細(xì)菌的生化反應(yīng)（一）

同學(xué)們大家好，歡迎大家來(lái)到微生物檢驗(yàn)課堂。我是伊寧衛(wèi)生學(xué)校的周曉璇老師，今天我們一起來(lái)學(xué)習(xí)細(xì)菌的生化反應(yīng)。不同的細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而對(duì)底物的分解能力各異，其代謝的產(chǎn)物也不同。這些代謝產(chǎn)物又各具有不同的生物化學(xué)特性，可利用生物化學(xué)的方法測(cè)定這些代謝產(chǎn)物以鑒定細(xì)菌。在臨床細(xì)菌檢驗(yàn)工作中，除根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)，染色，培養(yǎng)特性進(jìn)行初步鑒定外，對(duì)絕大多數(shù)分離的未知菌的屬、種鑒定無(wú)論是應(yīng)用手工鑒定還是自動(dòng)化儀器鑒定，都需要通過(guò)這些生化反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，掌握各種生化反應(yīng)的原理和應(yīng)用，是細(xì)菌鑒定的基礎(chǔ)。根據(jù)代謝產(chǎn)物的不同可以將生化反應(yīng)分為五種，分別是碳水化合物的代謝實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝實(shí)驗(yàn)、碳源和氮源利用實(shí)驗(yàn)、各種酶類實(shí)驗(yàn)以及抑菌實(shí)驗(yàn)。今天這堂課我們主要學(xué)習(xí)碳水化合物的代謝實(shí)驗(yàn)。1.糖（醇、苷）類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（1）原理：由于各種細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖類的酶，故分解糖類的能力各不相同。細(xì)菌分解糖類后的終末產(chǎn)物亦不一致，有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的僅產(chǎn)酸，故可利用此特點(diǎn)以鑒別細(xì)菌。細(xì)菌將多糖分解成單糖后繼續(xù)分解為丙酮酸，丙酮酸最終被分解，可獲得酸性產(chǎn)物，使培養(yǎng)基PH值下降，使指示劑呈酸性變紅(2)培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入0.5％-1％的糖類(單糖、雙糖或多糖)、醇類(甘露醇、肌醇等)、苷類(水楊苷、菊糖等)、糖發(fā)酵管、半固體發(fā)酵管、微量發(fā)酵管指示劑酚紅、溴甲酚紫等(3)方法：將細(xì)菌接種到糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至2w后，觀察結(jié)果(4)結(jié)果：分解糖產(chǎn)酸，呈酸性反應(yīng)（變色），若產(chǎn)氣可出現(xiàn)氣泡或培養(yǎng)基內(nèi)有裂隙等現(xiàn)象;若不分解，除有細(xì)菌生長(zhǎng)外，無(wú)任何變化(5)應(yīng)用：是鑒定細(xì)菌最主要的試驗(yàn)，特別對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要，（二）葡萄糖氧化/發(fā)酵（O/F）試驗(yàn)(1)原理：細(xì)菌分解葡萄糖過(guò)程中，根據(jù)對(duì)O2需求的不同，分為氧化型（只在有氧環(huán)境中分解葡萄糖）發(fā)酵型（有氧、無(wú)氧都能分解葡萄糖）產(chǎn)堿型（不能分解葡萄糖）(2)方法：將待檢菌同時(shí)接種兩支HL培養(yǎng)基，一支滴加無(wú)菌液體石蠟，高度不少于1cm。將培養(yǎng)基于35℃培養(yǎng)48h或更長(zhǎng)。(3)結(jié)果：兩支培養(yǎng)基均無(wú)變化為產(chǎn)堿型；兩支培養(yǎng)基均產(chǎn)酸（黃色）為發(fā)酵型；若僅不加石蠟的培養(yǎng)基產(chǎn)酸為氧化型。(4)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌的鑒別。也用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別,但配方不同。（三）β-半乳糖苷酶（ONPG）試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解鄰-硝基酚β-D-半乳糖苷β-半乳糖苷酶，產(chǎn)生黃色鄰-硝基酚。細(xì)菌分解乳糖需要2種酶：半乳糖苷滲透酶（將乳糖送入細(xì)胞內(nèi)）β-半乳糖苷酶（將乳糖分解為葡萄糖、半乳糖）僅有β－半乳糖苷酶，則分解乳糖慢β-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)與乳糖相似，但分子小，不需滲透酶可進(jìn)入細(xì)胞(2)方法：從克氏雙糖鐵培養(yǎng)基上取菌，于0.25ml無(wú)菌生理鹽水中制成菌懸液，加入甲苯并充分振搖，使酶釋放。將試管置37℃水浴5min，加入0.25mlONPG試劑，水浴20min左右觀察結(jié)果。(3)結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽(yáng)性反應(yīng)，一般在20～30min內(nèi)顯色。(4)應(yīng)用：迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌β-半乳糖苷酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本試驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。（四）七葉苷水解試驗(yàn)(1)原理：有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中枸櫞酸的二價(jià)鐵離子反應(yīng)，生成黑色化合物。(2)培養(yǎng)基：七葉苷培養(yǎng)基、膽汁七葉苷培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌接種于七葉苷培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)楹谏珵殛?yáng)性，不變色者為陰性。(5)應(yīng)用：主要用于D群鏈球菌與其它鏈球菌的鑒別，前者陽(yáng)性，后者陰性。（五）甲基紅試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸等大量混合酸，使pH降至4.4以下，加入甲基紅試劑呈紅色。若分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，則pH在5.4以上，加入甲基紅指示劑呈黃色。(2)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2~4d，于培養(yǎng)基內(nèi)加入甲基紅試劑，立即觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性；橘紅色為弱陽(yáng)性；黃色為陰性。(5)應(yīng)用：鑒別腸桿菌科細(xì)菌，尤其大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌。產(chǎn)氣腸桿菌將葡萄糖分解為丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步分解為乙酰甲基甲醇，最終培養(yǎng)基PH值＞5.4，培養(yǎng)基為黃色，甲基紅實(shí)驗(yàn)陰性而大腸埃希菌只能將葡萄糖分解為丙酮酸，使培養(yǎng)基PH值小于4.4，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，甲基紅實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性（六）V-P（伏－普）試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中乙酰甲基甲醇被氧氧化為二乙酰，二乙酰與胍基起作用生成紅色化合物。(2)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)48h后加入甲液(6％α·萘酚酒精溶液)和乙液(40％KOH溶液)，振搖。(4)結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性；如無(wú)紅色出現(xiàn)且于35℃4h后仍不變色即為陰性。(5)應(yīng)用：鑒別腸桿菌科細(xì)菌，常與甲基紅試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榍罢哧?yáng)性的細(xì)菌，后者通常為陰性。產(chǎn)氣腸桿菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中乙酰甲基甲醇被氧氧化為二乙酰，二乙酰與胍基起作用生成紅色化合物，V-P實(shí)驗(yàn)