有助于維持血脂（膽固醇甘油三酯）健康水平檢驗方法

有助于維持血脂（膽固醇/甘油三酯）健康水平檢驗方法根據(jù)血脂異常的類型，有助于維持血脂（膽固醇/甘油三酯）健康水平按照受試物作用機制的不同，設(shè)立分類的動物試驗。動物試驗：分成二種情況：1.混合型高脂血癥動物模型2.高膽固醇血癥動物模型人體試食試驗：根據(jù)試驗的結(jié)果，分三種情況分別進行判定：1.有助于維持血脂健康水平功能2.有助于維持血膽固醇健康水平功能3.有助于維持血甘油三酯健康水平功能1動物實驗方法1.1混合型高脂血癥動物模型1.1.1原理用含有膽固醇、蔗糖、豬油、膽酸鈉的飼料喂養(yǎng)動物可形成脂代謝紊亂動物模型，再給予動物受試樣品，可檢測受試樣品對高脂血癥的影響，并可判定受試樣品對脂質(zhì)的吸收、脂蛋白的形成、脂質(zhì)的降解或排泄產(chǎn)生的影響。1.1.2儀器及試劑解剖器械、分光光度計、自動生化分析儀、膽固醇、膽酸鈉、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定試劑盒。1.1.3動物選擇及飼料1.1.3.1健康成年雄性大鼠，適應(yīng)期結(jié)束時，體重200±20g，首選SD大鼠，每組8－12只。1.1.3.2模型飼料在維持飼料中添加20.0%蔗糖、15.0%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等。除了粗脂肪外，模型飼料的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、鈣：磷均要達到維持飼料的國家標準。1.1.4劑量分組及受試樣品給予時間實驗設(shè)三個劑量組、空白對照組和模型對照組，以人體推薦量的5倍為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量組，必要時設(shè)陽性對照組。受試樣品給予時間為30天，必要時可延長至45天。1.1.5實驗步驟1.1.5.1適應(yīng)期：于屏障系統(tǒng)下大鼠喂飼維持飼料觀察5－7天。1.1.5.2造模期按體重隨機分成2組，10只大鼠給予維持飼料作為空白對照組，40只給予模型飼料作為模型組。每周稱量體重1次。模型組給予模型飼料1－2周后，空白對照組和模型組大鼠不禁食采血（眼內(nèi)眥或尾部采血后盡快分離血清，測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。根據(jù)TC水平將模型組隨機分成4組（即一個模型對照組、三個劑量組分組后模型組（模型對照組和三個劑量組）各組間比較TC、TG、LDL-C、HDL-C差異均無顯著性；模型組（模型對照組和三個劑量組）各組與空白對照組比較，TC、TG、LDL-C升高差異均有顯著性，判定模型成立。1.1.5.3受試樣品給予分組后，三個劑量組每天經(jīng)口給予受試樣品，空白對照組和模型對照組同時給予同體積的相應(yīng)溶劑，空白對照組繼續(xù)給予維持飼料，模型對照組及三個劑量組繼續(xù)給予模型飼料，并定期稱量體重，于實驗結(jié)束時不禁食采血，采血后盡快分離血清，測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。1.1.6觀察指標：TC、TG、LDL-C、HDL-C。1.1.7數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。動物實驗結(jié)果判定：有助于維持血脂健康水平（膽固醇/甘油三酯）功能結(jié)果判定：實驗結(jié)束時，模型對照組和空白對照組比較，血清甘油三酯升高，血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇升高，差異均有顯著性，判定模型成立。（1）各劑量組與模型對照組比較，任一劑量組血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低，且任一劑量組血清甘油三酯降低，差異有顯著性，同時各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血脂健康水平功能動物實驗結(jié)果陽性。（2）各劑量組與模型對照組比較，任一劑量組血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低，差異均有顯著性，同時各劑量組血清甘油三酯不顯著高于模型對照組，各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血膽固醇健康水平功能動物實驗結(jié)果陽性。（3）各劑量組與模型對照組比較，任一劑量組血清甘油三酯降低，差異有顯著性，同時各劑量組血清總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇不顯著高于模型對照組，血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血甘油三酯健康水平功能動物實驗結(jié)果陽性。1.1.8注意事項1.1.8.1在建立動物模型中，可因動物品系、飼養(yǎng)管理而影響模型的建立。1.1.8.2保證維持飼料的各種營養(yǎng)成分，必要時需進行檢測，除了粗脂肪外，模型飼料的水分、粗蛋白、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、鈣：磷均要達到維持飼料的國家標準。1.1.8.3模型飼料喂養(yǎng)期間，模型組血中膽固醇水平比較穩(wěn)定，甘油三酯水平會逐漸恢復正常水平，故模型飼料給予時間不能超過8周。1.2高膽固醇血癥動物模型1.2.1原理用含有膽固醇、豬油、膽酸鈉的飼料喂養(yǎng)動物可形成高膽固醇脂代謝紊亂動物模型，再給予動物受試樣品，可檢測受試樣品對高膽固醇脂血癥的影響，并可判定受試樣品對脂質(zhì)的吸收、脂蛋白的形成、脂質(zhì)的降解或排泄產(chǎn)生的影響。1.2.2儀器及試劑解剖器械，分光光度計，自動生化分析儀，膽固醇、膽酸鈉，血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定試劑盒。1.2.3動物選擇及飼料1.2.3.1大鼠模型：健康成年雄性大鼠，適應(yīng)期結(jié)束時，體重200±20g，首選SD大鼠，每組8－12只。金黃地鼠模型：健康成年雄性金黃地鼠，適應(yīng)期結(jié)束時，體重100±10g，每組8－12只。1.2.3.2模型飼料大鼠模型：在維持飼料中添加1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉、3－5%豬油、適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等。除了粗脂肪外，模型飼料的其它質(zhì)量指標均要達到維持飼料的國家標準。金黃地鼠模型：在維持飼料中添加0.2%膽固醇，其余同大鼠模型。1.2.4劑量分組及受試樣品給予時間實驗設(shè)三個劑量組、空白對照組和模型對照組，以人體推薦量的5倍為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量組，必要時設(shè)陽性對照組。受試樣品給予時間為30天，必要時可延長至45天。1.2.5實驗步驟1.2.5.1適應(yīng)期：于屏障系統(tǒng)下動物喂飼維持飼料觀察5－7天。1.2.5.2造模期：按體重隨機分成2組，10只動物給予維持飼料作為空白對照組，40只給予模型飼料作為模型組。每周稱量體重1次。模型組給予模型飼料1－2周后，空白對照組和模型組大鼠不禁食采血（眼內(nèi)眥或尾部采血后盡快分離血清，測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。根據(jù)TC水平將模型組隨機分成4組（即一個模型對照組、三個劑量組分組后模型組（模型對照組和三個劑量組）各組間比較TC、TG、LDL-C、HDL-C差異均無顯著性；模型組（模型對照組和三個劑量組）各組與空白對照組比較，TC、TG、LDL-C升高差異均有顯著性，判定模型成立。1.2.5.3受試樣品給予分組后，三個劑量組每天經(jīng)口給予受試樣品，空白對照組和模型對照組同時給予同體積的相應(yīng)溶劑，空白對照組繼續(xù)給予維持飼料，模型對照組及三個劑量組繼續(xù)給予模型飼料，并定期稱量體重，于實驗結(jié)束時不禁食采血，采血后盡快分離血清，測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。1.2.6觀察指標：TC、TG、LDL-C、HDL-C。1.2.7數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。動物實驗結(jié)果判定：有助于維持血膽固醇健康水平功能結(jié)果判定：模型對照組和空白對照組比較，血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇升高，差異有顯著性，血清甘油三酯差異無顯著性，判定模型成立。各劑量組與模型對照組比較，任一劑量組血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低，差異有顯著性，并且各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對照組，血清甘油三酯不顯著高于模型對照組，可判定該受試樣品有助于維持血膽固醇健康水平功能動物實驗結(jié)果陽性。1.2.8注意事項1.2.8.1在建立動物模型中，可因動物品系、飼養(yǎng)管理而影響模型的建立。1.2.8.2保證維持飼料的各種營養(yǎng)成分，必要時需進行檢測。2人體試食試驗方法2.1受試者納入標準2.1.1在正常飲食情況下，檢測禁食12－14小時后的血脂水平，半年內(nèi)至少有兩次血脂檢測結(jié)果，血清總膽固醇在5.18－6.21mmol/L，并且血清甘油三酯在1.70－2.25mmol/L，可作為有助于維持血脂健康水平功能試驗備選對象；血清甘油三酯在1.70－2.25mmol/L，并且血清總膽固醇≤6.21mmol/L，可作為有助于維持血甘油三酯健康水平功能試驗備選對象；血清總膽固醇在5.18－6.21mmol/L，并且血清甘油三酯≤2.25mmol/L，可作為有助于維持血膽固醇健康水平功能試驗備選對象，在參考動物實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇相應(yīng)指標者為受試對象。2.1.2獲得知情同意書，自愿參加試驗者。2.2排除受試者標準2.2.1年齡在18歲以下或65歲以上者。2.2.2妊娠或哺乳期婦女，過敏體質(zhì)或?qū)Ρ臼茉嚇悠愤^敏者。2.2.3合并有心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重疾病，精神病患者。2.2.4近兩周曾服用降脂藥物等，影響到對結(jié)果的判斷者。2.2.5高脂血癥患者。2.2.6未按規(guī)定食用受試樣品，或資料不全，影響功效或安全性判斷者。2.3受試樣品的劑量和使用方法根據(jù)受試樣品推薦量和推薦方法確定。2.4試驗設(shè)計及分組要求采用組間對照設(shè)計。根據(jù)隨機盲法的要求進行分組。按受試者血脂水平隨機分為試食組和對照組，盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如年齡、性別、飲食等，進行均衡性檢驗，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。試食組服用受試樣品，對照組可服用安慰劑或采用空白對照。試驗周期45天，不超過6個月。2.5觀察指標2.5.1安全性指標2.5.1.1一般狀況（包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等）2.5.1.2血、尿、便常規(guī)檢查2.5.1.3肝、腎功能檢查2.5.1.4胸片、心電圖、腹部B超檢查（僅在試驗開始前進行）2.5.2功效性指標2.5.2.1血清總膽固醇（TC）水平及降低百分率、甘油三酯（TG）水平及降低百分率、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平及上升幅度、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。2.5.2.2功效判定標準有效：TC降低>10%或降至正常（<5.18mmol/L）；TG降低>15%或降至正常（<1.70mmol/L）；HDL-C上升>0.104mmol/L。血脂總有效：TC、TG、HDL-C三項指標均達到有效標準者。無效：未達到有效標準者。觀察血清總膽固醇（TC）有效率、甘油三酯（TG）有效率、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）有效率及血脂總有效率。2.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定凡自身對照資料可以采用配對t檢驗，兩組均數(shù)比較采用成組t檢驗，后者需進行方差齊性檢驗，對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)方差齊后，用轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進行t檢驗；若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍不能滿足正態(tài)方差齊要求，改用t’檢驗或秩和檢驗；方差齊但變異系數(shù)太大（如CV>50%）的資料應(yīng)用秩和檢驗。有效率及總有效率采用2檢驗進行檢驗。四格表總例數(shù)小于40，或總例數(shù)等于或大于40但出現(xiàn)理論數(shù)等于或小于1時，應(yīng)改用確切概率法。2.6.1有助于維持血脂健康水平功能結(jié)果判定試食組自身比較及試食組與對照組組間比較，受試者血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇降低，差異均有顯著性，同時血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于對照組，試驗組血脂總有效率顯著高于對照組，可判定該受試樣品有助于維持血脂健康水平功能人體試食試驗結(jié)果陽性。2.6.2有助于維持血膽固醇健康水平功能結(jié)果判定試食組自身比較及試食組與對照組組間比較，受試者血清總膽固醇、低密度脂