第三章病毒和亞病毒

Microbiology

第三章病毒和亞病毒進(jìn)入微生物的世界Microbiology

同人類爭(zhēng)奪地球統(tǒng)治權(quán)的唯一競(jìng)爭(zhēng)者就是病毒——JoshuaLederberg1958年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者本章內(nèi)容第一節(jié)病毒第二節(jié)亞病毒因子第三節(jié)病毒與實(shí)踐Microbiology

病毒的發(fā)現(xiàn)和研究歷史3000BC埃及孟非思壁畫中長(zhǎng)老患小兒麻痹癥。Microbiology

早在1566年就有了關(guān)于瘋狗咬人致病，即狂犬病的記載并發(fā)現(xiàn)它能夠傳染給其他許多動(dòng)物另一種病毒軟疣的報(bào)告，這張1841年的手繪圖就是一個(gè)證據(jù)。Microbiology

第一個(gè)記載的植物病毒病當(dāng)屬郁金香碎色花病，至今荷蘭阿姆斯特丹的博物館還保存著一張1619年荷蘭畫家的一幅得病的郁金香靜物畫。病毒的研究歷史1886年，德國(guó)A.Mayer發(fā)現(xiàn)煙草上出現(xiàn)深淺相同的綠色區(qū)域，他稱為煙草花葉病，隨后又用實(shí)驗(yàn)證實(shí)它具有傳染性。Microbiology

1892年，俄國(guó)學(xué)者D.Ivanovysky發(fā)現(xiàn)煙草花葉病病原體能通過細(xì)菌濾器：一種能通過細(xì)菌濾器的“細(xì)菌毒素”或極小的細(xì)菌。1898年，荷蘭生物學(xué)家MWBeijerinck對(duì)煙草花葉病病原體的研究結(jié)果：Microbiology

能通過細(xì)菌濾器；可被乙醇沉淀而不失去其感染性；能在瓊脂凝膠中擴(kuò)散；用培養(yǎng)細(xì)菌的方法不能被培養(yǎng)出來，

推測(cè)只能在植物活細(xì)胞中生活。結(jié)論：病原體是一種比細(xì)菌還小的“有傳染性的活的流質(zhì)”。真正發(fā)現(xiàn)病毒存在的是貝葉林克，給病毒起拉丁名叫“Virus”也是他。

一百多年以來，煙草花葉病毒在病毒學(xué)發(fā)展史乃至遺傳學(xué)、生物化學(xué)及當(dāng)代基因工程中起到里程碑的作用Microbiology

1915年圖爾特（F.W.Twort）發(fā)現(xiàn)噬菌體。1917年迪海萊（F.D'Herelle）：（1）痢疾桿菌培養(yǎng)液（渾濁）+污水

（2）培養(yǎng)液變清澈

（3）細(xì)菌過濾器

（4）清液+痢疾桿菌培養(yǎng)液（渾濁）

（5）培養(yǎng)液變清澈

（6）引起細(xì)胞破裂的因子叫噬菌體Microbiology

1935年，Stanley分離提純了TMV結(jié)晶Bawden提示了TMV實(shí)質(zhì)是核蛋白1940年，Kausche用電鏡看到了TMV的桿狀外形1952年Kershey和Chase噬菌體傳物質(zhì)是DNA1955年，F(xiàn)ranenkel---conrat完成病毒拆開實(shí)驗(yàn)1960年，Anderer弄清了TMV外殼蛋白亞基aa排序1965年，Spiegelma首次在細(xì)胞外復(fù)制E.coli噬菌體1970年，Baltimore和Temin發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶1以后相繼發(fā)現(xiàn)了亞病毒，朊病毒，擬病毒并相繼測(cè)出各類病毒核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)完成了幾種病毒基因組的測(cè)序并將完成所有病毒測(cè)序

研究病毒（virus）的本質(zhì)及其與宿主的相互作用的科學(xué)。Microbiology

病毒學(xué)（virulogy）

極大地豐富了現(xiàn)代生物學(xué)的理論與技術(shù)；

有效地控制和消滅病毒病害；

利用病毒進(jìn)行生物防治；

發(fā)展以病毒基因工程為中心的生物高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)。非細(xì)胞生物Microbiology

真病毒（Euvirus）

至少含有核酸和蛋白質(zhì)兩種組分。亞病毒因子（Subvirus）類病毒：只含具有獨(dú)立侵染性的RNA組分?jǐn)M病毒：只含不具獨(dú)立侵染性的RNA組分衛(wèi)星病毒：與真病毒伴生的缺陷病毒衛(wèi)星核酸：只含與侵染無(wú)關(guān)的RNA組分朊病毒：只含單一蛋白質(zhì)組分第一節(jié)

病毒

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一、什么是病毒

病毒（virus）是一類由核酸和蛋白質(zhì)等少數(shù)幾種成分組成的超顯微“非細(xì)胞生物”，其本質(zhì)是一種只含DNA或RNA的遺傳因子。Microbiology

超顯微的沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的專性活細(xì)胞內(nèi)寄生1.病毒的特點(diǎn)（1）個(gè)體微小，在電子顯微鏡下才能看見；（2）不具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有一般化學(xué)大分子的特征；

例如，一些簡(jiǎn)單的病毒僅由核酸和蛋白質(zhì)外殼

構(gòu)成，故可把它們視為核蛋白分子。

朊病毒甚至僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成。（3）一種病毒的毒粒內(nèi)只含有一種核酸，DNA或者RNA；（4）大部分病毒沒有酶或酶系不完全，不能進(jìn)行獨(dú)立的

代謝作用。嚴(yán)格的活細(xì)胞內(nèi)寄生。Microbiology

（5）以核酸和蛋白質(zhì)的裝配實(shí)現(xiàn)大量繁殖；（6）對(duì)大多數(shù)抗生素不敏感，對(duì)干擾素敏感；

例外，利福平可抑制痘病毒復(fù)制。（7）離體條件下，能以無(wú)生命的生物大分子狀態(tài)存在，

并可長(zhǎng)期保持其侵染活力；（8）有些病毒的核酸還能整合到宿主的基因組中，

并誘發(fā)潛伏性感染。Microbiology

2.病毒的兩種存在狀態(tài)感染態(tài)：活細(xì)胞內(nèi)專性寄生（宿主體內(nèi)）Microbiology

非感染態(tài)：以無(wú)生命的生物大分子狀態(tài)長(zhǎng)期

存在，并可保持其侵染活性。

（離體條件下）3.病毒的宿主范圍病毒幾乎可以感染所有的細(xì)胞生物，并具有宿主特異性。Microbiology

細(xì)菌或放線菌噬菌體（phage,bacteriophage）植物植物病毒（plantviruses）人或動(dòng)物動(dòng)物病毒（animalviruses）二、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)與分類（一）病毒的大?。ǘ┎《镜男螒B(tài)構(gòu)造（三）病毒的核酸（四）病毒的分類Microbiology

（一）病毒的大小絕大多數(shù)病毒都是能通過細(xì)菌過濾器的微小顆粒，直徑在20~200nm范圍內(nèi)，必須在電鏡下觀察。Microbiology

微生物個(gè)體直徑的比均為：

病毒：細(xì)菌：真菌=1:10：100的Microbiology

病毒的大小大病毒d=200nm的

牛痘病毒

（smallpox）小病毒d=28nm的

脊髓灰質(zhì)炎病毒

（poliovirus）Microbiology

天花病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒噬菌體Mimivirus，是2003年才被發(fā)現(xiàn)的，它比一般的病毒大得多，幾乎有小型細(xì)菌那么大，寄生在水生單細(xì)胞動(dòng)物阿米巴變形蟲中。Microbiology

MimivirusMimivirusparticleMimivirusvsamycoplasma（支原體）cellMicrobiology

該病毒有1260個(gè)基因，其中50個(gè)基因的功能此前從未在病毒中發(fā)現(xiàn)過，這些功能包括修復(fù)DNA，將信使RNA“翻譯”成蛋白質(zhì)等。Microbiology

Mimivirusparticleinfectinganameoba（二）病毒的形態(tài)（1）典型病毒粒的構(gòu)造（2）病毒粒的對(duì)稱體制（3）病毒的群體形態(tài)Microbiology

（1）典型病毒粒的構(gòu)造病毒是一類非細(xì)胞生物，故稱之為病毒粒或病毒體（viron）。Microbiology

病毒有時(shí)也稱病毒顆?；虿《玖Ｗ樱╲irusparticle）,專指成熟的、結(jié)構(gòu)完整的和有感染性的單個(gè)病毒。病毒長(zhǎng)什么樣子？核衣殼Microbiology

衣殼（蛋白質(zhì)外殼）核心（核酸）DNA：DNA病毒

（如痘病毒、腺病毒）RNA：RNA病毒

（如HIV、脊髓灰質(zhì)炎病毒等）只含有其中一種核酸毒粒的形狀球形顆粒（或稱擬球形顆粒）桿狀顆粒復(fù)雜形顆粒（如蝌蚪狀、卵形）Microbiology

（2）病毒粒的對(duì)稱體制Microbiology

3類典型形態(tài)的病毒及其代表A.螺旋對(duì)稱的代表——煙草花葉病毒B.二十面體對(duì)稱的代表——腺病毒C.復(fù)合對(duì)稱的代表——T偶數(shù)噬菌體Microbiology

螺旋對(duì)稱的代表——煙草花葉病毒煙草花葉病毒，簡(jiǎn)稱TMV（tobaccomosaicvirus），是一種植物病毒，在病毒學(xué)發(fā)展史上有其獨(dú)特的地位。它是發(fā)現(xiàn)最早、研究最深入和了解最清楚的一種病毒。Microbiology

煙草花葉病毒TMV的

形態(tài)和結(jié)構(gòu)95%衣殼蛋白含2130個(gè)皮鞋狀的蛋白亞基Microbiology

5%ssRNA由6390個(gè)核苷酸構(gòu)成，每3個(gè)核苷酸與一個(gè)蛋白亞基相結(jié)合二十面體對(duì)稱的代表——腺病毒腺病毒（adenovirus）是一類動(dòng)物病毒，于1953年首次從手術(shù)切除的小兒扁桃體中分離得到。Microbiology

主要侵染呼吸道、眼結(jié)膜和淋巴組織，是急性咽炎、咽結(jié)膜炎、流行性角膜結(jié)膜炎和病毒性肺炎的病原體。有12個(gè)角、20個(gè)面。30條棱

衣殼由252個(gè)衣殼粒組成。Microbiology

二十面體對(duì)稱的代表——腺病毒核心：由36500bp（堿基對(duì)）線狀雙鏈（dsDNA）構(gòu)成。若以一定數(shù)目的亞基排列成具有一定表面積的立方對(duì)稱實(shí)體，以二十面體容積為最大，能包裝更多的病毒核酸，所以病毒殼體多取二十面體對(duì)稱（icosahedral）。Microbiology

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E.Coli的T偶數(shù)（eventype）噬菌體共有3種，即T2、T4和T6，它們是病毒學(xué)和分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論研究中的極好材料。Microbiology

復(fù)合對(duì)稱的代表——T偶數(shù)噬菌體T4噬菌體由橢圓形的二十面體頭部、頸部和螺旋對(duì)稱的尾部三個(gè)部分構(gòu)成，是病毒復(fù)合對(duì)稱的代表。

頭部?jī)?nèi)的核心是dsDNA基因組，頭與尾相連處有一構(gòu)造簡(jiǎn)單的頸部，由頸環(huán)和頸須構(gòu)成。

作用是裹住吸附前的尾絲。

尾部由尾鞘、尾管、基板、刺突和尾絲五部分組成，具吸附功能。（3）病毒的群體形態(tài)包涵體（inclusionbody）Microbiology

病毒粒大量聚集并使宿主細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，就形成了具有一定形態(tài)、構(gòu)造并能用光鏡加以觀察和識(shí)別的特殊“群體”，稱之為包涵體。核型多角體病毒（NPV）天花病毒在家兔細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成的包涵體—顧氏小體；狂犬病毒在神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成的包涵體—內(nèi)基氏小體。噬菌斑（plaque）

噬菌體在細(xì)菌或放線菌的菌苔上行的“負(fù)菌落”即為噬菌斑（plaque）。Microbiology

將少量的噬菌體和大量宿主細(xì)胞的混合液與45℃左右的瓊脂在培養(yǎng)皿中充分混勻，鋪平后培養(yǎng)10h左右，肉眼可見一個(gè)個(gè)透明不長(zhǎng)菌的小圓斑，是由噬菌體在菌苔上行的“負(fù)菌落”，即噬菌斑。噬菌斑M(jìn)icrobiology

空斑（plaque）由動(dòng)物病毒在宿主單層細(xì)胞培養(yǎng)物上形成一個(gè)與噬菌斑類似的肉眼可見的局部病損區(qū)域，稱之為飾斑或稱空斑（plaque）。Microbiology

Dulbecco于1952年發(fā)明了單層動(dòng)物細(xì)胞上的病毒空斑計(jì)數(shù)法，可進(jìn)行有活性的動(dòng)物病毒粒子的計(jì)數(shù)。正常細(xì)胞異常細(xì)胞枯斑（lesion）

由植物病毒在植物葉片上形成的局部壞死斑，稱之為枯斑（lesion，病斑）。Microbiology

（三）病毒的核酸

核酸構(gòu)成了病毒的基因組（genome）,是病毒粒中最重要的成分，具有遺傳信息的載體和傳遞體的作用。Microbiology

病毒核酸類型區(qū)分的指標(biāo)：①是DNA還是RNA；②是單鏈（ss,singlestrand）結(jié)構(gòu)還是雙鏈（ds,doublestrand）結(jié)構(gòu)；③呈線性還是環(huán)狀；④是閉環(huán)還是缺口環(huán)；⑤基因組是單分子、雙分子、三分子還是多分子；⑥核酸的堿基（b,base）或堿基對(duì)（basepair,bp）數(shù)，以及核苷酸序列等。Microbiology

若干有代表性病毒的核酸類型Microbiology

病毒核酸種類是病毒系統(tǒng)分類中最可靠的分子基礎(chǔ)Microbiology

（四）病毒的分類病毒分類鑒定指標(biāo)Microbiology

宿主病毒粒特征復(fù)制、釋放模式免疫學(xué)特征致病類型國(guó)際病毒委員會(huì)（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV）于2012年發(fā)表了最新的病毒分類第九次報(bào)告。在這個(gè)長(zhǎng)達(dá)1327頁(yè)的報(bào)告中，將目前ICTV所承認(rèn)的2284種病毒和類病毒歸入6個(gè)目、87個(gè)科、19個(gè)亞科和349個(gè)屬。Microbiology

三、噬菌體及其繁殖方式噬菌體（phage,bacteriophage），即原核生物病毒，包括：Microbiology

（一）原核生物的病毒——噬菌體噬細(xì)菌體（bacteriophage）

噬放線菌體（actinophage）

噬藍(lán)細(xì)菌體（cyanophage）噬菌體的基本形態(tài)Microbiology

噬菌體的形態(tài)Microbiology

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類型形狀

結(jié)構(gòu)核酸噬菌體1蝌蚪形六角形頭部可收縮性尾部dsDNAT2,T4,T62蝌蚪形六角形頭部非收縮性長(zhǎng)尾dsDNAT1,T5,λ3蝌蚪形六角形頭部非收縮性短尾dsDNAT3,T74微球形六角形頭部12個(gè)頂角各有一個(gè)較大殼粒ssDNAφX174S135微球形六角形頭部12個(gè)頂角各有一個(gè)較小殼粒ssRNAf2,Qβ,MS26絲狀絲狀(線狀)ssDNAM13噬菌體的形態(tài)1.噬菌體的繁殖噬菌體和一切病毒粒不存在個(gè)體的生長(zhǎng)過程，只有其兩種基本成分（核酸和蛋白質(zhì)）的合成和裝配，即：Microbiology

核酸復(fù)制+蛋白質(zhì)合成

核蛋白（病毒粒子）裝配E.ColiT偶數(shù)噬菌體的繁殖過程噬菌體的繁殖一般分為5個(gè)階段，即：Microbiology

（1）吸附

（2）侵入

（3）增殖（復(fù)制與生物合成）

（4）成熟（裝配）

（5）裂解（釋放）

（1）吸附（adsorption）可逆吸附，無(wú)特異性（非細(xì)胞顆粒也可吸附）Microbiology

隨機(jī)碰撞而接觸（靜電引力或氫鍵）敏感細(xì)胞病毒粒病毒表面蛋白與細(xì)胞受體的結(jié)合特異性，不可逆吸附，啟動(dòng)病毒感染的第一階段Microbiology

吸附于大腸桿菌性毛上的噬菌體

吸附于大腸桿菌細(xì)胞上的噬菌體

吸附作用受許多內(nèi)外因素的影響：①噬菌體的數(shù)量②陽(yáng)離子③輔助因子④pH⑤溫度Microbiology

①噬菌體的數(shù)量每一宿主細(xì)胞表面的特異受體有限，因此所能吸附噬菌體的數(shù)目也有一個(gè)限量。Microbiology

每一敏感細(xì)胞所能吸附的相應(yīng)噬菌體數(shù)量，就稱感染復(fù)數(shù)（m.o.i,multiplicityofinfection）。②陽(yáng)離子

Ca2+、Mg2+和Ba2+等陽(yáng)離子對(duì)吸附有促進(jìn)作用；

Al3+、Fe3+和Cr3+等陽(yáng)離子則可引起失活。

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③輔助因子

例如，色色氨酸可促進(jìn)T4的尾絲擺脫頸須的束縛，

有促進(jìn)吸附作用；

生物素可促進(jìn)產(chǎn)谷氨酸細(xì)菌噬菌體的吸附作用。

④pH

在pH=7，即中性時(shí)有利于吸附，

在pH＜5和pH＞10時(shí)不易吸附。

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⑤濕度在生長(zhǎng)最適溫度范圍內(nèi)最有利于吸附。

利用某些理化因子對(duì)吸附的促進(jìn)作用和抑制作用，在發(fā)酵工業(yè)中對(duì)防止噬菌體的污染有一定的意義。（2）侵入（penetration或injection）侵入又稱病毒內(nèi)化，它是一個(gè)病毒吸附后幾乎立即發(fā)生，

依賴于能量的感染步驟。Microbiology

有伸縮尾的T偶數(shù)噬菌體：注射方式將噬菌體核酸注入細(xì)胞Microbiology

從吸附到侵入的時(shí)間極短，只需15s尾絲吸附刺突固定尾鞘收縮尾管穿入DNA注入（1）吸附后尾絲收縮；（2）基板受到構(gòu)象刺激，刺突固著；（3）尾鞘中的蛋白質(zhì)亞基移位，緊縮成原長(zhǎng)的一半；（4）尾管推出并插入細(xì)胞壁和膜中，釋放溶菌酶，水解細(xì)胞壁產(chǎn)生小孔；（5）核酸通過中空的尾管壓入胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在胞外；T偶數(shù)噬菌體的脫殼與侵入是一起發(fā)生的，但最終僅有病毒核酸及結(jié)合蛋白進(jìn)入細(xì)胞，

蛋白質(zhì)殼體留在細(xì)胞外。Microbiology

病毒毒粒消失，失去原有的感染性，

進(jìn)入潛隱期。（3）增殖（replication）病毒基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞Microbiology

宿主細(xì)胞的代謝發(fā)生改變病毒利用宿主的生物合成機(jī)構(gòu)和場(chǎng)所，

進(jìn)行病毒核酸表達(dá)和復(fù)制，

合成大量的病毒蛋白質(zhì)和核酸。病毒基因組的表達(dá)與復(fù)制存在著強(qiáng)烈的時(shí)序性病毒基因組的表達(dá)與復(fù)制存在著強(qiáng)烈的時(shí)序性Microbiology

早期（early,immediateearly）早期轉(zhuǎn)錄-早期mRNA-早期翻譯-早期蛋白次早期（delayedearly）次早期轉(zhuǎn)錄一次早期mRNA-次早期翻譯-次早期蛋白晚期轉(zhuǎn)錄-晚期mRNA-晚期翻譯-晚期蛋白晚期（late）雙鏈DNA噬菌體通過3階段轉(zhuǎn)錄的增殖過程示意圖早期（early,immediateearly）次早期（delayedearly）晚期（late）A418005（4）裝配（maturation）新合成的毒粒結(jié)構(gòu)部件組裝成完整的病毒顆粒，稱病毒的裝配，亦稱成熟（maturation）。Microbiology

主要包括：

頭部裝配

無(wú)尾絲的尾部裝配

頭尾連接

裝配尾絲至此，一個(gè)個(gè)成熟的大小相等的噬菌體粒子就裝配完成了。Microbiology

尾部除尾絲的其他部件獨(dú)立裝配完成T4噬菌體的裝配是一個(gè)極為復(fù)雜的自我裝配的過程。頭部的裝配；

無(wú)尾絲的尾部裝配；

尾部與頭部自發(fā)結(jié)合；

單獨(dú)裝配的尾絲與前以裝配好的顆粒相連。Microbiology

頭部衣殼衣殼粒尾絲噬菌體尾部外殼包括4分完全獨(dú)立的亞裝配途徑：（5）裂解（lysis）當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)的大量子代噬菌體已成熟后，由于水解細(xì)胞膜的脂肪酶和水解細(xì)胞壁的溶菌酶的作用，從細(xì)胞內(nèi)部促進(jìn)了細(xì)胞的裂解，從而實(shí)現(xiàn)了噬菌體的釋放。Microbiology

A418007

隨著時(shí)間的推移，細(xì)菌的數(shù)量變得越來越少，這是因?yàn)樗鼈儽患?xì)菌病毒殺死了，這種現(xiàn)象也稱為“溶菌”現(xiàn)象。

自外裂解（lysisfromwithout）大量噬菌體吸附于同一宿主細(xì)胞表面并釋放眾多的溶菌酶，最終因外在的原因而導(dǎo)致細(xì)胞裂解的現(xiàn)象，稱之為自外裂解。Microbiology

自外裂解是不能產(chǎn)生子代噬菌體的裂解方式。吸附Microbiology

侵入裝配釋放早期：病毒特異性酶的合成病毒核酸的復(fù)制病毒結(jié)構(gòu)蛋白合成病毒大分子合成2.噬菌體效價(jià)的測(cè)定效價(jià)（titretiter）：表示每毫升試樣中所含有

的具侵染性的噬菌體粒子

數(shù)，又稱噬菌斑形成單位

數(shù)（plaque-formingunit，pfu）或感染中心數(shù)（in-fectivecentre）。Microbiology

精確測(cè)定方法：雙層平板法（twolayerplatingmethod）測(cè)定效價(jià)的方法Microbiology

常用且精確的測(cè)定方法：雙層平板法（twolayerplatingmethod）雙層平板法底層平板（2%瓊脂培養(yǎng)基10ml）Microbiology

上層平板上層培養(yǎng)基（1%瓊脂培養(yǎng)基5ml）宿主菌懸液（對(duì)數(shù)期菌液0.2ml）噬菌體試樣（合適稀釋液0.1ml）混勻計(jì)噬菌斑數(shù)10余小時(shí)37℃

雙層平板法主要有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①加了底層培養(yǎng)基后，可使原來底面不平的玻璃皿的缺陷得到了彌補(bǔ)；②全部噬菌體斑都接近處于同一平面上，每一噬菌斑的大小接近、邊緣清晰，而且不致發(fā)生上下噬菌斑的重疊現(xiàn)象；

③上層培養(yǎng)基中瓊脂較稀，形成的噬菌斑較大，更有利于計(jì)數(shù)。

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3.一步生長(zhǎng)曲線（onestepgrowthcurve）

定量描述烈性噬菌體生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線，稱作一步生長(zhǎng)曲線或一級(jí)生長(zhǎng)曲線（one-stepgrowthcurve）Microbiology

一步生長(zhǎng)曲線基本步驟Microbiology

（1）

用噬菌體的稀釋液感染高濃度的宿主細(xì)胞；（2）數(shù)分鐘后，離心或加入抗噬菌體的抗血清（中和未吸附的噬菌體）；（3）混合物大量稀釋，終止抗血清的作用和防止新釋放的噬菌體感染其它細(xì)胞；

（4）保溫培養(yǎng)并定期檢測(cè)培養(yǎng)物中的噬菌體效價(jià)（對(duì)噬菌體含量進(jìn)行計(jì)數(shù)）；（5）以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，病毒的感染效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制出病毒特征性的繁殖曲線；定時(shí)取培養(yǎng)液與敏感菌混合平板培養(yǎng)被噬菌體侵染后的菌群培養(yǎng)過程感染后培養(yǎng)過程不同取樣時(shí)間培養(yǎng)液與敏感菌混合平板培養(yǎng)產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)量的動(dòng)態(tài)一步生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)

反映每種噬菌體的三個(gè)最重要的特性參數(shù)：

潛伏期（latentphase）裂解期（risephase）裂解量（burstsize）Microbiology

T4噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線T4噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線（1）潛伏期（latentphase）（2）裂解期（risephase）（3）平穩(wěn)期（plateau）Microbiology

（1）潛伏期（latentphase）

指噬菌體的核酸侵入宿主細(xì)胞后至第一個(gè)噬菌體粒子裝配前的一段時(shí)間。Microbiology

潛伏期又可分兩段：①隱晦期（eclipsephase）②胞內(nèi)積累期（intracellularaccumulationphase）Microbiology

①隱晦期（eclipsephase）指在潛伏期前期（用氯仿）裂解細(xì)胞，裂解液仍無(wú)侵染性的一段時(shí)間。Microbiology

細(xì)胞內(nèi)正處于復(fù)制噬菌體核酸和

合成其蛋白質(zhì)衣殼的階段②胞內(nèi)累積期（intracellularaccumulationphase）

又稱潛伏后期，在隱晦期后，如人為地裂解細(xì)胞，其裂解液出現(xiàn)侵染性的一段時(shí)間。Microbiology

噬菌體開始裝配的時(shí)期，在電鏡下可觀察到初步裝配好的

噬菌體粒子。（2）裂解期（risephase）緊接在潛伏期后的一段宿主細(xì)胞迅速裂解、溶液中噬菌體粒子急劇增多的一段時(shí)間。Microbiology

（3）平穩(wěn)期（plateau）指感染后的宿主已全部裂解，溶液中噬菌體效價(jià)達(dá)到最高點(diǎn)后的時(shí)期。T4噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線裂解量burstsize平均每一個(gè)宿主細(xì)胞裂解后所產(chǎn)生的子代噬菌體數(shù)稱作裂解量（burstsize）Microbiology

裂解量=裂解期噬菌斑數(shù)（噬菌體的釋放數(shù)）潛伏期噬菌斑數(shù)（感染噬菌體的細(xì)菌數(shù)）裂解量的數(shù)值相對(duì)穩(wěn)定，如T4：100；φ174：1000；f2：10000；谷氨酸生產(chǎn)菌的噬菌體為50-150。烈性噬菌體（virulentphage）:凡在短時(shí)間內(nèi)能連續(xù)完成吸附、侵入、增殖、裝配和裂解5個(gè)階段而實(shí)現(xiàn)其繁殖的噬菌體，稱為烈性噬菌體（

virulentphage）；Microbiology

溫和噬菌體（tenperatephage）:進(jìn)入菌體后并不進(jìn)行增殖或引起溶菌，將自己的基因組整合到宿主基因組上，并隨之復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，則稱之為溫和噬菌體（

tenperatephage）裂解性周期（lyticcycle）或增殖性周期（producivecycle）烈性噬菌體所經(jīng)歷的繁殖過程，稱為裂解性周期（lyticcycle）或增殖性周期（producivecycle）。Microbiology

4.溶源性（lysogeny）溫和噬菌體侵入宿主細(xì)胞后，由于前者的基因組整合到后者的基因組上，并隨后者的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，因此，這種溫和噬菌體的侵入

并不引起宿主細(xì)胞裂解，

此即溶源性或溶源現(xiàn)象。Microbiology

（1）溶源噬菌體（lysogenicphage）

凡吸附并侵入細(xì)胞后，噬菌體的DNA只整合在宿主的核染色體組上，并可長(zhǎng)期隨宿主DNA的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，因而在一般情況下不進(jìn)行增殖和引起宿主細(xì)胞裂解的噬菌體，稱Microbiology

溫和噬菌體（temperatephage）或溶源噬菌體（lysogenicphage）（2）前噬菌體（prophage）當(dāng)溫和噬菌體侵入其敏感宿主的細(xì)胞后，前者的核酸可整合到后者的核基因組（genome，即染色體上），這種處于整合態(tài)的噬菌體核酸，稱作前噬菌體（prophage）。Microbiology

（3）溫和噬菌體的三種存在形式①游離態(tài)：指已成熟釋放并有侵染性的游離噬菌體粒子。②整合態(tài)：指已整合在宿主基因組上的原噬菌體（prophage）的狀態(tài)；③營(yíng)養(yǎng)態(tài)：指原噬菌體經(jīng)外界理化因子誘導(dǎo)后，脫離宿主核基因組而處于積極復(fù)制、合成和裝配的狀態(tài)。Microbiology

溫和噬菌體的種類很多，常見的有E.coli的λ、Mu-1、P1和P2噬菌體等。Microbiology

E.coli的λ噬菌體λ噬菌體的溶源性反應(yīng)Microbiology

進(jìn)入宿主細(xì)胞后線狀基因組依靠粘性末端環(huán)化λ噬菌體的溶源性反應(yīng)Microbiology

通過特定位點(diǎn)整合（切離）細(xì)菌染色體（4）溶源菌凡能引起溶源性的烈性噬菌體即稱溫和噬菌體，而其宿主即稱溶源菌（lysogen或lysogenicbacteria）。Microbiology

溶源菌是一類能與溫和噬菌體長(zhǎng)期共存，

一般不會(huì)出現(xiàn)有害影響的宿主細(xì)胞。（5）溶源菌的顯著特性①溶原性是溶源菌的一個(gè)極穩(wěn)定的遺傳特性②自發(fā)裂解（spontaneouslysis）③誘發(fā)裂解（inductionlysis）④免疫性（immunity）⑤復(fù)愈：10-5幾率轉(zhuǎn)變?yōu)榉侨茉淳奕茉崔D(zhuǎn)變（lysogenicnconversion）

白喉棒桿菌

Microbiology

λ噬菌體的溶源性循環(huán)噬菌體DNA噬菌體吸附到細(xì)胞上，并注入DNA細(xì)菌染色體裂解循環(huán)細(xì)胞裂解釋放毒粒新的噬菌體DNA和蛋白質(zhì)合成，裝配成為毒粒噬菌體DNA通過同源重組整合到細(xì)菌染色體上，成為前噬菌體噬菌體DNA環(huán)化并進(jìn)入烈性后溶源性循環(huán)偶爾前噬菌體也會(huì)通過同源重組切除染色體許多細(xì)胞分裂溶源性細(xì)菌正常繁殖溶源性循環(huán)細(xì)菌染色體裂解循環(huán)細(xì)胞裂解釋放毒粒新的噬菌體DNA和蛋白質(zhì)合成，裝配成為毒粒烈性噬菌體與溫和噬菌體生活史比較Microbiology

（6）溶源菌的識(shí)別敏感性指示菌：

遇溶源菌裂解后所釋放的溫和噬菌體

會(huì)發(fā)生裂解循環(huán)者。Microbiology

第一步：少量溶源菌與大量的敏感指示菌

相混合；Microbiology

第二步：與上層瓊脂培養(yǎng)基混勻后倒在已

經(jīng)凝固的底層營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上；第三步：組織培養(yǎng)后溶源菌就一一長(zhǎng)成菌

落。Microbiology

第四步：觀察平皿上形成了一個(gè)個(gè)中央有

溶源菌的小菌落，四周有透明圍

著的這樣獨(dú)特的噬菌斑。四、其他病毒簡(jiǎn)介（一）植物病毒Microbiology

植物病毒大多為ssRNA病毒，基本形態(tài)為桿狀、絲狀和球狀（二十面體），一般無(wú)包膜。植物病毒對(duì)宿主的專一性通常較差。例如，TMV可侵染十余科、百余科草本和木本植物。植物患病毒病后，主要出現(xiàn)三類癥狀：①因葉綠體被破壞或不能合成新的葉綠素；

而引起花葉、黃化或紅化等癥狀；②植株發(fā)生矮化、叢枝或畸形等；③形成枯斑或壞死等癥狀。Microbiology

植物病毒的侵入植物病毒一般無(wú)特殊吸附結(jié)構(gòu)，只能以被動(dòng)方式侵入，通過人為的或自然的而機(jī)械損傷所形成的微傷口進(jìn)入細(xì)胞；或者靠攜帶有病毒的媒介，主要靠有刺吸式口器的昆蟲（蚜蟲、葉嬋和飛虱等半翅目昆蟲）取食將病毒帶入細(xì)胞。Microbiology

植物病毒的侵入植物病毒一旦進(jìn)入細(xì)胞后，增殖產(chǎn)生的子代病毒或病毒核酸可通過病毒編碼的運(yùn)動(dòng)蛋白（movementprotein）與胞間連絲的相互作用從受染細(xì)胞進(jìn)入臨近細(xì)胞后實(shí)現(xiàn)病毒粒的擴(kuò)散和傳播。Microbiology

與噬菌體不同的是，植物病毒必須在侵入宿主細(xì)胞后才脫去蛋白質(zhì)衣殼，這一過程稱為脫殼（encoating或uncoating）。Microbiology

植物病毒在其核酸復(fù)制和衣殼蛋白合成的基礎(chǔ)上，即可進(jìn)行病毒粒裝配。標(biāo)Microbiology

煙草花葉病毒（TMV）的組裝TMV的2130個(gè)相同蛋白亞基（衣殼粒）在裝配過程中，先初裝成許多雙層盤（每層17個(gè)亞基，共34個(gè)亞基），然后可能由于pH降低或因RNA的結(jié)合，盤狀變成雙螺旋狀，最后許多雙螺旋再聚合成TMV的完整衣殼。在這個(gè)過程中，RNA的嵌入起著關(guān)鍵作用。如果沒有RNA，TMV的蛋白亞基雖能形成螺旋棒，但卻長(zhǎng)度不一。其他植物病毒的裝配與TMV一樣，必須經(jīng)過雙層盤階段。A418013（三）人類和脊椎動(dòng)物病毒

在人類、哺乳動(dòng)物、禽類、兩棲類、爬行類和魚類等各種動(dòng)物脊椎動(dòng)物中，廣泛存在著相應(yīng)的病毒。Microbiology

與人類健康有關(guān)的病毒超過300種，與其他脊椎動(dòng)物有關(guān)的病毒超過900種。1.常見的病毒病例如，流行性感冒（流感

乙型肝炎（乙肝）

天花

嚴(yán)重急性呼吸綜合癥（SARS又稱傳染性

非典型肺炎）

脊髓灰質(zhì)炎（小兒麻痹癥）

水泡性皮疹

狂犬病Microbiology

流行性感冒病毒（influenzavirus）疾?。毫餍行愿忻癕icrobiology

禽流感（Avianingluenza）是由A型流感病毒引起的一種禽類感染或疾病綜合癥，易在禽鳥間散播，可引致家禽大量死亡，對(duì)家禽業(yè)帶來不可估量的破壞。Microbiology

1997年，香港發(fā)生全世界第一宗人類受H5N1禽流感感染病例，原本只影響雞的病毒亦令人類患病，受影響的人數(shù)為18人，其中6人死亡。脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus）疾病：小兒麻痹癥Microbiology

乙肝病毒（hepatitisBvirus,HBV）疾?。阂腋蜯icrobiology

天花病毒疾?。禾旎∕icrobiology

SARS病毒疾病：嚴(yán)重急性呼吸綜合征，又稱傳染性非典型肺炎。Microbiology

引起艾滋病的病毒稱人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）Microbiology

大多數(shù)動(dòng)物病毒無(wú)吸附結(jié)構(gòu)的分化。少數(shù)病毒如流感病毒在其包膜表面長(zhǎng)有柱狀或蘑菇狀的刺突，可吸附在宿主細(xì)胞表面的粘蛋白受體上，腺病毒則可通過五鄰體上的上的刺突行使吸附功能。吸附之后，病毒粒可通過胞飲、包膜融入細(xì)胞膜或特異受體的轉(zhuǎn)移作用侵入細(xì)胞中，接著就發(fā)生脫殼、核酸復(fù)制和衣殼蛋白的生物合成，再通過裝配、成熟和釋放，就形成大量有侵染力的子代病毒。Microbiology

A418009A4180102.腫瘤在人類的惡性腫瘤中，有15~20%是由于病毒的感染而誘發(fā)的。Microbiology

1933年理查德·畢肖普（RichardBishope發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)DNA腫瘤病毒即兔乳頭病毒。

研究表明，至少有3種病毒與人類腫瘤有密切關(guān)系。Microbiology

肝炎病毒（HBV、HCV）肝細(xì)胞癌愛波斯坦-巴爾病毒（EBV）伯基特淋巴瘤、鼻咽癌人乳頭瘤病毒（HPV）宮頸癌禽、畜等動(dòng)物的病毒病普遍且危害嚴(yán)重。例如，豬瘟、牛瘟、兔的乳頭狀瘤、

口蹄疫、雞瘟、雞新城疫、馬傳染

性病毒病和勞氏肉瘤等。Microbiology

人畜共患?。▃oonosis）人類和脊椎動(dòng)物之間自然傳播的疾病和感染。Microbiology

世界上已證實(shí)人畜共患病約有200種，其中較重要的有89種，病毒病27種。例如，流行性乙型腦炎、口蹄疫、西部馬腦炎、

委內(nèi)瑞拉馬腦炎、狂犬病、禽流感等。（四）昆蟲病毒

已知的昆蟲病毒有1671種，其中80%以上都是農(nóng)、林業(yè)中常見的鱗翅目害蟲的病原體，因此是害蟲生物防治中的巨大資源庫(kù)。Microbiology

多數(shù)昆蟲病毒可在宿主細(xì)胞內(nèi)形成光鏡下呈多角形的包涵體，稱為多角體（polyhedron）。Microbiology

多角體在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成，成分為堿溶性結(jié)晶蛋白，其內(nèi)包裹著數(shù)目不等的病毒粒。

功能：保護(hù)毒粒免受外界不良環(huán)境的破壞。常見的3種昆蟲病毒①核型多角體病毒

（nuclearpolyhedrosisvirus,NPV）②質(zhì)型多角體病毒

（cytoplasmicpolyhedrosisvirus,CPV）③顆粒體病毒

（granulosisvirus,GV）Microbiology

①核型多角體病毒

（nuclearpolyhedrosisvirus,NPV）

這是一類在昆蟲細(xì)胞核內(nèi)增殖的、具有蛋白質(zhì)包涵體的桿狀病毒，數(shù)量最多。Microbiology

②質(zhì)型多角體病毒

（cytoplasmicpolyhedrosisvirus,CPV）

這是一類在昆蟲細(xì)胞質(zhì)內(nèi)增殖的，可形成蛋白質(zhì)包涵體的球狀病毒。Microbiology

③顆粒體病毒

（granulosisvirus,GV）

這是一類據(jù)歐蛋白質(zhì)包涵體，而每個(gè)包涵體內(nèi)通常僅含一個(gè)病毒粒的昆蟲桿狀病毒。病毒核酸為dsDNA.Microbiology

小菜粉蝶顆粒體病毒（PierisrapaeGranulosisVirus）Microbiology

第二節(jié)

亞

病毒因子Microbiology

凡在核酸和蛋白質(zhì)兩種成分中，只含其中一種的分子病原體或由缺陷病毒構(gòu)成的功能不完整的病原體，稱為亞病毒（subvirus），包括Microbiology

類病毒

擬病毒

衛(wèi)星病毒衛(wèi)星RNA朊病毒5類一、類病毒

類病毒（viroid）是一類只含RNA一種成分、專性寄生在活細(xì)胞內(nèi)的分子病原體。Microbiology

目前只在植物體中發(fā)現(xiàn)，所含核酸為

裸露的環(huán)狀ssRNA，

其二級(jí)結(jié)構(gòu)像一段末端封閉的短dsRNA分子。1971年在美國(guó)工作的瑞士學(xué)者T.O.Diener在馬鈴薯紡錘形塊莖病（potatospindletuberdisease,PSTD）中發(fā)現(xiàn)一條比一般病毒分子更小的10S的區(qū)帶，他稱它為馬鈴薯紡錘形塊莖病類病毒（potatospindletuberviroid,PSTV）,它可使馬鈴薯檢查20~70%。Microbiology

PSTV呈棒狀結(jié)構(gòu)，是一個(gè)裸露的閉合環(huán)狀ssRNA分子，其相對(duì)分子質(zhì)量為1.2×105.整個(gè)環(huán)由兩個(gè)互補(bǔ)的半體所組成，其一含179個(gè)核苷酸，另一含180個(gè)核苷酸，兩者間有70%的堿基以氫鍵方式結(jié)合，形成雙螺旋區(qū)，共形成122個(gè)堿基對(duì)，整個(gè)結(jié)構(gòu)中形成了27個(gè)內(nèi)環(huán)。Microbiology

二、擬病毒

擬病毒（virusoid）又稱類類病毒（viroid-like）、殼內(nèi)病毒，是指一類包裹在真病毒毒粒中的有缺陷的類病毒。Microbiology

擬病毒極其微小，一般僅由裸露的RNA（300~400個(gè)核苷酸）或DNA組成。

被擬病毒“寄生”的真病毒又稱輔助病毒（helpervirus），擬病毒則成了它的“衛(wèi)星”。Microbiology

擬病毒的復(fù)制必須依賴輔助病毒的協(xié)助，同時(shí)，擬病毒也可干擾輔助病毒的復(fù)制和減輕其對(duì)宿主的病害，這可用于生物防治。擬病毒首次于1981年在絨毛煙（Nicotianavelutina）的斑駁病毒（velvettobaccomottlevirus,VTMoV）中分離到。Microbiology

VIMoT基因組

大分子線狀ssRNA-RNA-1

環(huán)狀ssRNA-RNA-2RNA-2的線狀形式-RNA-3

擬病毒Microbiology

RNA-1單獨(dú)接種

不能感染復(fù)制RNA-2單獨(dú)接種

不能感染復(fù)制

可以感染復(fù)制

實(shí)驗(yàn)證明：只有當(dāng)RNA-1（輔助病毒）RNA-2或RNA-3（擬病毒）

合在一起才能感染宿主三、衛(wèi)星病毒

衛(wèi)星病毒（satellitevirus）是一類基因組缺損、必須依賴某形態(tài)較大的轉(zhuǎn)移輔助病毒才能復(fù)制和表達(dá)的小型伴生病毒。Microbiology

動(dòng)物病毒中的衛(wèi)星病毒例如，丁型肝炎病毒（hepatitisDvirus），

其輔助病毒是乙型肝炎病毒（HBV）Microbiology

例如，腺連病毒（adeno-associatedviruses,AAVs）,

其輔助病毒是腺病毒（adenoviruses）。adeno-associatedviruses,AAVs四、衛(wèi)星RNA

衛(wèi)星RNA（satelliteRNA）是一類存在于某專一病毒粒（輔助病毒）的衣殼內(nèi)，并完全依賴后者才能復(fù)制自己的小RNA病原因子（與輔助病毒基因組無(wú)同源性）。Microbiology

如，黃瓜花葉病毒（CMV）衛(wèi)星RNA五、朊病毒

朊病毒（prion，virino）又稱“普利昂”或蛋白質(zhì)侵染子（proteininfection，prion），是一種不含核酸的傳染性蛋白質(zhì)分子，能引起宿主體內(nèi)現(xiàn)成的同類蛋白質(zhì)分子發(fā)生與其相似的構(gòu)象變化，從而使宿主致病。Microbiology

朊病毒由美國(guó)學(xué)者S.B.Prusiner于1982年研究羊瘙癢病時(shí)發(fā)現(xiàn)的，由于意義重大，他于1997年獲得諾貝獎(jiǎng)。

至今已發(fā)現(xiàn)與哺乳動(dòng)物腦部相關(guān)的10余種類疾病都是由朊病毒引起的。Microbiology

這類疾病的共同特征：

潛伏期長(zhǎng)，嚴(yán)重影響中樞神經(jīng)的功能。Prusiner（1982）提出羊瘙癢病因子是一種蛋白質(zhì)侵染顆粒（proteinaceousinfectionparticle）,并稱之為prion?！貌《綧icrobiology

1997年，StanleyB.Prusiner榮獲諾貝爾獎(jiǎng)引起的疾病Microbiology

人：庫(kù)魯病、克雅氏病、格-史氏綜合征、致死性家族失眼?。粍?dòng)物：羊瘙癢癥、貂的傳染性腦病、黑尾鹿與麋鹿的慢性消耗病、牛海綿狀腦病。真病毒與prion的比較Microbiology

性狀病毒prion性狀病毒prion感染性++蛋白特性：蛋白酶K某些敏感不敏感核酸+-蛋白特性：加熱80℃變性穩(wěn)定形態(tài)學(xué)鑒定（電鏡）+-潛伏期根據(jù)病毒而不同長(zhǎng)福爾馬林滅活+-誘發(fā)免疫應(yīng)答+-電離輻射、紫外或照射敏感性敏感不敏感誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素+-CPE+-引起炎癥反應(yīng)+-朊病毒的發(fā)病機(jī)制正常的蛋白質(zhì)：PrPc異常的蛋白質(zhì)：PrPscMicrobiology

PrPc和PrPsc均來源于宿主中同一編碼基因，并具相同的氨基酸序列，所不同的是二者空間三維結(jié)構(gòu)。

存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的一些正常行駛的細(xì)胞朊蛋白（PrPc）收到致病朊蛋白（PrPsc）的影響而發(fā)生相應(yīng)的構(gòu)象變化，發(fā)生了錯(cuò)誤的折疊后變成了PrPsc，從而使宿主致病。PrPsc的入侵，把腦細(xì)胞中原來就有的PrPc“帶壞”正常：PrPc異常：PrPscPrPc和PrPsc在高級(jí)結(jié)構(gòu)上有巨大差別對(duì)PrPc和PrPsc兩種蛋白質(zhì)做結(jié)構(gòu)分析，都是由相同的208個(gè)氨基酸殘基組成的疏水性很強(qiáng)糖蛋白。羊瘙癢病PrPc與的PrPsc三維結(jié)構(gòu)Microbiology

α螺旋Β折疊PrPc（正常）PrPsc（異常）

朊病毒不僅與人類健康、家畜飼養(yǎng)關(guān)系密切，而且可為研究與癡呆有關(guān)的其他疾?。ㄈ缋夏晷园V呆癥、帕金森?。┨峁┲匾畔?。就生物理論而言，朊病毒的研究會(huì)豐富生物學(xué)有關(guān)領(lǐng)域的內(nèi)容；對(duì)探索生命起源于生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重要意義。Microbiology

第二節(jié)

病毒與實(shí)踐Microbiology

病毒與實(shí)踐的關(guān)系極為密切