《RNA的轉(zhuǎn)錄合成》課件

第八章RNA的轉(zhuǎn)錄合成RNABiosynthesisTranscription1精選課件ppt8.1概述分子生物學(xué)最基本的原理是：基因是唯一能夠自主復(fù)制、永久存在的遺傳單位，其生物學(xué)功能是以蛋白質(zhì)的形式表達(dá)出來(lái)的DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過(guò)自主復(fù)制得到永存，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄生成信使RNA、翻譯生成蛋白質(zhì)的過(guò)程來(lái)控制生命現(xiàn)象2精選課件ppt8.1概述轉(zhuǎn)錄（transcription）：指拷貝一條與DNA鏈序列完全相同（除了T→U之外）的RNA單鏈的過(guò)程

基因表達(dá)的核心步驟翻譯（translation）：指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子翻譯成氨基酸序列、合成多肽鏈的過(guò)程

基因表達(dá)的最終目的3精選課件ppt轉(zhuǎn)錄(transcription)生物體以DNA為模板合成RNA的過(guò)程。

轉(zhuǎn)錄RNADNA

4精選課件ppt體外兩條鏈均可轉(zhuǎn)錄體內(nèi)僅有一條鏈轉(zhuǎn)錄與mRNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈(codingstrand)、+鏈或稱有意義鏈(sensestrand)、Crick鏈另一條根據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈稱為模板鏈(templatestrand)或稱-鏈、反義鏈(antisensestrand)、Watson鏈8.1.1一般特點(diǎn)5精選課件ppt8.1.2真核和原核基因轉(zhuǎn)錄的差異原核生物真核生物RNA聚合酶1種3種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼序列內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄場(chǎng)所細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核mRNA多順?lè)醋訂雾樂(lè)醋?精選課件ppt模板識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始通過(guò)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的延伸終止8.1.3主要階段7精選課件pptRNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過(guò)程啟動(dòng)子：基因轉(zhuǎn)錄起始所必需的一段DNA序列轉(zhuǎn)錄起始前，啟動(dòng)子附近的DNA雙鏈分開(kāi)形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對(duì)模板識(shí)別8精選課件pptRNA鏈上第一個(gè)核苷酸鍵的形成轉(zhuǎn)錄起始9精選課件ppt核心酶

····DNA

····RNA10精選課件ppt轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個(gè)核苷酸短鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)啟動(dòng)子階段此時(shí)RNA聚合酶一直處于啟動(dòng)子區(qū)，新生的RNA鏈與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來(lái)并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開(kāi)始一旦RNA聚合酶成功地合成9個(gè)以上核苷酸并離開(kāi)啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄就進(jìn)入延伸階段通過(guò)啟動(dòng)子的時(shí)間代表啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，時(shí)間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率越高通過(guò)啟動(dòng)子11精選課件pptRNA聚合酶離開(kāi)啟動(dòng)子沿RNA鏈移動(dòng)并使新生RNA鏈不斷伸長(zhǎng)的過(guò)程就是轉(zhuǎn)錄的延伸當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時(shí)，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA－DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板鏈上釋放出來(lái)，這就是轉(zhuǎn)錄的終止轉(zhuǎn)錄的延伸和終止12精選課件ppt參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料:

NTP(ATP、UTP、GTP、CTP)模板:

DNA酶:

RNA聚合酶(RNApolymerase，RNA-pol)其他蛋白質(zhì)因子13精選課件ppt復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別14精選課件ppt8.2模板和酶

TemplatesandEnzymes15精選課件ppt8.2.1轉(zhuǎn)錄模板5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈模板鏈mRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯16精選課件ppt5

3

3

5

模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向17精選課件ppt在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄

asymmetrictranscription18精選課件ppt8.2.2RNA聚合酶

RNApolymerase

19精選課件ppt大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基基因相對(duì)分子量亞基數(shù)組分功能αrpoA400002核心酶負(fù)責(zé)核心酶組裝啟動(dòng)子識(shí)別βrpoB1500001核心酶β亞基能與模板DNA、新生的RNA鏈以及核苷酸底物相結(jié)合β'rpoC1600001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心ω？90001核心酶？σrpoD32000~900001σ因子負(fù)責(zé)模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始存在多種σ因子，用于識(shí)別不同的啟動(dòng)子20精選課件ppt核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)

21精選課件pptE.coli中不同的σ因子22精選課件pptRNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合23精選課件ppt識(shí)別DNA雙鏈上的啟動(dòng)子使DNA變性在啟動(dòng)子處解旋成單鏈通過(guò)閱讀啟動(dòng)子序列，RNApol確定它自己的轉(zhuǎn)錄方向和模板鏈最后當(dāng)它達(dá)到終止子時(shí)，通過(guò)識(shí)別停止轉(zhuǎn)錄RNApol執(zhí)行多功能24精選課件ppt真核生物的RNA聚合酶酶位置轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對(duì)活性對(duì)α-鵝膏蕈堿的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶Ⅱ核質(zhì)hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶Ⅲ核質(zhì)tRNA約10%存在物種特異性25精選課件ppt3種聚合酶都由2個(gè)大亞基、12個(gè)以上的小亞基組成在3種聚合酶之間，最大2個(gè)亞基、至少5個(gè)小亞基的基因編碼區(qū)具有同源性；4-7種小亞基為各種RNA聚合酶特有都具有原核RNA聚合酶核心α2ββ?同源的亞基最大亞基與β?相似，次最大亞基與β相似真核生物RNA聚合酶的共同特征26精選課件ppt真核生物RNA聚合酶II（RNAPolII）與模板結(jié)合；與轉(zhuǎn)錄起始、延伸有關(guān)與DNA、底物和新生的RNA結(jié)合負(fù)責(zé)酶的裝配250KDa130KDa40KDa40KDa

由8~14個(gè)亞基組成，分子質(zhì)量為500KDa27精選課件pptB220～240Kda—與模板結(jié)合，與鏈的起始，延伸有關(guān)，相當(dāng)于原核RNAPol的β′亞基C端含有羧基末端功能區(qū) 大亞基B140～150Kda—與DNA、底物和新生的RNA結(jié)合，相當(dāng)于原核RNAPolβ

B44.5—酶的連接，相當(dāng)于原核RNA的α亞基 RNAPolⅡ ABC27KDa磷酸化蛋白，1類—三種RNAPol共有，如ABC25.5KDa與DNA結(jié)合有關(guān) ABC23KDa B12.6 小亞基2類—PolⅡ特有B23 B14.5 B10 3類—在某些條件下可除去的亞基 B23 參與酶的基本結(jié)構(gòu) B16.5 細(xì)胞器的RNAPol—和噬菌體的RNA相似，因有單一固定的功能，分子量較小 真核生物聚合酶的成分及功能

28精選課件ppt（二）RNA聚合酶Ⅱ

羧基末端結(jié)構(gòu)域（CTD）：1、位置：RNA聚合酶Ⅱ最大亞基羧基末端2、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）具有7個(gè)氨基酸（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser）

的重復(fù)序列（酵母：重復(fù)26次；哺乳類：52次）

（2）多個(gè)磷酸化位點(diǎn)：Ser、Thr

29精選課件ppt作用CTD磷酸化對(duì)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄有重要作用：（1）CTD去磷酸化，RNA聚合酶II易與DNA結(jié)合，這種構(gòu)象適于轉(zhuǎn)錄的起始；（2）CTD磷酸化可使RNA聚合酶II與DNA的結(jié)合變得松弛，形成適于延伸的構(gòu)象30精選課件ppt原核生物一個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，稱為操縱子(operon)，包括若干個(gè)結(jié)構(gòu)基因及其上游(upstream)的調(diào)控序列模板上酶的辨認(rèn)、結(jié)合5

3

3

5

結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列RNA-pol位于基因上游，與RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄有關(guān)的DNA順序稱為啟動(dòng)子（promoter)31精選課件ppt開(kāi)始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205

3

3

5

原核生物啟動(dòng)子保守序列RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognitionsite)5

5

RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因3

3

32精選課件ppt典型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)

-35-10轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp33精選課件ppt原核生物中轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的共同序列34精選課件pptTATA盒CAAT盒GC盒增強(qiáng)子順式作用元件結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動(dòng)子保守序列35精選課件pptⅡ類啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)TATA框核心元件啟始子（initiator，Inr）:一般由PY2CAPY5構(gòu)成，

位于-3～+5，可能提供RNApolⅡ識(shí)別。CAATbox、Ⅱ類啟動(dòng)子上游元件組成GCboxOct．增強(qiáng)子（enhomcer）遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)減弱子（dehancer）靜息子（sisencer）上游激活序列（upstreamactivatingseguencesUASs）

36精選課件ppt8.3轉(zhuǎn)錄過(guò)程TheProcessofTranscription37精選課件ppt（一）轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個(gè)問(wèn)題：RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開(kāi)，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。一、原核生物的轉(zhuǎn)錄過(guò)程38精選課件ppt2.DNA雙鏈解開(kāi)1.RNA聚合酶全酶(

2)與模板結(jié)合3.在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物RNApol(

2

)-DNA-pppGpN-OH3

轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:5

-pppG-OH+

NTP

5

-pppGpN

-OH3

+ppi轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程39精選課件ppt40精選課件ppt轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成后，可以進(jìn)入兩種途徑：流產(chǎn)式起始：合成并釋放2～9個(gè)核苷酸的RNA短鏈釋放σ亞基，通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)，生成轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物（核心酶、DNA和新生的RNA）41精選課件ppt（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)1.

亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。(NMP)n

+

NTP

(NMP)n+1

+PPi42精選課件ppt轉(zhuǎn)錄泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）····DNA····RNA43精選課件ppt44精選課件ppt45精選課件ppt46精選課件ppt5

3

DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶47精選課件ppt（三）轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來(lái)不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來(lái)。在原核細(xì)胞中有兩種不同的終止子，一種是強(qiáng)終止子，另一種是弱終止子。強(qiáng)終止子在體外實(shí)驗(yàn)中，無(wú)需其他任何因子的幫助就可以終止核心酶，這種終止子被稱為內(nèi)部終止子（intrinsicterminators）。弱終止子需要在一種蛋白質(zhì)因子ρ（rhofactor）的幫助一才能終止，所以又稱為ρ依賴性終止子（Rho-dependentterminator）。48精選課件pptATP1.依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止49精選課件ppt2.非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來(lái)終止轉(zhuǎn)錄。50精選課件ppt5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5

TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3

DNAUUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)51精選課件ppt莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5′pppG53

35RNA-pol52精選課件ppt二、真核生物的轉(zhuǎn)錄起始（一）轉(zhuǎn)錄起始真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，RNA-pol不直接結(jié)合模板，其起始過(guò)程比原核生物復(fù)雜。53精選課件ppt真核RNA聚合酶II啟動(dòng)子和增強(qiáng)子通過(guò)蛋白質(zhì)的介導(dǎo)互相結(jié)合，形成環(huán)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄(引自Griffithsetal1999)54精選課件ppt真核生物的轉(zhuǎn)錄和原核轉(zhuǎn)錄的不同點(diǎn)(1)原核只有一種RNA聚合酶，而真核細(xì)胞有三種聚合酶(2)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，真核有三種不同的啟動(dòng)子和有關(guān)的元件(3)真核的轉(zhuǎn)錄有很多蛋白質(zhì)因子的介入55精選課件ppt(三)RNApolⅠ啟動(dòng)子核心啟動(dòng)子（corepromoter）或核心元件（coreelement），位于-45到+20，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始。上游控制元件（upstream,controlelementUCE），從-180延伸到-107，可增加核心元件的轉(zhuǎn)錄起始的效率。56精選課件ppt－170－160－150－140－130－120－110………－60－－50－40－30－20－101＋10＋20上游控制區(qū)核心啟動(dòng)子

UBF1UBF1結(jié)合于G－C豐富區(qū)

SL1SL1與UBF1協(xié)同結(jié)合TFⅡB

Pol1

?

57精選課件ppt58精選課件ppt1型內(nèi)部啟動(dòng)子2型內(nèi)部啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)

boxAboxCboxAboxB

TFIIIATFIIICTFIIIC

TFIIIBTBPτAτBTFIIICTFIIIB

PloIIIPolIII59精選課件pptRNApolⅢ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能因子 結(jié)構(gòu) 功能 TFⅢA38Kda,有9個(gè)鋅指結(jié)合于1型內(nèi)部啟動(dòng)子(5sRNA基因)的C框，使ⅢC結(jié)合在C框下游，輔助ⅢB定位結(jié)合TFⅢB含TBP和另外二種蛋白 定位因子，使Pol結(jié)合在起始位點(diǎn)上 TFⅢC含τA和τB,有5個(gè)亞基τB結(jié)合Ⅱ型內(nèi)部啟動(dòng)子(tRNA基因)的B框，起增強(qiáng)子的作用。τA結(jié)合A框，起啟動(dòng)子的作用；輔助ⅢB定位結(jié)合 TBP 是ⅢB,ⅡD,SL1的亞基 和特異DNA序列及RNAPol結(jié)合，使Pol結(jié)合在正確的位點(diǎn)上 TFⅡD 含TBP亞基 結(jié)合TATA框，確定選擇PolⅢ PBP 次近端結(jié)合蛋白 可能和ⅡD一道輔助ⅢB定位結(jié)合的另一途徑 60精選課件ppt

TBPPolIII啟動(dòng)子

TFIIIBTFIIICTBPRNAPolIIIPolI啟動(dòng)子SL1RNAPolITBPUBF1PolII啟動(dòng)子

TFIIDTATA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)RNAPolII

61精選課件ppt轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)TATA盒CAAT盒GC盒增強(qiáng)子順式作用元件(cis-actingelement)1.轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段AATAAA切離加尾轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)修飾點(diǎn)外顯子翻譯起始點(diǎn)內(nèi)含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體62精選課件ppt63精選課件ppt2.轉(zhuǎn)錄因子能直接、間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionalfactors,TF)。64精選課件ppt參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ

65精選課件ppt人類Ⅱ型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子 因子 分子量 功能 RNAPolⅡ≥10K 依賴模板合成RNA TFⅡA 12,19,35K穩(wěn)定TFⅡD和DNA的結(jié)合，激活TBP亞基 TFⅡB 33K 結(jié)合模板鏈（-10～+10），起始PolⅡ結(jié)合，和TFⅡE/F相互作用 TFⅡD (TBP,30K)TBP亞基識(shí)別TATA，將聚合酶組入復(fù)合體中，TAFs識(shí)別特殊啟動(dòng)子 TFⅡE 34K(β)結(jié)合在PolⅡ的前部，使復(fù)合體的保護(hù)區(qū)延伸到下游 57K(α)TFⅡF 38,74K 大亞基具解旋酶活性（RAP74）,小亞基和PolⅡ結(jié)合，介導(dǎo)其加入復(fù)合體 TFⅡH 具激酶活性，可以磷酸化PolⅡC端的CTD，使PolⅡ逸出，延伸 TFⅡI 120K 識(shí)別Inr，起始TFⅡF/D結(jié)合 TFⅡJ 在TFⅡF后加入復(fù)合體，不改變DNA的結(jié)合方式 TFⅡS RNA合成延伸 66精選課件ppt順式作用元件在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，相對(duì)同一染色體或DNA分子而言為“順式”（cis）；對(duì)不同染色體或DNA分子而言為“反式”（trans）順式作用元件是同一DNA分子中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列存在于基因旁側(cè)序列它們的作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控，本身不編碼任何蛋白質(zhì),僅僅提供一個(gè)作用位點(diǎn),要與反式作用因子相互作用而起作用67精選課件ppt68精選課件ppt3.轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiationcomplex,PIC)

真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。69精選課件pptPOL-ⅡTFⅡFⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化轉(zhuǎn)錄的PICPOL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-