分子生物學(xué)-DNA的復(fù)制課件

MolecularBiologyBiotechnologyInstituteHuDongwei1第三章DNA的復(fù)制

2一、半保留復(fù)制Semi-conservationreplication以每條鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則由DNA聚合酶催化合成新的互補(bǔ)鏈。34二、復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制子

Originofreplication(ori)andreplicon

DNA復(fù)制從特定位置開始，即復(fù)制起點(diǎn)，然后向兩邊進(jìn)行復(fù)制。

原核生物DNA分子為一個(gè)復(fù)制子；而真核生物每個(gè)DNA分子有多個(gè)復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子長(zhǎng)約50-200kb。5二、復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制子

Originofreplication(ori)andreplicon復(fù)制起點(diǎn)有特殊的序列結(jié)構(gòu)：

A.

反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)，與復(fù)制酶系統(tǒng)的識(shí)別有關(guān)；

B.啟動(dòng)子序列。

C.呼吸區(qū)序列6三、半不連續(xù)復(fù)制

Semi-discontinuousreplicationDNA生物合成方向?yàn)?'→3'延伸合成。在復(fù)制起點(diǎn)向兩側(cè)復(fù)制形成兩個(gè)復(fù)制叉(replicationforks)。前導(dǎo)鏈(leadingstrand)的合成是連續(xù)的；后續(xù)鏈(laggingstrand)以岡崎片段(Okaxakifragments)的形式分段合成，再連接。7四、參與DNA復(fù)制的酶與蛋白89螺旋酶(Helicase)利用ATP的能量，促使DNA在復(fù)制叉打開為單鏈。

E.coli中一種為螺旋酶I或螺旋酶III，與后續(xù)鏈的模板DNA結(jié)合沿5'→3'方向運(yùn)動(dòng)；第二種為Rep蛋白，和前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿3'→5'方向運(yùn)動(dòng)。102單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSBP)

E.coli的SSBP為四聚體，可結(jié)合32bp。

SSBP使單鏈DNA呈伸展?fàn)顟B(tài)，有利于單鏈DNA作為模板。

SSBP防止單鏈DNA重新配對(duì)或被降解。11

催化DNA不同超螺旋狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變。A.拓?fù)洚悩?gòu)酶I：雙鏈解旋

切斷

形成“酶-DNA“共價(jià)中間物

DNA連接。不需輔助因子。

B.DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNAgyrase)：拓?fù)洚悩?gòu)酶II，引入DNA分子負(fù)超螺旋。需要ATP。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topisomerase)

124引物酶(Primase)

DNA的復(fù)制需要RNA引物。E.coli引物酶由dnaG基因編碼，60KD，單細(xì)胞50-100個(gè)分子。在某些單鏈?zhǔn)删w和質(zhì)粒DNA復(fù)制時(shí)，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。13引物酶與一般RNA聚合酶的區(qū)別：（1）對(duì)雷米封不敏感，而RNA聚合酶則敏感；（2）可以利用核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸兩種底物；（3）只在復(fù)制起點(diǎn)處合成RNA引物而引發(fā)DNA的復(fù)制。

145DNA聚合酶(DNAPolymerase,DNAPol)基本特性：（1）以dNTP為底物催化合成DNA；（2）需要模板和引物；（3）DNA合成的方向是5‘

3’。15109kD多肽，每個(gè)細(xì)胞有約400分子。模板專一性和底物專一性均較差。

除了聚合酶活性外，DNAPolI酶還具有：（1）3‘→5’外切酶活性（2）5‘→3’外切酶活性DNA聚合酶活性和5‘→3’外切酶活性協(xié)同作用，可以進(jìn)行缺口平移(Nicktranslation)。A．E.coliDNA聚合酶I(DNApolI)16120kD，每個(gè)細(xì)胞約有100個(gè)酶分子，活性為DNAPolI的5%。催化特性：

(1)補(bǔ)平作用：最適模板為雙鏈DNA中間有空隙的單鏈DNA部分；

(2)具有3'→5'外切酶活性，但無(wú)5'→3'外切酶活性。(3)可能在DNA的損傷修復(fù)中有一定作用。

B．E.coliDNA聚合酶II(DNApolII)17

DNA復(fù)制所必需的酶；多種亞基，每個(gè)細(xì)胞中10-20個(gè)分子。具有3‘→5’和5‘→3’外切酶活性。3‘→5’外切酶活性的最適底物是單鏈?zhǔn)荄NA；5'→3'外切酶活性要求有單鏈DNA為起始作用底物，但一旦開始后，便可作用于雙鏈區(qū)。C．E.coliDNA聚合酶III(DNApolIII)1819(1)DNA聚合酶a，300kD，4或5個(gè)亞基組成，占總量的80-90%，主要負(fù)責(zé)染色體DNA的復(fù)制。(2)DNA聚合酶b，45kD，單鏈，主要修復(fù)核內(nèi)DNA。D．真核生物的DNA聚合酶20(3)DNA聚合酶g，140kD，負(fù)責(zé)線粒體DNA的復(fù)制。(4)DNA聚合酶δ，與原核生物的聚合酶類似，具有3‘→5’核酸外切酶活性。除了DNA聚合酶δ，其它DNA聚合酶均沒(méi)有3'→5'或5'→3'外切酶活性。DNApolymerasesinhumanandSV40216DNA連接酶(DNAlygase)

催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。

(1)大腸桿菌的DNA連接酶

75kD，對(duì)胰蛋白酶敏感，每個(gè)細(xì)胞中約有300個(gè)分子。在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組中起著重要的作用。(2)噬菌體T4DNA連接酶

60kD，需要ATP?？蛇B接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。A．原核生物22真核生物DNA連接酶有兩型，連接酶I和II。需要ATP參與提供能量。

DNA連接酶I約為200kD，主要存在于生長(zhǎng)旺盛細(xì)胞中；

DNA連接酶II約85kD，主要存在于生長(zhǎng)于不活躍的細(xì)胞(restingcell)中。B．真核生物DNA連接酶

23五、DNA復(fù)制過(guò)程1復(fù)制的引發(fā)(Priming)

包括DNA復(fù)制起點(diǎn)雙鏈打開，RNA引物的合成，DNA聚合酶聚合反應(yīng)開始進(jìn)行。

轉(zhuǎn)錄激活(transcriptionalactivation)：RNA聚合酶沿后續(xù)鏈模板轉(zhuǎn)錄一短的RNA分子，分開DNA雙鏈；特定序列與引發(fā)體結(jié)合，并在前導(dǎo)鏈模板DNA上開始合成RNA引物的過(guò)程。前導(dǎo)鏈(leadingstrand)的復(fù)制引發(fā)過(guò)程中還需要其他一些蛋白質(zhì)參與，如大腸桿菌的dnaA蛋白。24五、DNA復(fù)制過(guò)程1復(fù)制的引發(fā)(Priming)包括DNA復(fù)制起點(diǎn)雙鏈打開，RNA引物的合成，DNA聚合酶聚合反應(yīng)開始進(jìn)行。

轉(zhuǎn)錄激活(transcriptionalactivation)：RNA聚合酶沿后續(xù)鏈模板轉(zhuǎn)錄一短的RNA分子，分開DNA雙鏈；特定序列與引發(fā)體結(jié)合，并在前導(dǎo)鏈模板DNA上開始合成RNA引物的過(guò)程。RNA引物可能與減少DNA復(fù)制起始處的突變有關(guān)。

25引發(fā)過(guò)程：DNA螺旋酶首先在復(fù)制起點(diǎn)處將雙鏈DNA解開合成RNA引物分子，分開雙鏈DNA鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)結(jié)合在被解開的鏈上復(fù)制因子X(n蛋白)，復(fù)制因子Y(n‘蛋白)，n“蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6種蛋白質(zhì)組成的引發(fā)前體(preprimosome)，與單鏈DNA結(jié)合生成中間物引發(fā)前體與引物酶(primase)組裝成引發(fā)體(primosome)引發(fā)體在單鏈DNA上移動(dòng)，在dnaB亞基的作用下識(shí)別DNA復(fù)制起點(diǎn)位置引發(fā)體首先在前導(dǎo)鏈上合成RNA引物，然后在后續(xù)鏈上沿5‘→3’方向不停的移動(dòng)，在一定距離上反復(fù)合成RNA引物。26DNA復(fù)制的延伸由DNA聚合酶III催化2728正超螺旋的解除（1）DNA解鏈而產(chǎn)生正超螺旋可以被原來(lái)存在的負(fù)超螺旋所中和；（2）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I可以打開一條鏈，使正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變成松弛狀態(tài)；而DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II（旋轉(zhuǎn)酶）可以在DNA解鏈前方不停地繼續(xù)將負(fù)超螺旋引入雙鏈DNA。這兩種機(jī)制保證了無(wú)論是環(huán)狀DNA還是開環(huán)DNA的復(fù)制順利的解鏈。DNA生長(zhǎng)鏈的延伸主要由DNA聚合酶III催化，由7種多肽組成。全酶中所有亞基對(duì)完成DNA復(fù)制都是必需的。α亞基具有聚合功能和5'→3'外切酶活性，ε亞基具有3'→5'外切酶活性。另外，全酶中還有ATP分子它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一個(gè)脫氧核糖核苷酸連接在RNA引物上所必需的，其他亞基的功能尚不清楚。在DNA復(fù)制叉處要能由兩套DNA聚合酶III在同一時(shí)間分別進(jìn)行復(fù)制DNA前導(dǎo)鏈和后續(xù)鏈。如果后續(xù)鏈模板環(huán)繞DNA聚合酶III全酶，并通過(guò)DNA聚合酶III，然后再折向與未解鏈的雙鏈DNA在同一方向上，則后續(xù)鏈的合成可以和前導(dǎo)鏈的合成在同一方向上進(jìn)行。

29當(dāng)DNA聚合酶III沿著后續(xù)鏈模板移動(dòng)時(shí)，遇到RNA引物后就開始延伸合成。到達(dá)前一岡崎片段時(shí)停止。復(fù)制叉繼續(xù)向前運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生了又一后續(xù)鏈岡崎片段。DNA復(fù)制體(replisome)：在復(fù)制叉附近，形成了以兩套DNA聚合酶III全酶分子、引發(fā)體和螺旋構(gòu)成的類似核糖體大小的復(fù)合體。復(fù)制體在DNA前導(dǎo)鏈模板和后續(xù)鏈模板上移動(dòng)時(shí)便合成了連續(xù)的DNA前導(dǎo)鏈和由許多岡崎片段組成的后續(xù)鏈。在DNA合成延伸過(guò)程中主要是DNA聚合酶III的作用。當(dāng)岡崎片段形成后，DNA聚合酶I通過(guò)其5'→3'外切酶活性切除岡崎片段上的RNA引物，同時(shí)，利用后一個(gè)岡崎片段作為引物由5'→3'合成DNA。最后兩個(gè)岡崎片段由DNA連接酶將其接起來(lái)，形成完整的DNA后續(xù)鏈。30DNA復(fù)制的終止

DNA上也存在著復(fù)制終止位點(diǎn)，DNA復(fù)制將在復(fù)制終止位點(diǎn)處終止，并不一定等全部DNA合成完畢。當(dāng)RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA聚合I所填充。但目前對(duì)復(fù)制終止位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和功能了解甚少。線性DNA分子兩端是靠端粒酶完成其復(fù)制。31六、DNA復(fù)制的真實(shí)性大腸桿菌中，每復(fù)制109-1010個(gè)核苷酸便要出現(xiàn)一個(gè)誤差。每1000個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)一次分裂才會(huì)插入一個(gè)不正常的核苷酸。如果單純靠堿基對(duì)原則來(lái)維持其DNA復(fù)制準(zhǔn)確性的話，那么誤差出現(xiàn)的頻率將為10-4-10-5。因而，在細(xì)胞內(nèi)除了堿基對(duì)原則外，必然還有其他因子的作用，來(lái)維持DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。32DNA聚合酶本身具有校對(duì)作用

按堿基配對(duì)原則，錯(cuò)誤核苷酸摻入的機(jī)率為10-4-10-5，然后，DNA聚合酶本身的校對(duì)作用又可以使錯(cuò)誤核苷酸摻入的機(jī)率為10-4-10-5。這樣，每摻入一個(gè)核苷酸，發(fā)生錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)只有10-8-10-10。引物RNA的切除

DNA復(fù)制開始時(shí)摻入的核苷酸往往容易出錯(cuò)。RNA引物可以被切除，不會(huì)影響DNA的準(zhǔn)確性。

真核生物DNA聚合酶無(wú)3'→5'外切酶活性。因此，可能存在其他校正機(jī)制以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。33七、環(huán)狀DNA的復(fù)制的方式1．θ型復(fù)制環(huán)狀DNA可以采取上述典型的DNA復(fù)制方式進(jìn)行復(fù)制，即從復(fù)制起點(diǎn)開始，雙向同時(shí)進(jìn)行，形成θ樣中間物，故又稱"θ"型復(fù)制，最后兩個(gè)復(fù)制方向相遇而終止復(fù)制。342．D環(huán)復(fù)制(D-loop)

線粒體DNA的復(fù)制屬于D環(huán)復(fù)制，即兩條鏈的復(fù)制不是同步的。（1）H鏈?zhǔn)紫群铣桑涸趶?fù)制起點(diǎn)處以L鏈為模板，合成─RNA引物，然后由DNA聚合酶γ催化合成一個(gè)500-600bp長(zhǎng)的H鏈片段。該片段與L鏈以氫鍵結(jié)合，將親代的H鏈置換出來(lái)，產(chǎn)生一種D環(huán)復(fù)制中間物。（2）H鏈片段的繼續(xù)合成：上述產(chǎn)生的H鏈片段由于太短而很容易被擠出去恢復(fù)線粒體DNA完整的雙螺旋結(jié)構(gòu)。但有時(shí)這個(gè)片段會(huì)繼續(xù)合成，這需要依靠拓?fù)洚悩?gòu)酶和螺旋酶的作用將雙鏈打開。（3）L鏈合成開始：以被置換下來(lái)的親代H鏈為模板開始合成L鏈DNA，合成也需要RNA引物。（4）復(fù)制的完成：H鏈的合成提前完成，L鏈的合成隨后結(jié)束。線粒體DNA合成速度相當(dāng)緩慢，約每秒10個(gè)核苷酸，整個(gè)復(fù)制過(guò)程需要1個(gè)小時(shí)。剛剛合成的線粒體DNA是松弛型的，需要40分鐘將其變成超螺旋型。352．滾環(huán)復(fù)制(Rollingcircle)親代雙鏈DNA的一條鏈在DNA復(fù)制起點(diǎn)處被切開，其5‘端游離出來(lái)并且很快被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合。同時(shí)環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)繞其軸不斷的旋轉(zhuǎn)，而且以3’-OH端為引物的DNA生長(zhǎng)鏈則不斷地以另一條環(huán)狀DNA鏈為模板向前延伸。在DNA解鏈時(shí)不會(huì)產(chǎn)生超螺旋。當(dāng)5'-端從環(huán)上解下來(lái)后不久，即與單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，以后可移動(dòng)的引發(fā)體便在其上形成，以引發(fā)RNA引物的合成，然后由DNA聚合酶III催化合成岡崎片段。36DNA的延伸可以一直進(jìn)行下去，產(chǎn)生的DNA鏈可以是親代DNA單位長(zhǎng)度的許多倍。37八、不需要RNA引物的DNA復(fù)制部分線性DNA病毒的復(fù)制不需要RNA引物。復(fù)制從DNA的任何一端開始。只能利用一條DNA鏈作為模板，即以3‘→5’鏈為模板。另一條非模板DNA鏈自身的5‘和3’可以互補(bǔ)配對(duì)，然后在3‘端開始以此鏈為模板重新合成另一條子鏈。38八、不需要RNA引物的DNA復(fù)制所有的腺病毒DNA生長(zhǎng)鏈上都有一個(gè)特異的蛋白質(zhì)分子附著在其5'末端的胞嘧啶核苷酸上。在DNA復(fù)制開始之前，該末端蛋白質(zhì)通過(guò)共價(jià)鍵與dCMP的5'磷酸基相連。胞嘧啶通過(guò)堿基配對(duì)與腺病毒DNA模板3'末端的鳥嘌呤核苷酸配對(duì)結(jié)合，然后由病毒本身編碼的DNA聚合酶以此末端蛋白-dCMP復(fù)合物為引物連續(xù)合成腺病毒整個(gè)基因組的36000個(gè)核苷酸。39九、DNA的修復(fù)(DNArepairing)回復(fù)修復(fù)

一般能夠?qū)NA修復(fù)到原樣。光修復(fù)由細(xì)菌中的DNA光解酶（photolyase）完成，此酶能特異性識(shí)別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價(jià)結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應(yīng)不需要光；結(jié)合后如受300-600nm波長(zhǎng)的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個(gè)正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。單鏈斷裂的重接部分可僅由DNA連接酶（ligase）參與而完全修復(fù)。雙鏈斷裂缺幾乎不能修復(fù)。40堿基的直接插入

DNA鏈上嘌呤的脫落造成無(wú)嘌呤位點(diǎn)，能被DNA嘌呤插入酶（insertase）識(shí)別結(jié)合，在K+存在的條件下，催化游離嘌呤或脫氧嘌呤核苷插入生成糖苷鍵，且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴(yán)格配對(duì)，使DNA完全恢復(fù)。烷基的轉(zhuǎn)移

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