風(fēng)險(xiǎn)最小化，同時(shí)也避免了啟動(dòng)子干涉相關(guān)的問(wèn)題。至于載體的生產(chǎn)，將四個(gè)分別編碼gag-pol、rev、VSV-g及帶有轉(zhuǎn)基因及內(nèi)部啟動(dòng)子的自激活型慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293或HEK293T(見(jiàn)下面)(Figure1)。慢病毒載體其它方面的安全性提高還有去除載體基因組中的同源序列，因?yàn)榘b信號(hào)(Ψ)通過(guò)密碼子優(yōu)化延伸到了gag基因的第一個(gè)堿基及gag-pol載體。密碼子優(yōu)化使得gag-pol蛋白的翻譯不再依賴(lài)于rev，因此Rev反應(yīng)元件(RRE)序列可以從包裝載體中去除。因?yàn)檗D(zhuǎn)移載體中含有部分gag序列，對(duì)gag-pol序列的密碼子優(yōu)化可以使得Ψ-gag重組(例如Sastry所報(bào)道31)變得不可能。密碼子優(yōu)化的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以使?jié)撛诘闹亟M概率降低100倍。轉(zhuǎn)移載體中缺失RRE序列的完全不依賴(lài)rev的慢病毒載體系統(tǒng)目前還沒(méi)有出現(xiàn)。RRE(未拼接的載體轉(zhuǎn)錄本的一部分)存在于多個(gè)Rev分子組裝的寡聚復(fù)合體，該復(fù)合體可以穩(wěn)定并介導(dǎo)載體轉(zhuǎn)錄本在載體生產(chǎn)時(shí)而不是轉(zhuǎn)移載體在靶細(xì)胞整合之后從細(xì)胞核到細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)?？蛇x擇的轉(zhuǎn)運(yùn)序列如組成型運(yùn)輸元件或RNA運(yùn)輸元件可以在gag-pol生產(chǎn)時(shí)發(fā)揮作用，但是尚未證實(shí)在轉(zhuǎn)移載體中與RRE一樣高效。因此，目前慢病毒載體仍然利用Rev/RRE來(lái)高效的將載體基因組轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿。Figure1.一個(gè)Tat非依賴(lài)的第三代HIV-1載體系統(tǒng)示例。上圖所示的SIN轉(zhuǎn)移載體含有的cPPT可以高效核轉(zhuǎn)運(yùn)，MSCVLTR啟動(dòng)子作為內(nèi)部啟動(dòng)子及WPRE元件驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因高效表達(dá)。另外三個(gè)質(zhì)粒分別編碼HIV-1gag-pol、rev蛋白及VSV-g膜糖蛋白。SIN：selfinactivating,自失活；VSV-g：水泡性口炎病毒膜蛋白。

三質(zhì)粒系統(tǒng)

一種rev非依賴(lài)的載體技術(shù)僅僅在EIAV系統(tǒng)中成功實(shí)現(xiàn)，該系統(tǒng)僅需要3個(gè)質(zhì)粒(兩個(gè)輔助質(zhì)粒gag-pol和env,還有轉(zhuǎn)移質(zhì)粒)。過(guò)去，Virxsys開(kāi)發(fā)了一個(gè)兩質(zhì)粒系統(tǒng)來(lái)治療HIV感染，他是利用條件復(fù)制的慢病毒載體。這個(gè)系統(tǒng)的特點(diǎn)是將所有的輔助功能(gag-pol,rev,tat,VSV-g)都組裝在一個(gè)質(zhì)粒上。由于采用了全長(zhǎng)的LTR，該系統(tǒng)依賴(lài)于tat因此被定義為第二代慢病毒載體系統(tǒng)。維持完整的LTR是為了讓靶向HIV包膜基因的反義鏈的轉(zhuǎn)錄僅在HIV感染并表達(dá)tat的靶細(xì)胞中發(fā)生。雖然該生產(chǎn)系統(tǒng)在應(yīng)用中易于生產(chǎn)、成本低廉并且比三質(zhì)粒或四質(zhì)粒系統(tǒng)產(chǎn)生的病毒滴度高，但是所有的輔助基因都位于一個(gè)載體上可能會(huì)產(chǎn)生有復(fù)制能力的慢病毒。然而，所有上述質(zhì)粒組合、及轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)物中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有復(fù)制能力的慢病毒。

用于載體生產(chǎn)的細(xì)胞系目前大多數(shù)慢病毒載體的生產(chǎn)方法都含有共轉(zhuǎn)染HEK293或HEK293T細(xì)胞。優(yōu)先采用HEK293T的原因是SV40T抗原的存在可以使得慢病毒的產(chǎn)生更高效。此外，HEK293T的增殖能力和轉(zhuǎn)染效率都要比HEK293高。目前還不能對(duì)其完整的分子機(jī)制給出解釋?zhuān)荊ama-Norton等發(fā)現(xiàn)在基于HEK293的穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系中，含有SV40T抗原的克隆產(chǎn)生慢病毒的能力要比不含SV40T抗原的克隆高。這些克隆的唯一區(qū)別就是表達(dá)/不表達(dá)SV40T抗原。Smith和Shioda也在CV-1細(xì)胞(SV40T抗原陰性)和COS-1細(xì)胞(SV40T抗原陽(yáng)性)中證實(shí)了SV40T抗原在慢病毒載體生產(chǎn)中的積極作用。COS-1主要用來(lái)慢病毒載體及小規(guī)模自動(dòng)生產(chǎn)的篩選，因?yàn)樗妮d體質(zhì)量（感染效率提高，細(xì)胞蛋白來(lái)源的污染少）比HEK293T高。但是，采用COS-1細(xì)胞的最大的缺點(diǎn)是它是完全貼壁細(xì)胞，而HEK293T細(xì)胞可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)，這對(duì)大規(guī)模載體生產(chǎn)非常有利。慢病毒載體生產(chǎn)下面這部分比較了文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模和工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的慢病毒的生產(chǎn)過(guò)程。這個(gè)比較主要集中在生產(chǎn)者的技術(shù)方法上。討論每種方法的性能和產(chǎn)率是沒(méi)有意義的，因?yàn)槁《鞠到y(tǒng)、轉(zhuǎn)的基因及滴度測(cè)定方法的差異導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行客觀比較。但是，在這篇綜述中，作者報(bào)道的滴度作為衡量指標(biāo)。小規(guī)模生產(chǎn)慢病毒載體以研發(fā)為目的的小規(guī)模生產(chǎn)是采用生長(zhǎng)在培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、多盤(pán)系統(tǒng)（CellFactories,CellStacks）或HYPERFlask的貼壁細(xì)胞。采用傳統(tǒng)的磷酸鈣轉(zhuǎn)染或者最近發(fā)展起來(lái)的PEI轉(zhuǎn)染來(lái)轉(zhuǎn)染最佳密度的細(xì)胞(<50%),后者的優(yōu)點(diǎn)是不依賴(lài)培養(yǎng)條件、轉(zhuǎn)然后不需要換液及可用于懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染。原則上，小規(guī)模生產(chǎn)也可以采用陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑如lipofectamine、fugene及293fectin,它們轉(zhuǎn)染也都獲得了高水平表達(dá)。通過(guò)比較不同的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，Aububel等并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)所評(píng)估的培養(yǎng)系統(tǒng)(培養(yǎng)瓶，一層或十層細(xì)胞工廠(chǎng))所產(chǎn)生的慢病毒滴度有任何差異。利用HYPERFask，Kutner等發(fā)現(xiàn)采用HYPERFask培養(yǎng)可以比用傳統(tǒng)培養(yǎng)裝置培養(yǎng)所產(chǎn)生的慢病毒每個(gè)表面單位高10倍，原因可能是前者有更高的氧氣利用率。此外，HYSPERFask生產(chǎn)的慢病毒比傳統(tǒng)培養(yǎng)皿生產(chǎn)的慢病毒所含細(xì)胞蛋白、核酸污染更低。HEK293T細(xì)胞貼壁不牢，所以采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)慢病毒時(shí)更困難，同時(shí)為了要保證細(xì)胞貼壁，轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化要更加小心。在這種背景下，Patel等證實(shí)在HEK293中過(guò)表達(dá)alpha-v和beta-3整合素可以提高細(xì)胞貼壁能力，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)瓶中慢病毒的產(chǎn)率。然而，這種方法需要采用過(guò)表達(dá)整合素的重組HEK293。大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒當(dāng)轉(zhuǎn)向臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)需要大量的慢病毒載體，而將生產(chǎn)工藝放大則顯得極為重要。這既可以通過(guò)擴(kuò)展方法(增加生產(chǎn)單元)，也可以通過(guò)采用懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，后者比貼壁細(xì)胞更容易放大。兩種方法下面都會(huì)介紹:采用貼壁細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒大多數(shù)大規(guī)模生產(chǎn)都是小規(guī)模生產(chǎn)的直接放大，即通過(guò)增加培養(yǎng)/生產(chǎn)單元來(lái)實(shí)現(xiàn)。生產(chǎn)基本上采用大量的多層培養(yǎng)系統(tǒng)(CellFactories(CF)(CF-10)(Figure2))或者CellStacks(CS)。因?yàn)橐子诓僮鳎?0疊層裝置(CS-10)是首選，雖然原則上40疊層裝置同樣也可以用，但是因?yàn)樗亓吭黾拥脑蛩孕枰厥獾奶幚硐到y(tǒng)。此外，每層平板的氣體交換及培養(yǎng)基層不可能一致，因此用顯微鏡控制40疊層裝置細(xì)胞的生長(zhǎng)很困難。生產(chǎn)要么采用放在層流工作臺(tái)的開(kāi)放模式，要么采用半封閉模式，后者對(duì)操作人員、環(huán)境及終產(chǎn)品的安全性更高。Figure2.Nunc公司的十疊層細(xì)胞工廠(chǎng)(CF-10)收獲是通過(guò)簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基置換完成的，在某些情況下，通過(guò)增加收獲次數(shù)來(lái)提高最終慢病毒的質(zhì)量。然而，在臨床前及臨床級(jí)大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，頻繁收獲是不現(xiàn)實(shí)的，因此在大多數(shù)時(shí)候只是收獲1-3次。根據(jù)10疊層培養(yǎng)設(shè)備的數(shù)量及收獲次數(shù)的多少，傳統(tǒng)上采用10-24個(gè)CF-10設(shè)備一次生產(chǎn)周期可以收獲的體積介于20-52升之間。在多次生產(chǎn)周期的生產(chǎn)規(guī)程中(多次亞批次系統(tǒng))，可以獲得大批量的藥品(純化的和瓶裝產(chǎn)品)。Ausubel等介紹了一種大體積(>100升)生產(chǎn)慢病毒的方法，該方法把幾周內(nèi)生產(chǎn)的多個(gè)10升的亞批次產(chǎn)品收集到一起。Dupont也使用了類(lèi)似的方法。單獨(dú)處理每次收獲的樣品純化的產(chǎn)品每次都要進(jìn)行質(zhì)控。為了生產(chǎn)大量的藥物產(chǎn)品，所需數(shù)量的純化的分裝品會(huì)經(jīng)過(guò)解凍、匯集、無(wú)菌過(guò)濾并裝瓶。在穩(wěn)定誘導(dǎo)型生產(chǎn)細(xì)胞系(tet-off誘導(dǎo)系統(tǒng))條件下，50-LWAVE反應(yīng)器(工作體積25升)在一次連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中可以收獲138L含有慢病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清(收獲時(shí)間：誘導(dǎo)后的8天內(nèi)收獲3-6次)(見(jiàn)下面)。未處理的上清一般含有1-5×107個(gè)感染顆粒/毫升，與報(bào)道的小規(guī)模生產(chǎn)的滴度相仿。然而，Greene等及Ausubel等也分別報(bào)道采用大規(guī)模生產(chǎn)獲得了0.5-1×107及0.5-2×106轉(zhuǎn)染單位/毫升的病毒滴度。這些差異主要是受載體組成如目的基因、所用的啟動(dòng)子及其它的調(diào)控元件，同時(shí)也受滴定方法的影響，因?yàn)槟壳暗味ǚ椒ㄟ€沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化。所有的大規(guī)模生產(chǎn)規(guī)程都是針對(duì)HIV-1及EIAV慢病毒載體開(kāi)發(fā)的。最近報(bào)道了一種采用中空纖維的慢病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，被稱(chēng)為準(zhǔn)‘大規(guī)?！Ｊ紫葘EK293T接種到中控纖維中，貼壁24小時(shí)之后將三個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞。它的優(yōu)點(diǎn)是它是封閉的全自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)，并且產(chǎn)量與三個(gè)CF-10疊層相當(dāng)。但是在實(shí)際生產(chǎn)中它需要建立多個(gè)平行系統(tǒng)。Table1羅列了可利用的大規(guī)模慢病毒生產(chǎn)體系。

采用懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)慢病毒雖然轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞是生產(chǎn)慢病毒的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但是這個(gè)方法在擴(kuò)大規(guī)模上受限。對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，在大的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞通常是最便捷的方式。在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)需要對(duì)懸浮的生產(chǎn)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。多個(gè)用于生產(chǎn)慢病毒的細(xì)胞系(293T、293FT、293SF-3F6)被報(bào)道易于在化學(xué)成分限定的培養(yǎng)基(Freestyle293andF17,Invitrogen,Carlsbad,CA;HyQSFM4TransFx293,Hyclone,Logan,UT)中適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。這些細(xì)胞可以在沒(méi)有為載體的情況下迅速懸浮生長(zhǎng)，這使得它們的培養(yǎng)和擴(kuò)大比貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞容易很多。此外，培養(yǎng)基中沒(méi)有牛血清及其他動(dòng)物來(lái)源的組分是臨床生產(chǎn)最合適的情況，它可以降低被外源物質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)。在懸浮培養(yǎng)模式下，細(xì)胞可以通過(guò)不同的容器進(jìn)行擴(kuò)大：搖瓶、玻璃生物反應(yīng)器、不銹鋼生物反應(yīng)器、培養(yǎng)袋及一次性攪拌容器。有報(bào)道采用HEK293T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染、慢病毒生產(chǎn)可以用一次性的生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)50L的規(guī)模。采用磷酸鈣沉淀的DNA轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞由于持續(xù)的攪拌而被認(rèn)為效率低下。因此，大多數(shù)時(shí)候采用其它的轉(zhuǎn)染試劑如陽(yáng)離子聚合物。線(xiàn)性25kDa的PEI可以在293T及293-EBNA1中誘導(dǎo)最高的轉(zhuǎn)染效率，用GFP質(zhì)粒作為報(bào)告質(zhì)?？梢赃_(dá)到75%的轉(zhuǎn)染效率。在Marceau及Gasmi的關(guān)于生產(chǎn)慢病毒的專(zhuān)利中也采用了同樣類(lèi)型的PEI,他們達(dá)到了90%的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。然而在這個(gè)例子中，轉(zhuǎn)染效率是在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)檢測(cè)的，因此GFP信號(hào)可能來(lái)自新合成的慢病毒的感染。為了在幾個(gè)HEK293來(lái)源的細(xì)胞系中獲得最佳的轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞密度似乎是一個(gè)很重要的參數(shù)。許多文章一致認(rèn)為PEI/DNA聚合物轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的最佳密度是1百萬(wàn)細(xì)胞/毫升，更精確點(diǎn)是介于8×105細(xì)胞/毫升至1.5×106細(xì)胞/毫升之間。PEI轉(zhuǎn)染的一個(gè)缺點(diǎn)是達(dá)到高轉(zhuǎn)染效率所需要的質(zhì)粒DNA的量。Ansorge等1ug/106293SF-3F9細(xì)胞，而Marceau及Gasmi報(bào)道最佳的用量是2.5ug/106293T細(xì)，這樣在大規(guī)模制備時(shí)會(huì)需要大量的質(zhì)粒(例如，一個(gè)200L的生物反應(yīng)器需要750mg質(zhì)粒DNA)。這么大量的DNA意味著原料成本過(guò)高，大量殘留DNA需要在后續(xù)處理中去除。PEI的另一個(gè)問(wèn)題是在生產(chǎn)或純化慢病毒時(shí)缺少檢測(cè)及定量PEI的方法。因此，還不清楚PEI是否會(huì)和慢病毒共純化，這種共純化的水平及是否會(huì)對(duì)慢病毒的感染能力及穩(wěn)定性產(chǎn)生破壞作用。另外，有報(bào)道證實(shí)電穿孔可作為真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法。Witting等報(bào)道采用電轉(zhuǎn)可以高效的生產(chǎn)慢病毒。然而，這種方法需要在電轉(zhuǎn)時(shí)將細(xì)胞濃縮到108/毫升，因此很難擴(kuò)大到工業(yè)規(guī)模。事實(shí)上，現(xiàn)在的方法是在電轉(zhuǎn)前濃縮，電轉(zhuǎn)后稀釋到原來(lái)的體積。更大規(guī)模的操作需要例如連續(xù)離心機(jī)等特殊設(shè)備。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)階段的技術(shù)操作控制地越少越好，因?yàn)樗麄儠?huì)增加微生物污染的危險(xiǎn)。此外，離心也可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壓力及大量細(xì)胞損傷，進(jìn)而會(huì)降低病毒產(chǎn)量。因此，雖然很有前景，但是電轉(zhuǎn)要想在工業(yè)規(guī)模獲得應(yīng)用還需要進(jìn)一個(gè)完善和簡(jiǎn)化。在前面瞬時(shí)轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞生產(chǎn)慢病毒的例子中，培養(yǎng)基中加入了終濃度為1-10mmol/L的丁酸鈉。像其它組蛋白去乙酰化酶抑制劑如曲古霉素A、丙戊酸一樣，丁酸鈉據(jù)報(bào)道可以組織DNA凝集，從而使得啟動(dòng)子暴露出來(lái)。這樣會(huì)提高RNA轉(zhuǎn)錄及后續(xù)的慢病毒產(chǎn)量。然而，丁酸鈉的作用還存在爭(zhēng)議，因?yàn)檠芯空咧g慢病毒的產(chǎn)量并不一致。Ansorge等報(bào)道采用5mmol/L的丁酸鈉將VSV-g包被的慢病毒的產(chǎn)量提高了10倍。與此相反，Sena-Esteves等采用10mmol/L丁酸鈉并沒(méi)有看到VSV-g包被的慢病毒的產(chǎn)量有任何提高，反而在其它包被類(lèi)型的慢病毒中看到了產(chǎn)量提高。因此，很難做出組蛋白去乙?；敢种苿┳饔玫慕Y(jié)論。這些實(shí)驗(yàn)的主要區(qū)別可能來(lái)自質(zhì)粒載體本身，因?yàn)樗鼈兣c組蛋白的相互作用理論上依賴(lài)于DNA序列及啟動(dòng)子的類(lèi)型。因此，丁酸鈉對(duì)每種DNA載體的影響應(yīng)該單獨(dú)評(píng)估。公布的數(shù)據(jù)表明，在懸浮培養(yǎng)的生產(chǎn)的慢病毒滴度類(lèi)似于貼壁細(xì)胞獲得的滴度。在批次收獲或培養(yǎng)上清中獲得的慢病毒滴度在107～108IG/ml或TU/ml范圍內(nèi)，而貼壁細(xì)胞系統(tǒng)獲得的滴度在106-108TU/ml(Table1)。然而，這種比較是非常困難的，因?yàn)榭晒┍容^的采用相同載體的報(bào)道數(shù)量少，不同的分析手段也是一個(gè)原因。最后，在貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)中，培養(yǎng)上清可以間隔一天收獲兩次，這是一個(gè)提高成本效益的好方法。在懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，這種方法很難實(shí)現(xiàn)。Ansorge評(píng)估了一種灌注系統(tǒng)，該系統(tǒng)在7天中可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基替換和連續(xù)收獲。他們的結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)然后48-96小時(shí)之間是慢病毒滴度最高的，說(shuō)明在懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中多次收獲也是可行的。雖然灌注系統(tǒng)在大規(guī)模時(shí)復(fù)雜且成本高，但是他對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染具有巨大吸引力。以為它可以在保持質(zhì)粒用量不變的情況下，可以將收獲體積擴(kuò)大2-3倍?？傊脩腋〖?xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒是可行的，并且顯示出良好的產(chǎn)量。但是，在轉(zhuǎn)移到工業(yè)生產(chǎn)之前，該技術(shù)還需要進(jìn)一步完善。優(yōu)化的主要瓶頸是轉(zhuǎn)染過(guò)程本身，它需要大量質(zhì)粒DNA，從而使生產(chǎn)過(guò)程極其昂貴。一種工業(yè)友好、減少DNA的消耗、提高生產(chǎn)細(xì)胞的百分比的轉(zhuǎn)染技術(shù)是使這一過(guò)程在未來(lái)工業(yè)中有利可圖的關(guān)鍵因素。如果沒(méi)有展望中提到的改進(jìn)，一旦用于慢病毒生產(chǎn)，穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系將代表一個(gè)負(fù)擔(dān)得起的生產(chǎn)系統(tǒng)。發(fā)展穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系相較于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)，穩(wěn)定的慢病毒生產(chǎn)才是基因治療的最佳選擇。后者可以降低生產(chǎn)成本、提高整體安全性和可重復(fù)性，這也是限制瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用的主要障礙。首先為臨床實(shí)驗(yàn)、最后為基因治療產(chǎn)品商業(yè)化實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的生產(chǎn)系統(tǒng)是降低生產(chǎn)成本、提高慢病毒質(zhì)量和安全性的重要里程碑。自上世紀(jì)90年代初第一個(gè)包裝細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)，就發(fā)展出了很多構(gòu)建策略，這些策略的主要差別在于選擇導(dǎo)入編碼基因的載體的方法。例如，質(zhì)粒和整合載體以及所利用的包膜蛋白。后者已成為導(dǎo)致更多誘導(dǎo)性而非組成型包裝細(xì)胞發(fā)展的最重要因素之一。VSV-g作為應(yīng)用最廣泛的慢病毒異源包膜蛋白，它有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。它的表達(dá)必須在慢病毒生產(chǎn)時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)來(lái)防止包裝細(xì)胞死亡。此外，HIV的gag和pol基因的表達(dá)也有細(xì)胞毒性和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)活性，因此這些基因的高表達(dá)必須控制在病毒生產(chǎn)階段。第一個(gè)常用的誘導(dǎo)系統(tǒng)是Tet-on和Tet-off系統(tǒng)，它通過(guò)向培養(yǎng)基中添加或去除四環(huán)素/多西環(huán)素來(lái)作用于四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)來(lái)誘導(dǎo)基因表達(dá)。當(dāng)其它適合慢病毒包裝的非毒性包膜蛋白被發(fā)現(xiàn)時(shí)，隨后會(huì)開(kāi)發(fā)出組成型包裝細(xì)胞。這部分將分別討論來(lái)源于HIV-1和EIAV的誘導(dǎo)型和組成型包裝細(xì)胞，它們的性能指標(biāo)總結(jié)在Table2中。誘導(dǎo)型包裝細(xì)胞Tet-off誘導(dǎo)系統(tǒng)。四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在第一代包裝細(xì)胞中就有應(yīng)用，該系統(tǒng)中HIVgp120/gp41包膜蛋白還沒(méi)有被VSV-g替換掉，調(diào)節(jié)性及非必需基因仍然保留在包裝載體中。Hela來(lái)源的HtTA-1細(xì)胞組成型表達(dá)tTA,它是有大腸桿菌的四環(huán)素抑制子和單純皰疹病毒的HSV-VP16反式激活因子融合的一個(gè)嵌合蛋白。tTA一方面控制所有包裝基因的表達(dá)，另一方面也控制調(diào)節(jié)基因Rev蛋白的表達(dá)，而Rev會(huì)激活gag和pol基因。隨后，Tet-off系統(tǒng)被用在基于HEK293的穩(wěn)定包裝細(xì)胞系SODk1中調(diào)控VSV-g包膜蛋白和第一代包裝載體，該系統(tǒng)可以3-4天內(nèi)生產(chǎn)滴度超過(guò)106TU/ml的病毒顆粒。隨后兩個(gè)獨(dú)立的課題組構(gòu)建了基于多西霉素抑制HIV-1Rev/Gag/Pol及VSV-g包膜蛋白的第二代穩(wěn)定細(xì)胞系，它們生產(chǎn)的慢病毒滴度在3.5-5×106TU/ml。此外，Tet-off系統(tǒng)也被用于在SODk1細(xì)胞中表達(dá)條件型SIN慢病毒，隨后用于SODk3第三代包裝細(xì)胞系中，該系統(tǒng)去除了HIV-1Tat反式激活蛋白及除了Rev之外的非必需基因。在這個(gè)cSIN轉(zhuǎn)移載體系統(tǒng)中，U3轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件被Tet反應(yīng)元件TRE替代。這種載體設(shè)計(jì)保留了SIN的特征，同時(shí)只能在表達(dá)Tet調(diào)控的反式激活因子tTA的細(xì)胞中生產(chǎn)慢病毒。標(biāo)準(zhǔn)的SIV轉(zhuǎn)移載體必須要通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合到穩(wěn)定包裝細(xì)胞中來(lái)避免逆轉(zhuǎn)錄后5’LTR失活，與此相反，cSIN轉(zhuǎn)移載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。事實(shí)上，逆轉(zhuǎn)錄發(fā)生之后，在多西霉素存在下，TRE會(huì)引導(dǎo)載體中含有包裝信號(hào)的前病毒全長(zhǎng)基因組轉(zhuǎn)錄來(lái)進(jìn)行慢病毒包裝。Tet調(diào)控的SODk1和SODk3包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)cSIN轉(zhuǎn)移載體之后，會(huì)分別生產(chǎn)出高濃度(>106TU/ml和1×107TU/ml)的cSIN重組載體。發(fā)展第二代包裝細(xì)胞的另一種策略是Virxsys建立的抗HIV基因治療，該方法是在293細(xì)胞中采用三水平級(jí)聯(lián)基因調(diào)控系統(tǒng)來(lái)避免毒性，包裝、包膜蛋白調(diào)控的基因的滲漏表達(dá)，組成型表達(dá)的tTA的毒性。此外，對(duì)Tat、Rev、Gag-Pol基因的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化來(lái)減少同源重組的發(fā)生。這種新方法雖然降低了包裝基因和VSV-g的總體毒性，但是它仍然不能抑制p24Gag的滲漏表達(dá)。含有抗HIV包膜蛋白基因反義核酸的VRX496載體可以在超過(guò)11天的時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出最高濃度相當(dāng)于3.5×107TU/ml和p24Gag300ng/ml的慢病毒。并沒(méi)有檢測(cè)到有復(fù)制能力的慢病毒，但是長(zhǎng)期分析發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)2-3個(gè)月之后有部分基因沉默。Virxsys及其它討論的包裝細(xì)胞是采用質(zhì)粒構(gòu)建的，這些質(zhì)粒隨著時(shí)間推移經(jīng)常會(huì)發(fā)生沉默，這也可以解釋慢病毒的短期穩(wěn)定性。為了克服這些問(wèn)題，2003年Ikeda及2009年Throm報(bào)道了采用整合型MLV載體作為整合型載體基因的導(dǎo)入工具。St.Jude用于治療X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷疾病的技術(shù)是基于構(gòu)建可誘導(dǎo)的第三代293T來(lái)源的GPR(gag-pol-rev)和第二代GPRT(gag-pol-revandtat)，在上述系統(tǒng)中，Rev和Tat的表達(dá)受Tet-off系統(tǒng)緊密調(diào)控。高表達(dá)的Rev基因會(huì)誘導(dǎo)其它的包裝基因、VSV-g基因和SIN轉(zhuǎn)移載體CL204i-EF1α-hγc-OPT,后者表達(dá)密碼子優(yōu)化的IL-2Rγc的cDNA，并且其兩端有400bp雞β球蛋白HS4的絕緣子序列。Ikeda報(bào)道的原始方法利用LTR驅(qū)動(dòng)MLV，而Throm及其合作者應(yīng)用SIN-MLV載體來(lái)避免LTR-MLV包裝基因組被包裝進(jìn)慢病毒顆粒。該方法引入的另一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)是為連接有抗生素抗性基因的SIN載體基因組整合而開(kāi)發(fā)的連環(huán)陣轉(zhuǎn)染技術(shù)。表達(dá)GFP或IL2RG基因的生產(chǎn)細(xì)胞可以生產(chǎn)出滴度超過(guò)5×107TU/ml的上清。如前所述，按照支持X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷疾病臨床試驗(yàn)的規(guī)模分兩次生產(chǎn)的大約280LCL204i-EF1α-hγc-OPT慢病毒，經(jīng)濃縮之后，其滴度達(dá)到4.5和7.2×108TU/ml。St.Jude兒童研究醫(yī)院利用GPRGT包裝細(xì)胞及表達(dá)Wiskott-Aldrich綜合癥蛋白的650MNDhWASp1包裝細(xì)胞生產(chǎn)臨床級(jí)別的VSV-g包被的Wiskott-Aldrich綜合癥慢病毒。為了獲得生產(chǎn)細(xì)胞，將U3區(qū)含有HS4染色質(zhì)絕緣子的轉(zhuǎn)移載體采用一種改進(jìn)的方法導(dǎo)入到細(xì)胞，該方法是在Throm的基礎(chǔ)上改進(jìn)的。將hWASp單體連接到博來(lái)霉素抗性基因而不是更長(zhǎng)的連環(huán)陣列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GPRGT細(xì)胞。該細(xì)胞克隆可以生產(chǎn)滴度超過(guò)1×107TU/ml未濃縮的慢病毒，并且在連續(xù)傳代時(shí)可以穩(wěn)定生產(chǎn)超過(guò)8星期。據(jù)我所知，到目前為止，只有GPRG-EF1α-hγcOPT包裝細(xì)胞已經(jīng)用于臨床試驗(yàn)，而650MNDhWASp1細(xì)胞僅僅打算最近用于臨床試驗(yàn)，該研究是由St.Jude兒童研究醫(yī)院開(kāi)展的。最近，第一個(gè)生產(chǎn)整合型缺陷慢病毒載體的穩(wěn)定包裝細(xì)胞由TalKafri小組開(kāi)發(fā)出來(lái)。該包裝細(xì)胞是通過(guò)轉(zhuǎn)染含有整合酶D64E突變體的四環(huán)素調(diào)控的包裝載體pTK1574和VSV-g基因進(jìn)入PVG3細(xì)胞，該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)反式激活因子tTA。生產(chǎn)細(xì)胞的建立要么通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)cSIN轉(zhuǎn)移載體(滴度：107TU/ml)，要么通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染一個(gè)新的多聚嘌呤位點(diǎn)缺失的轉(zhuǎn)移載體(滴度：108TU/ml)。這兩種整合缺失的慢病毒載體都適合體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠紋狀體中的神經(jīng)元。Tet-on誘導(dǎo)系統(tǒng)。OxfordBioMedica在293T細(xì)胞表達(dá)的EIAV慢病毒的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了一種穩(wěn)定包裝細(xì)胞系和一個(gè)Tet-on誘導(dǎo)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，向培養(yǎng)基中添加多西霉素之后，Tet抑制子(TetR)緊密調(diào)控VSV-g和Gag/Pol的表達(dá)。該系統(tǒng)與Tet-off系統(tǒng)相比滲漏表達(dá)更低。EIAV轉(zhuǎn)移載體編碼一個(gè)治療帕金森氏癥的基因治療產(chǎn)品：ProSavin。兩種ProSavin生產(chǎn)細(xì)胞PS5.8和PS46.2被詳細(xì)鑒定，它們即使在沒(méi)有選擇壓力的情況下也可以穩(wěn)定培養(yǎng)49天。病毒的滴度平均小于106TU/ml，與瞬時(shí)生產(chǎn)系統(tǒng)相當(dāng)。Tet-on/cumate誘導(dǎo)系統(tǒng)。Tet-off誘導(dǎo)系統(tǒng)不能完全消除VSV-g的滲漏表達(dá)從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性及包裝細(xì)胞不穩(wěn)定，因此開(kāi)發(fā)了一種叫293SFPacLV的雙開(kāi)關(guān)系統(tǒng)。該細(xì)胞來(lái)源于在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基中生產(chǎn)慢病毒的293SF細(xì)胞。293SFPacLV細(xì)胞表達(dá)cumate開(kāi)關(guān)系統(tǒng)的CymR抑制子及Tet開(kāi)關(guān)系統(tǒng)的反式激活因子rtTA2S-M2?；蛘T導(dǎo)是通過(guò)向培養(yǎng)基中添加多西霉素和cumate誘導(dǎo)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)GFP的cSIN慢病毒到包裝細(xì)胞之后，生產(chǎn)細(xì)胞可以產(chǎn)出3.4×107TU/ml的慢病毒。然而，盡管GFP標(biāo)記基因獲得了令人鼓舞的結(jié)果，但這些細(xì)胞從未進(jìn)入臨床研究階段。蛻皮激素誘導(dǎo)系統(tǒng)。該系統(tǒng)是基于昆蟲(chóng)蛻皮激素類(lèi)似物蛻皮激素A，被用于四環(huán)素調(diào)控技術(shù)的替代技術(shù)。蛻皮激素A反應(yīng)性293T細(xì)胞系中，gag、pol、rev和VSV-g的表達(dá)是由誘導(dǎo)型蛻皮激素啟動(dòng)子的控制之下。這種細(xì)胞不斷產(chǎn)生二代慢病毒，經(jīng)濃縮后可以達(dá)到108TU/ml。與此類(lèi)似，293-Rev/Gag/Pol細(xì)胞系是將HIVrev和gag/pol基因分別置于獨(dú)立的蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子下，然后導(dǎo)入293細(xì)胞。在篩選時(shí)，該細(xì)胞持續(xù)加入HIV特定的蛋白酶抑制劑Saquinavir來(lái)控制HIV蛋白酶的細(xì)胞毒性。誘導(dǎo)后48小時(shí)之內(nèi)，293-Rev/Gag/Pol細(xì)胞釋放出大量的HIVGag/Pol顆粒(大約10ugp24/ml)，它可以將第三代HIV載體包裝到很高的滴度。組成型包裝細(xì)胞毫無(wú)疑問(wèn)，具有高產(chǎn)量的組成型(或連續(xù)型)包裝細(xì)胞的獲得要比誘導(dǎo)型細(xì)胞難獲得的多。事實(shí)上，載體基因的毒性使得VSV-g包膜蛋白或篩選p24Gag高表達(dá)蛋白變得不可行。因此，這種類(lèi)型包含僅僅帶有不是VSV-g的包膜蛋白的包裝細(xì)胞，它們與誘導(dǎo)型細(xì)胞比起來(lái)通常產(chǎn)生比較低的p24Gag。第一個(gè)名叫STAR的連續(xù)型包裝細(xì)胞系是由Ikeda于2003年開(kāi)發(fā)出來(lái)的。STAR引入了多方面創(chuàng)新：(i)測(cè)試了三種gamma逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白：R-多肽切割位點(diǎn)引入HIV蛋白酶位點(diǎn)的貓科動(dòng)物的內(nèi)源性γ逆轉(zhuǎn)錄病毒RD114包膜蛋白(RD114-Pro)，帶有MLV的胞質(zhì)尾的長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GALV)，MLV4070A(Ampho)包膜蛋白。(ii)通過(guò)MLV整合載體而不是質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染來(lái)導(dǎo)入包裝基因。(iii)除了293T細(xì)胞，還測(cè)試了Hela和HT1080細(xì)胞。Gag-pol基因在MLVLTR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下，而其它的載體基因通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒表達(dá)。STAR技術(shù)適用于生產(chǎn)第二代和第三代慢病毒，可以連續(xù)3個(gè)月生產(chǎn)出最高到850ng/ml的p24，其濃度達(dá)到107TU/ml。然而，沒(méi)有STAR來(lái)源的生產(chǎn)細(xì)胞到達(dá)臨床應(yīng)用，因?yàn)樗赡軐⒕幋aGag-Pol和Rev基因的MLV基因組錯(cuò)誤包裝到慢病毒顆粒。隨后發(fā)展的WinPac細(xì)胞中的SIN-MLV載體聯(lián)合重組酶介導(dǎo)的表達(dá)盒交換技術(shù)(RMCE)降低了這種可能性。RMCE首先采用整合轉(zhuǎn)移載體的穩(wěn)定γ逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞來(lái)交換不同的轉(zhuǎn)基因，而在WinPac細(xì)胞中，RMEC技術(shù)被用于整合包裝基因。一個(gè)表達(dá)GFP標(biāo)簽的SIN-MLV載體用來(lái)篩選293FT細(xì)胞中最佳的表達(dá)位點(diǎn)，用一個(gè)靶向載體將GFP表達(dá)盒與密碼子優(yōu)化的HIV-1Gag-Pol表達(dá)盒交換。雖然RMCE是一個(gè)篩選基因組中開(kāi)放轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的非常有用的方法，但是在這里是用它似乎有點(diǎn)多余，因?yàn)楹Y選出來(lái)的支持GFP高表達(dá)的細(xì)胞不能支持具有細(xì)胞毒性的Gag-Pol基因產(chǎn)物的持續(xù)高表達(dá)，更重要的是，無(wú)論采用什么導(dǎo)入方法，最好的Gag-Pol表達(dá)位點(diǎn)可以非常簡(jiǎn)單直接的采用p24GagELISA檢測(cè)細(xì)胞上清來(lái)篩選。沒(méi)有毒性的包膜蛋白R(shí)D114-PR、rev基因及載體基因組質(zhì)粒被順序轉(zhuǎn)染到生產(chǎn)細(xì)胞，然后用抗生素篩選。獲得了超過(guò)106TU/ml的慢病毒，經(jīng)過(guò)濃縮之后可以提高到108TU/ml。降低胎牛血清的濃度到1%并在HYPERFlask中擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得了持續(xù)到第六次收獲、濃度超過(guò)5×106TU/ml的慢病毒。另一種組成型包裝技術(shù)是以MolMedS.p.A開(kāi)發(fā)的RD-MolPack細(xì)胞為代表。RD-MolPack系統(tǒng)與STAR、WinPax細(xì)胞類(lèi)似，也是基于HEK-293T細(xì)胞開(kāi)發(fā)的，也表達(dá)RD114包膜蛋白。與WinPac的RD-114-PR包膜蛋白不同，RD-MolPack細(xì)胞帶有RD114-TR包膜蛋白，該蛋白含有RD114蛋白的胞外和穿模結(jié)構(gòu)域并融合有MLV-Ampho4070膜蛋白的胞質(zhì)尾巴，從而利于整合入慢病毒載體。RD-MolPack細(xì)胞獨(dú)一無(wú)二的地方在于，HIV-1gag、pol、rev及潮霉素抗性基因是通過(guò)將嵌合baculo-AAV感染293T細(xì)胞導(dǎo)入的。細(xì)胞首先轉(zhuǎn)染表達(dá)AAVRep78的質(zhì)粒來(lái)引導(dǎo)baculo-AAV載體整合入基因組。產(chǎn)生的表達(dá)兩個(gè)拷貝gag-pol-rev基因的中間克隆PK-7顯示出極高的遺傳穩(wěn)定性，它可以在有或沒(méi)有潮霉素篩選的情況下連續(xù)培養(yǎng)一年，其生產(chǎn)的p24Gag水平分別為6.7±3.5和15.3±8.4ng/106細(xì)胞/天。從PK-7細(xì)胞分別獨(dú)立衍生出RD2-MolPack和RD3-MolPack來(lái)分別生產(chǎn)第二代和第三代慢病毒。與St.Jude兒童研究醫(yī)院的MolMed的策略類(lèi)似，包膜基因和Tat基因(僅指RD2-MolPack細(xì)胞)是通過(guò)VSV-g包被的SIN-LV而不是SIN-MLV整合載體導(dǎo)入的。在構(gòu)建包裝細(xì)胞中使用MLV或者HIVSIN的重大安全問(wèn)題是遙遠(yuǎn)的，但現(xiàn)實(shí)的可能是在新產(chǎn)生的慢病毒顆粒中動(dòng)員了載體基因(env或gag-pol)。事實(shí)上發(fā)現(xiàn)，SIN-LV真載體整合時(shí)東動(dòng)員頻率在0.1-0.03%左右，而SIN-MLV則會(huì)有一些痕量的3’LTR啟動(dòng)子活性。利用特殊的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)排除了上述安全問(wèn)題及產(chǎn)生有復(fù)制能力慢病毒的可能。RD2-MolPack-Chim3生產(chǎn)細(xì)胞，表達(dá)抗-HIVchim3治療基因(HIVVif的顯性負(fù)性突變體)，其產(chǎn)生的慢病毒超過(guò)了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人臍帶血造血干細(xì)胞所生產(chǎn)的VSV-g包被的慢病毒。從RD3-MolPack-GFP生產(chǎn)細(xì)胞生產(chǎn)的表達(dá)GFP的SIN-LV可以轉(zhuǎn)染90%的人外周血淋巴細(xì)胞，其MOI=3,水平與VSV-g包被的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染獲得的慢病毒相當(dāng)。有意思的是，RD2-和RD3-MolPack細(xì)胞生產(chǎn)的慢病毒滴度(106TU/ml,濃縮后108TU/ml)比通過(guò)用RD114-TR包膜蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)的慢病毒的滴度高。上述展示的不同系統(tǒng)不能簡(jiǎn)單的進(jìn)行比較，因?yàn)榇蠖鄶?shù)情況下，細(xì)胞生產(chǎn)能力指標(biāo)TU或ngp24/細(xì)胞/天并不是標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。對(duì)于穩(wěn)定的包裝細(xì)胞，細(xì)胞生產(chǎn)力必須毫無(wú)疑問(wèn)地考慮，這是使一個(gè)穩(wěn)定的系統(tǒng)有價(jià)值或沒(méi)有進(jìn)一步發(fā)展的最重要的參數(shù)之一。低生產(chǎn)力的細(xì)胞可以通過(guò)慢病毒載體的高感染力來(lái)補(bǔ)償，而這通常與高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有關(guān)。慢病毒載體純化下游回收過(guò)程應(yīng)以最低的成本為產(chǎn)品提供所需的濃度、純度和其他質(zhì)量屬性。這一說(shuō)法適用于所有大規(guī)模的制造過(guò)程，但往往不適用于研究目的的小規(guī)模凈化規(guī)程。小規(guī)模純化大多數(shù)研究級(jí)別的慢病毒是通過(guò)批次濃縮而不是粗制劑之后應(yīng)用的，濃縮基本上是通過(guò)兩步離心法產(chǎn)生的。在70000g通過(guò)超速離心濃縮后的慢病毒再通過(guò)蔗糖緩沖(50000g)純化，然后溶解在配方緩沖液中。一種改進(jìn)，特別是純度方面的改進(jìn)，代表了基于離心/色譜聯(lián)用的純化方法。例如，Kutner等評(píng)估了組合純化/濃縮方法。蔗糖緩沖的超速離心結(jié)合陰離子交換層析獲得了88.2%的收率，而相反的組合則獲得了77.6%的收率。在兩種方法中，濃縮都超過(guò)了100倍，病毒滴度都超過(guò)了1010TU/ml(VSV-g包被的慢病毒)。這些方法最大的缺點(diǎn)是它們無(wú)法進(jìn)行放大，最后病毒的純度由于細(xì)胞、培養(yǎng)基組分或者處理過(guò)程引入的污染而達(dá)不到體內(nèi)應(yīng)用。濃縮之后的慢病毒潛在地可能會(huì)在體內(nèi)導(dǎo)致副作用或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率降低。因此，基于色譜和膜分離的技術(shù)的純化方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)。其優(yōu)點(diǎn)是，這樣的凈化方案可以以可擴(kuò)展的方式開(kāi)發(fā)，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)慢病毒的工業(yè)級(jí)凈化。在這一背景下，幾個(gè)研究小組已經(jīng)表明，基于色譜和膜分離方法的純化方法不僅保證了載體安全性，而且顯著提高了載體效能。γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒下游加工原理的總體概述已經(jīng)由Segura和Rodrigues等人發(fā)表。

大規(guī)模下游處理考慮到工業(yè)應(yīng)用，在生物技術(shù)行業(yè)傳統(tǒng)上使用的工藝步驟已經(jīng)開(kāi)發(fā)用于慢病毒的下游處理。它們是基于膜(過(guò)濾/澄清，利用切向流過(guò)濾進(jìn)行濃縮/滲濾，基于膜的色譜)和色譜(離子交換色譜，親和色譜，體積排阻色譜)的技術(shù)。這些不同的過(guò)程步驟的組合是可變的，在某些情況下，不同的凈化原則可以用于相同的目的。此外，采用benzonase/DNase降解污染的DNA要么是是下游處理的一個(gè)步驟，要么在病毒生產(chǎn)階段已經(jīng)處理過(guò)。原則上，可以區(qū)分三個(gè)階段:(i)從粗病毒產(chǎn)品或澄清的細(xì)胞培養(yǎng)基中將靶分子捕獲是純化的第一步。(ii)中間純化包括在捕獲和優(yōu)化階段對(duì)澄清的粗產(chǎn)品進(jìn)行的步驟，這些步驟去除特定的雜質(zhì)。(iii)拋光是最后的步驟，目的是去除微量雜質(zhì)和雜質(zhì)，使活性和安全的產(chǎn)品以適合配方或包裝的形式存在。在這一階段的污染物往往是?構(gòu)象?到目標(biāo)分子，微量的雜質(zhì)或疑似滲漏的產(chǎn)品.實(shí)際上，任何類(lèi)型的色譜和超濾都用于中間提純和最后的拋光步驟。報(bào)道的用于慢病毒下游處理的技術(shù)總結(jié)在Table3中。各個(gè)研究團(tuán)隊(duì)之間最大的差異是靶分子捕獲階段。Scherr、Yamada、Slepushkin、Bellintani、Merten、Greene等證實(shí)可以用陰離子交換色譜來(lái)純化VSV-g包被的慢病毒，而大規(guī)模純化步驟是基于低壓柱層析或基于膜的陰離子交換層析。當(dāng)被用作第一步純化時(shí)，這種膜盒可以最多每天純化1500L樣品。擴(kuò)大規(guī)模可以直接獲得純的慢病毒(如去掉超過(guò)98%污染的蛋白和DNA)；然而，慢病毒的復(fù)性并不像超離那樣高效。色譜基質(zhì)的低回收率是由于LV脆性施加的限制性工藝條件所致。事實(shí)上，慢病毒對(duì)pH變化及高鹽濃度非常敏感，而這兩個(gè)指標(biāo)正是離子交換色譜優(yōu)化結(jié)合和洗脫脫條件經(jīng)常改變的。此外，Segura等人開(kāi)發(fā)出一種基于肝素的親和色譜柱。利用這種方法，超過(guò)94%的蛋白雜質(zhì)和56%的殘留DNA被去除，而慢病毒的回收率有53%。盡管這些數(shù)據(jù)很有希望，但是這種色譜介質(zhì)不是工業(yè)生產(chǎn)合適的選擇，因?yàn)樗袆?dòng)物來(lái)源的組分肝素。為了濃縮大批量樣品(上清或中間產(chǎn)品)，切向流過(guò)濾系統(tǒng)備用來(lái)滲濾或緩沖液交換及配方。在工業(yè)下游處理規(guī)程的后期階段或小規(guī)模處理，使用一次性離心設(shè)備和較大規(guī)模的中空纖維或平膜盒。切向流過(guò)濾也成功用于濃縮和滲慮非VSV-g包被的慢病毒。根據(jù)治療適應(yīng)癥（即在體內(nèi)給藥或在體外應(yīng)用），濃度倍數(shù)將顯著變化。果向腦內(nèi)注射慢病毒，例如OxfordBiomedica采用Prosavin治療帕金森氏癥，慢病毒需要高度濃縮，因?yàn)榇竽X能注射的體積是非常小的。在這種特殊情況下，兩次切向流過(guò)濾可以獲得超過(guò)108TU/ml滴度的慢病毒。因此，切向流過(guò)濾是純化的最終步驟，因?yàn)槿绻尤肴魏稳?.2um過(guò)濾的步驟都會(huì)顯著降低得率和濃度。最后，體積排阻色譜可以用作最后拋光步驟，因?yàn)樗梢愿咝У厝コ行∮谏V基質(zhì)顆粒的雜質(zhì)。750kDa(相當(dāng)于50nm)是可用于排除任何慢病毒顆粒(大?。?0-120nm)潛在停留最大孔徑。然而，該方法最大的缺點(diǎn)是會(huì)將慢病毒濃度最少稀釋3倍。很多大規(guī)模純化規(guī)程都將體積排阻色譜作為最后的拋光步驟。Figure3展示了一些大規(guī)模純化的規(guī)程，其中一些細(xì)節(jié)可以看到。可以分辨出哪些規(guī)程從小規(guī)模純化到大規(guī)模純化的變化多或者少，還有可有有些大規(guī)模純化規(guī)程沒(méi)有任何色譜步驟(貝克曼研究所采用)，有些是不同分離方法的組合(至少含有一個(gè)色譜步驟)。慢病毒大規(guī)模純化的常用捕獲步驟包括：用膜過(guò)濾澄清(見(jiàn)Figure3)，隨后用切向流過(guò)濾/超濾(貝克曼研究所)或者體積排阻色譜(Virxsys,Généthon/MolMed,OxfordBioMedica/Henogen,St.JudeChildren’sResearchHospital)來(lái)濃縮。除了一個(gè)用穩(wěn)定細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)慢病毒外，其它的操作規(guī)程都采用benzonase步驟來(lái)降低細(xì)胞殘留的、質(zhì)粒來(lái)源的DNA污染。然而，這個(gè)步驟在貝克曼研究所、Généthon/MolMed、OxfordBioMedica/Henogen的方法中用在捕獲步驟中；而在Virsys的方法中則用在捕獲之后。這兩種方法各有利弊:先用benzonase步驟的優(yōu)點(diǎn)是可以去除大的DNA片段，并且下面的步驟可以去除殘留benzonase；然而所用的benzonase的量也非常大。與此相反，將benzonase步驟后置的優(yōu)點(diǎn)是可以大幅降低benzonase的量(成本降低)；然而，后面的步驟必須有將benzonase去除到檢測(cè)不到的水平的能力。此外，后期用benzonase的缺點(diǎn)是大分子的核算污染可能會(huì)結(jié)合慢病毒顆粒形成沉淀，進(jìn)而導(dǎo)致慢病毒在后續(xù)的步驟中丟失。貝克曼研究所開(kāi)發(fā)的純化規(guī)程的特征是只有一個(gè)額外的純化步驟(中間純化=拋光步驟)，即超速離心步驟。其它的所有規(guī)程都利用濃縮/滲濾步驟(最為中間純化步驟)及最后的滲濾(Virxsys,OxfordBioMedica/Henogen)或體積排阻色譜(Généthon/MolMed)作為拋光步驟。大多數(shù)操作規(guī)程的最后步驟是采用0.2um的膜過(guò)濾。這是在GMP條件下降低最終產(chǎn)品微生物污染風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)要求。雖然強(qiáng)烈推薦無(wú)菌過(guò)濾，但前提是該過(guò)程必須被證明是完全無(wú)菌的。這就需要無(wú)菌工藝驗(yàn)證，這是通過(guò)介質(zhì)的工藝實(shí)驗(yàn)來(lái)完成，該操作必須在符合Class100(美國(guó))或GradeA(歐盟)標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。雖然過(guò)濾是保證產(chǎn)品無(wú)菌灌裝前的最方便的方法，由OxfordBioMedica開(kāi)發(fā)的下游處理工藝已經(jīng)將該步驟放在第一個(gè)切向流過(guò)濾濃縮之后及最后一個(gè)切向流過(guò)濾步驟之前，從而降低因在慢病毒高濃度下被膜吸附而導(dǎo)致的丟失。最后，有一個(gè)大規(guī)模純化工藝沒(méi)有最后的無(wú)菌過(guò)濾步驟，因?yàn)樵撋a(chǎn)工藝是在半封閉系統(tǒng)內(nèi)完成的。在這種情況下，每個(gè)子批次都進(jìn)行無(wú)菌檢查，只有在無(wú)菌性得到驗(yàn)證后才進(jìn)行集中。Figure3.VSV-g包被的慢病毒大規(guī)模純化下游工藝的主要步驟(臨床應(yīng)用)。紅色顯示的公司/研究所說(shuō)明他們的下游處理工藝?yán)昧穗x子交換層析。(?)-沒(méi)有該過(guò)程步驟的詳細(xì)信息(例如過(guò)濾步驟，沒(méi)有說(shuō)明孔徑/排阻孔徑)。除菌-除菌過(guò)濾(0.2um)。*Greene等在純化穩(wěn)定細(xì)胞系生產(chǎn)的臨床材料時(shí)采用了一種沒(méi)有benzonase及下游滲濾步驟的相似的純化工藝。**Ausubel發(fā)表的工藝沒(méi)有用最后的除菌過(guò)濾，因此每批次或亞批次樣品在最終處理和進(jìn)一步應(yīng)用前需要獨(dú)立進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)。LV：慢病毒載體；SEC：體積排阻色譜；TFF:切向流過(guò)濾；VSV-g:水泡性口炎病毒糖蛋白。下游處理工藝的性能如下：除了貝克曼研究所用超速離心開(kāi)發(fā)并發(fā)表的濃縮150-200倍的方法(Table4)，其他所有工藝的濃縮指數(shù)都是10-80之間。OxfordBioMedica開(kāi)發(fā)的工藝的特點(diǎn)是利用連續(xù)的兩次濃縮/滲濾(TFF)達(dá)到了濃縮指數(shù)2000?？傮w的回收率在20-40%。所有的純化工藝得到了可比較的慢病毒濃度，即1×108-2×109ip/ml。這些大的差異主要是由于預(yù)純化病毒的滴度、為標(biāo)準(zhǔn)化的滴定方法及病毒質(zhì)粒載體(啟動(dòng)子、所轉(zhuǎn)的基因)除了獲得載體的滴度及產(chǎn)量，慢病毒批次更關(guān)心的指標(biāo)主要是各種污染物的去除?？侱NA污染的去百分比在99.1-99.84%，總蛋白污染物的去除百分比在99.85-99.9%。針對(duì)宿主細(xì)胞的DNA及蛋白，有報(bào)道其去除百分比分別為99.8%和99.4%。因?yàn)椴粌H殘存的DNA可能是個(gè)問(wèn)題，而且DNA的大小以及由此引起的可能轉(zhuǎn)移整個(gè)有功能的開(kāi)放閱讀框也是問(wèn)題，因此監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)殘存DNA污染的最大分子量的要求越來(lái)越高。例如，F(xiàn)DA的指南‘用于生產(chǎn)用于傳染病適應(yīng)癥的病毒疫苗的細(xì)胞基質(zhì)和其他生物材料