培訓課件-04培訓

低，主要用來制備純血粉或發(fā)酵血粉。其中牛血占了很大的比例，但是都難以形成產(chǎn)業(yè)化。本第一節(jié)牛血的基本知識血液由液體部分血漿和懸浮在液體內(nèi)的有形成分組成。如果將牛全血放在試管內(nèi)，用抗凝血劑或其他方法處理，以防其凝固，則靜置一段時間或用離心機沉淀分離后，就可看到試管中層之間可以看到一層薄薄的白色物質，這一層是白細胞和血小板。牛的全血中水分約占80%,干物質約占20%。其中血漿約占60%,血細胞約占40%。血漿中含水分90%~92%,干物質8%~10%。血漿中的干物質主要由蛋白質和鹽類所組成(見表4-1)。血漿蛋白質包括清蛋白、球蛋白、纖維蛋白原三種，約占血漿總量的6%~8%。纖維蛋白原在血血漿中還含有一些無機鹽，其含量在正常條件下比較恒定，約占0.9%。此外，血漿中還含紅細胞是血液中的主要組成部分，它是紅色和圓形的球體，紅細胞中水分約占60%,干物質約占40%。干物質中主要為血紅蛋白，占90%;其余10%為其他蛋白、類脂質、葡萄糖和無機鹽。白細胞是無色、有核的球體，體積比紅細胞大，數(shù)量比紅細胞少得多。白細胞含有普通細胞的成分，如蛋白質、核蛋白、脂類、卵磷脂、膽固醇、酶和無機鹽，并有相當多的蛋白酶。血小板是一種小而無核的不規(guī)則形小體，其主要機能是參與血液的凝固過程。表4-1血漿干物質的組成剛從牛體流出的血液為紅色不透明微堿性的液體，稍帶黏性，有咸味和特殊臭味。牛的血量是比較恒定的，一般約占體重的8%。在正常生理條件下，只有一部分血液在血管內(nèi)循環(huán)，另一部分貯藏在血庫中。脾臟、肝臟和皮膚都是血庫。據(jù)測定，脾臟約貯存有總血量的16%,肝臟約貯存有20%,皮膚內(nèi)約貯存有10%。所以循環(huán)的血液大約占全身總血量的一半。因此，從血液的實際可被利用量來說，牛血的采出率僅占體重的5%。(一)牛血的凝固牛的血液從血管或放血口流出來附是液態(tài)，如果靜置不動、約經(jīng)5-10分鐘后，呈現(xiàn)膠狀的變化過程。發(fā)生這種變化的根本原因，是由于血漿中呈現(xiàn)溶解狀態(tài)的纖維蛋白原，轉變成不溶解的纖維蛋白。纖維蛋白形成后，在血液中構成構密的細纖維網(wǎng)，把所有的血細胞都維繞在一起，因而使原來呈液體狀的血液逐漸變成膠凍狀的血塊。血液凝固后，由于血小板成堆地粘聚在纖維蛋白絲上，使纖蛋白絲漸漸縮短，因而使血塊變硬，并從血塊中擠出血清。(二)牛血的比重牛血的比重因性別不同而異，公牛全血的比重為1.06;母牛全(三)牛血的酸堿度牛血呈弱堿性，pH7.3-7.5,一般血液的酸堿度是指血漿的pH,血細胞的pH約為7.1身有緩沖功能，即使不斷增加碳酸，仍可保持7.4左右。(四)牛血的黏滯度血液的黏滯度是根據(jù)與純水的黏滯度作比較而確定的。如以水的黏滯度為1,則全血的黏滯第二節(jié)牛血的采集和保藏一、牛血的采集即將已擊暈的牛沿頸橫割，切斷全部頸部血管而放血。第二種是將牛倒放在地板上，在頸靜脈溝處作一切口，切斷一側的頸靜脈和頸動脈，屠刀通過胸腔前口向里插入，在兩頸動脈的接合處切斷前主動脈而放血。第三種是僅割斷頸部的血管，即兩側的頸靜脈和頸動脈放血。小型企業(yè)或簡陋居宰場，沒有現(xiàn)代化設備，也不能保持衛(wèi)生。因此，血液采集衛(wèi)生就成為問題。如將牛倒置在地板上署宰，很難采集到清潔的血液，污染或損失是不可避免的。為了解決這個問題，可用直徑為50厘米，深為10-12厘米的盆來采集血液。這種盆一端安有一個流出嘴，另一端有一個手柄。而無論制造何種血產(chǎn)品，采集的血液必須避免污染。常見的污染物有在放血的最后階段牛吐出的食物；屠宰場地板上飛濺的糞便或污水；加工過程中所利用的沖洗水。所以，采集血液后應當場檢查，避免污染。在衛(wèi)生條件較好的屠宰場，實行電擊暈屠宰，采集血液的容器因加工目的不同而不同，如加工血粉可用塑料容器，如需使血液凝固，貯放容器可以是圓筒型或箱型，脫纖維蛋白血或抗凝劑的血，應存放在奶罐型的容器中，用不銹為了防止腐敗，采集的血液要盡快運往加工廠，特別是夏秋季節(jié)，為避免血液在途中溫度升高，運輸時間最好安排在夜間或早晨，或用隔熱材料遮蓋容器。同時，血液必須在密閉容器剛從牛體放出的血液為紅色不透明液體，如果不采取任何措施，很快就會變暗，并隨之形成凝塊。某些產(chǎn)品的制取原料必須是液態(tài)血，也就是加入抗凝劑的血液。常用的抗凝劑有：1、草酸鹽常用的有草酸鈉和草酸鉀。每升血液(1升血液約1千克重)加入草酸鈉或草酸鉀1克，以其30%的水溶液加入血中：或用0.6克草酸銨與0.4克草酸鉀，以少量生理鹽水稀釋后加入1升血內(nèi)。草酸鹽的抗凝作用，是由于草酸鹽能使血液中的鈣離子沉淀，從而防止血液的凝固。加工食用血產(chǎn)品或制取醫(yī)用血產(chǎn)品，禁止使用草酸鹽，因為草酸鹽有毒。2.檸檬酸鈉每升血液加入檸檬酸鈉3克，以其少量水稀釋或較大量生理鹽水稀釋后加入血中。檸檬酸鈉能將血液中的鈣轉化為非離子態(tài)，從而起到抗凝作用。在食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)方面，檸檬酸鈉的使用法規(guī)各不相同。因此，應用時應先查清有關法規(guī)。3.乙二胺四乙酸(EDTA)乙二胺四乙酸的二鈉鹽作為抗凝劑，是以每升血液加入2克的比例，先稀釋于少量水中或大量生理鹽水中，然后再加入血內(nèi)。乙二胺四乙酸的抗凝作用，是通過絡合血液凝固所需的鈣離子而起作用。絕大多數(shù)國家允許在食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中使用乙二4.肝素肝素是最理想的抗凝劑之一，商業(yè)上最常見到的是肝素的鈉鹽、鈣鹽和鉀鹽。應用時，每升血液加入200毫升肝素。肝素有抑制血致活酶和凝血酶的作用。因此，能阻止血液的凝結。肝素抗凝液態(tài)血是食品加工和醫(yī)藥制造的原料?？鼓齽┳詈靡怨腆w鹽的形式貯存，使用前配制成溶液?？鼓齽┤芤河卸?，尤其是肝素，絕不能與食品接觸，為了使用安全，抗凝劑溶液應貼標簽，并用食品所允許的染料輕微染色，以抗凝劑的使用方法，是在采集血液后的2-5分鐘內(nèi)血液尚未凝固前，根據(jù)血液的容積計算出應加的抗凝劑數(shù)量，或計算出應加的預配抗凝液容量，然后緩緩加入血液中，并攪拌均勻。制取液態(tài)血除添加抗凝劑外，也可以用人工方法脫出血液中的纖維蛋白的方法，適合于中小型加工廠或屠宰場應用。方法是：將牛體剛放出的血盛入容器內(nèi)，用表面粗糙的木棒或長柄漂浮在血液表面上，這樣就可以將纖維蛋白與液態(tài)血分離。當把脫纖維蛋白的血液灌入另一容器時，經(jīng)過過濾，纖維蛋白即可瀝出。被脫去纖維蛋白的血液，保持其液態(tài)特性，在進入下一在人工攪拌脫血纖維蛋白時，可從血液中得到12%左右的血液纖維蛋白，收集到容器中，藏15天左右。第三節(jié)牛血的加工與利用一、飼用血粉的加工(一)牛血粉的營養(yǎng)價值牛血粉含粗蛋白質80%以上，含干物質82%-85%,含水分5%~8%,并含有多種維生素和微量元素，是配合飼料中很好的動物性蛋白質和必需氨基酸的來源。配合飼料中加入適量血粉，可以獲得滿意的生產(chǎn)結果。據(jù)測定，血粉中粗蛋白質對于雞的消化率為87%,粗脂肪的消化率為90%。而且用血粉喂雞，其賴氨酸的利用率高于魚粉、大豆餅和脫脂奶粉。飼養(yǎng)實踐中使用的血粉產(chǎn)品，有血粉和骨肉血粉，多用于雞、豬的動物性蛋白質補充料，喂飼量一般為配合飼料的5%,雛雞則為3%。(二)牛血粉的加工工藝1.血液的采集與處理飼用血粉是用于飼喂家畜、家禽的產(chǎn)品，所以必須保證血液在采集過程中不被污染，尤其要防止沖刷地板的污水及其他外來物質的污染，因其中很可能含有洗滌劑、殺菌劑、殺蟲劑殘余，以及寄生蟲蟲卵、細菌孢子等。當血液干燥，這些殘余物質將會出采集到的血液最好當天進行加工，以防腐敗。如果不能及時加工，可以全血中添加0.5%-1.5%的生石灰，并不斷攪拌直至血液凝固。凝固后的血液呈膠體韌性，不粘附容器，可以保存2.凝血的蒸煮將凝固牛血用刀劃成10厘米大小的立方塊，放入雙煮器中蒸煮，使其繼續(xù)凝固。用雙煮器較理想，但會增加燃料成本和設備費用。也可用其他容器以直接在火上煮，但會使部分凝血炭化。利用大型淺盤狀容器蒸煮，可使炭化減少到最小程度。蒸煮時，先在容器 (或鍋)內(nèi)放入適量清水，加熱至沸騰，再將凝血塊倒入容器中，水即停沸，此時要注意不可使水再沸，否則凝血塊即行散開，呈泡沫狀，損失很大。在不沸的水中約煮20分鐘左右，凝血塊內(nèi)部顏色變深，而且內(nèi)部和外部都已凝結，即可取出將水瀝干。煮過的血塊可放入麻布袋或其他針織袋中，壓迫脫水，然后再掛起來冷凍脫水；也可以放在壓榨機上壓出水分，經(jīng)過上述任何一種方法脫水后，血塊的水分含量降低到50%以下。3.凝血的干燥凝血干燥簡便易行的方法是日光照射。將蒸煮過的凝血塊弄碎，均勻撒在葦席、竹匾，或鋪于地面上的暗色塑料薄膜以上時，約經(jīng)2~3天可完成干燥過程。在相對濕度高于50%的地區(qū)，白天攤開暴曬，晚上推成堆，用塑料薄膜覆蓋，以避免吸潮而損失。如果生產(chǎn)規(guī)模較大，有條件，蒸煮血塊也可以在高壓熱氣循環(huán)爐中以60℃干燥。4.干血的粉碎干燥后的凝血呈易碎的小塊，可用石磨磨碎，或用粉碎機粉碎成細粒，即5.血粉的貯藏血粉可用塑料袋、厚紙袋、麻袋或其他適合的容器包裝。未添加石灰的血粉僅能保存4周，而添加石灰后的血粉保存期可延長到一年以上。目前有許多血粉進口國，強制要求血粉在包裝前放入干燥器內(nèi)以100℃,持續(xù)30分鐘消毒，養(yǎng)完全冷卻后，裝入密圖容器或塑料袋中；或用環(huán)氧乙烷照騰騰孝，消毒后的產(chǎn)品須保存在密圖的容器中。二、工業(yè)用血粉的加工工業(yè)用血粉又稱噴霧干燥血或黑血蛋白，星深紅褐色粉狀。含水分5%-8%,灰分10%-15%,(一)工業(yè)用血粉的用途工業(yè)用血粉的用途很廣，膠合板工業(yè)中用作粘合劑；皮革工亞中用作蛋白質拋光劑：防清乳膠中作為穩(wěn)定劑：陶瓷制品中作為泡沫穩(wěn)定劑和分解過氧化氫的催化劑；也是殺蟲劑和殺真菌劑的穩(wěn)定劑，擴散劑和粘著劑；此外，在畜禽配合飼料中，既可作為動物性蛋白飼料，又可(二)工業(yè)用血粉的加工工藝1.原料血處理加工工業(yè)用血粉的原料血為脫纖維蛋白血。脫纖維蛋白血的制取方法，已在“血液的防凝”中敘述，這里不再重復。制備好的脫纖維蛋白血應在幾小時內(nèi)進行加工，如暫不能加工，須置于4℃條件下貯存。脫纖維蛋白血在噴霧干燥前必須過濾，除去血纖維蛋白和雜質?？捎脼V血池(圖4-1)過網(wǎng)放血口，B、C池之間也有一個過濾網(wǎng)放血口。當脫纖維蛋白血經(jīng)入口處進入A池，再從A池流入B地時，殘存的血纖維蛋白被濾過網(wǎng)阻止于A池一側，血漿則繼續(xù)從B池流入C池，這時又有一小部分血纖維蛋白留在B池內(nèi)。在C地安裝有4號管道和4號離心泵，用5馬力電動機帶動。接通電源后，可將C池中的血漿由管道輸送到貯血池中。圖4-1濾血池平面圖貯血池(圖4-2)用水泥制成，池長3米，寬1.9米，深2.5米。池壁上設一標尺，隨時可查看池中原料血的數(shù)量。在貯血池的上部裝有過濾器，是用鐵絲網(wǎng)制成，血漿由濾血池經(jīng)管道注入貯血池時，先過濾一次，使血漿更加潔凈。在貯血池的另一邊裝有1號離心泵1臺，由1號管道將血漿輸送到貯血槽，用血泵通過管道，將血漿壓送到噴霧干燥設備的干燥塔頂部，待噴2.噴霧干燥血漿的噴霧干燥是通過一套工業(yè)用噴霧設備來完成的，由貯血池送到干燥塔頂部的血漿，通過設在該部的噴嘴呈霧狀向下噴出。噴出的霧狀液體在噴嘴處與熱空氣進行交換后，水分被空氣帶走，血液干物質就以細粉狀落下，在干燥塔底部沉積。熱空氣在入口溫度為200~250℃,出口溫度近70℃。噴霧干燥完畢后，先通空氣冷卻血粉到室溫，然后再進行包3.包裝和貯藏為了便于銷售和使用，工業(yè)用血粉一般為1千克、2千克和5千克的小包裝。包裝袋通常為聚乙烯袋，也可用其他防水容器。如果包裝合理，可貯藏5年之久。(三)牛血粉的質量標準細粉狀血粉的質量標準，包括物理指標和化學成分指標。1.物理指標(不分級)外形：通過2毫米篩的細粉；2.化學成分指標(分級)列于表4-2表4-2血粉的化學成分指標微生態(tài)血粉是利用動物血液，經(jīng)發(fā)酵而制成的具有營養(yǎng)和保健雙重功能的血粉。其生產(chǎn)工(一)原輔材料牛血液；菌種，主要有蠟樣芽孢桿菌、枯草桿菌、嗜酸乳桿菌、糞鏈球菌、啤酒酵母。(二)加工方法1.血液處理收集常規(guī)屠宰血液，自然凝固后稱重，每1千克鮮血各加入0.2千克玉米粉、麩皮、大麥芽粉和米糖，混合攪拌成半固體勻漿。2.血液發(fā)酵鮮血加載體吸附后的半固體勻漿→蒸汽滅菌熟化→冷卻后接種蠟樣芽孢桿菌和枯草桿菌培養(yǎng)40~42℃,18小時，接種嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌培養(yǎng)液培養(yǎng)40~42℃,18小時接種啤酒酵母菌培養(yǎng)液培30~32℃,培養(yǎng)24小時，→血液發(fā)酵物。3.血粉制作血液發(fā)酵物→45℃烘干→粉碎→過篩→成品血粉。血清是血漿分離出纖維蛋白后的產(chǎn)物，為淡黃色透明液體。公犢無菌血清則是在無菌操作公犢無菌血清可作為生物實驗室的標準蛋白質溶液；也可作為病毒繁殖培養(yǎng)基的組分；生產(chǎn)病毒疫苗時作為細胞生長培養(yǎng)基的組分；該產(chǎn)品也用作某些微生物的培養(yǎng)基。需要利用無菌血清的單位很多，如醫(yī)學、生物學、農(nóng)業(yè)科學研究院；醫(yī)科、農(nóng)業(yè)大專院校，生物制品研究所、生物藥廠、衛(wèi)生防疫站以及縣中心醫(yī)院以上的各醫(yī)院都需要。目前，許多鄉(xiāng)鎮(zhèn)辦奶牛場、獸醫(yī)站等，都在利用乳用公犢牛制取無菌血清，每頭公續(xù)可制得600-800毫升粗制血清，獲凈利20元左右，如果取精制血清，經(jīng)濟收益還可大大增加。(一)制取工藝1、原料血采集應采取初生24小時以內(nèi)未吸吃乳汗的健康乳用公犢的全血。血液采集要嚴格注意衛(wèi)生，必須無菌操作，裝血容器最好是玻璃制的或不銹鋼制的，用前要徹底清洗，并采血的方法，將公瀆采用仰臥保定，在一側頸靜脈處用噴圖消毒，切開靜脈，插入引流玻璃管。玻璃管指向心部，將玻璃管與血管一起結扎。然后，放開止血鉗，將血液引流人消毒容血液采集后，讓其自然凝固，要及時遮蓋，防止污染，最好放入冰箱內(nèi)，避免過度振蕩，2.血清制取將冷凍凝血塊用鋒利刀片切成1-2厘米的小方塊，然后在5~10℃的冷室中，將凝血塊放在布氏漏斗中，血清在布氏漏斗中逐漸析出，并流入錐形瓶內(nèi)。最初2~3小時收集的血清顏色較深，應廢棄，在12小時內(nèi)收集的血清用吊桶式離心機離心，以200~250克(用帶有250毫升離心瓶的MSE離心機，每分鐘1000~1500轉)離心30~40分鐘，然后收集透明的淡黃色上清液(血清)供失活。血清的失活是以54~56℃的溫度下，在雙煮器中容納30分鐘，再在高壓滅菌鍋中，以0.13MPa壓力消毒20分鐘，最后再在Seitz式過濾器中進行過濾，將濾液裝入50毫升或100毫升的無菌安瓶中，每一安瓶應貼上標簽并注明制造日期，如公犢失活無菌3.血清的貯藏在4~5℃下安瓶裝血清最多貯藏1個月；在-20℃下可貯藏6個月，在-40℃下則能貯藏1年。如果準備深冷凍貯藏，在裝安瓶時要留有一定空間，避免冷凍時血清糖脹，4.無菌檢驗所制的公犢無菌血清應抽樣進行無菌檢驗。方法是將5毫升血清接種到肉湯培養(yǎng)基和厭氧培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天后，應無菌生長，若血清已被細菌污染，則必須廢棄。細菌5.粗制公瀆血清的制取如缺乏上述有關儀器設備，也可加工粗制血清供使用單位自行精原料血采取的要求和方法同上，經(jīng)無菌采血后，在室溫內(nèi)平衡2小時，再移至5~10℃下靜置5小時以上，以析出血清，并通過虹吸作用將上層清澈的淡黃色血清吸出，注意不要與血細胞相混；凝血塊靜置后，也可用離心機以每分鐘3000轉，離心30分鐘提出血清。然后將血清(二)注意事項制取公犢血清時應注意：從采血到分裝安瓶，每道工序都必須嚴格遵守無菌操作；所用儀器設備和容器都要高壓消毒；為防止出現(xiàn)紅色血清，可在采血用玻璃容器中加入少量生理鹽血酪素是用脫纖維蛋白的血漿，經(jīng)加酸、壓榨、干燥而制成的深棕黑色粉末狀或顆粒狀產(chǎn)物。本產(chǎn)品可作產(chǎn)塑膠，用于制作各種電器零件、容器把柄，以及充作鈕扣原料。制取方法：將100千克脫去纖維蛋白的血漿注入耐酸缸內(nèi)，以人工或機械攪拌。在攪拌過程中，徐徐添加14千克20%的硝酸，并持續(xù)攪拌1小時，在以后的6小時內(nèi)，每隔30分鐘攪拌3~5分鐘。這時血酪素就由溶液中沉淀下來，然后裝入布袋中濾去部分水分，放在竹匾或竹席上，日光曬干即成。在冬春季節(jié)陽光不足或陰雨天，須放入干燥室烘干，溫度控制在45~50℃,并經(jīng)常翻動，以便于干透。超氧化物歧化酶(SOD),簡稱SOD(superoxidedismi-tase),是一種廣泛存在于動、植物及微生胞的細胞漿內(nèi)，分子量在32000左右，由兩個豆基組成，每個亞基含1個銅和1個鋅。第二種亞基組成，每個亞基各含1個錳；來自真核細胞線粒體的Mn-SOD,由4個亞基組成，分子量約為80000。第三種類型，F(xiàn)e-SOD,呈黃色，只存在于真核細胞中，分子量在38000左右，由兩個亞基組成，每個亞基各含1個鐵。此外，在牛肝臟中還存在一種Co.Zn-SOD。自從1973年Weisiger等在雞肝臟中發(fā)現(xiàn)兩種超氧化物岐化酶以來，至今已采用了各種分離及分析方法，成功地從各種動物肝臟及血液中，分離純化了超氧化物岐化酶。同時發(fā)現(xiàn)超氧化物岐化酶的存在可能與機體衰老、腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病和輻射防護等有關。目前臨床上主要用于延緩人體衰老，防止色素沉著，消除局部炎癥，特別是治療風濕性關節(jié)炎、慢性多發(fā)性關節(jié)炎及放射治療后的炎癥，無抗原性，毒副作用較小，是很有臨床價值的治療酶。超氧化物岐化酶不僅在臨床上大顯身手，而且近年來又被廣泛地應用于日用化工行業(yè)。含有超氧化物岐化酶的化妝護膚品，對抗衰老及去除臉面雀斑等有顯著作用。添加超氧化物歧化酶的化妝護膚品倍受女士的青睞，其產(chǎn)品具有很強的競爭力。如市場上銷售的奧琪、大寶、紫羅蘭、永芳等高級護膚化妝品，都因添加了超氧化物岐化酶而成為搶手貨。隨著超氧化物歧化酶被廣泛應用于護膚霜、洗面奶、香皂等領域及活性氧、疾病診斷和抗輻射等方面的研究，超氧化物岐化酶將成為廣大藥廠和日用化工廠的重要原料。目前我國大規(guī)模生產(chǎn)超氧化物岐化酶的廠家屈指可數(shù)，市場需求量大，在今后一段時間內(nèi)供應將趨緊。因此，充分利用動物廢棄物，生產(chǎn)超氧(一)原料及試劑1.牛血血液一定要保證新鮮，無污染。2.氯化鈉這里用于配制生理鹽水。選用一級工業(yè)品。4.丙酮這里作溶劑用，選用工業(yè)丙酮。5.氯仿又稱三氯甲烷。無色透明易揮發(fā)的液體，稍有甜味，相對密度1.49,沸點61.2℃,不易燃燒，微溶于水，溶于乙醇、乙醚、苯、石油醚等。在光的作用下，能被空氣中的氧氧化成氯化氫和劇毒的光氣。這里用作溶劑，選用化學純試劑。(1)2.5微摩爾/升磷酸氫二鉀溶液的配制一般市售化學試劑其分子0.569克溶解在1000克蒸餾水中，攪拌均勻。(2)2.5微摩爾/升磷酸二氫鉀溶液的配制如市售的化學試劑分子式為KH2PO4,則在1000克蒸餾水中加入0.34克，攪拌均勻。如果分子式為KH2PO4,.2H2O,則在1000克水中加入0.43(3)緩沖溶液的配制按上述方法配好2.5微摩爾/升磷酸氫二鉀溶液和2.5微摩爾/升磷酸二氫鉀溶液后，將磷酸二氫鉀溶液緩慢地倒人磷酸氫二鉀溶液中，直至調(diào)整溶液的pH至7.6為止。(4)50微摩爾/升磷酸氫二鉀一磷酸二氫鉀緩沖液的配制按照(一)6.之(1)~(3)項進行，只是分別將磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀的量加大20倍即可。7.二乙胺乙基葡萄糖凝膠離子交換劑(DEAE-SephadexA-50)具有離子交換和分子篩的雙重作用。其結構多孔、疏松，非特異性吸附很少，層析流速易控制，特別適用于蛋白質、酶、激素、多核苷酸等的分離純化以及生化制劑的熱原。二乙胺乙基葡萄糖凝膠離子交換劑是一種陰離子交換劑，各地生化試劑商店均有出售。用前應預先處理，首先溶于水中(或5~10倍量洗脫劑中),最好將干膠往水里加，邊加邊攪拌，以防凝膠結塊。在室溫放置，完全水化后，再用水反復洗3~4次，同時瀝去水面上漂浮的細粉，用抽氣漏斗抽干。將抽干的膠浸泡于0.1摩爾/升的氯化氫溶液中20分鐘，濾去氯化氫溶液，用水洗至中性。再用0.1摩爾/升的氫氧化鈉溶液浸泡20分鐘，濾去氫氧化鈉溶液，用水洗至中性。最后再用0.1摩爾/升氯化鈉溶液浸泡20分鐘，濾去酸液，用水洗至中性，然后用磷酸緩沖液浸泡平衡即可使用。交換劑使用多次后吸附量降低，可按上述方法處理一遍，以保證交換劑的交換能力(二)超氧化物岐化酶的提取工藝1.超氧化物岐化酶提取的工藝流程見圖4-3。(1)分離血細胞取新鮮牛血，按100千克牛血加3.8克檸橡酸三鈉投料，攪拌均勻，裝入離心管中，在離心機中以3000轉/分的速度離心15分鐘，收集血細胞，血漿可用于制備凝血(2)提取把收集的血細胞用0.9%氯化鈉溶液洗三遍(每次用血細胞2倍體積的氯化鈉溶液),然后加入蒸餾水(和牛血等量的水),在0~4℃條件下，攪拌溶血30分鐘，再緩慢加入溶血的血細胞0.25倍體積的95%乙醇和0.15倍體積(相對于溶血的血細胞而言)的氯仿(乙醇和氯仿要事先冷卻至4℃以下),攪拌均勻，靜置20分鐘，置離心機中離心30分鐘，收集上清圖4-3超氧化物岐化酶提取流程圖(3)沉淀在上清液中加入2倍體積的冷丙酮，攪拌均勻，于冷處靜置20分鐘，離心收集沉淀。沉淀物用1~2倍體積的水溶解，在55℃水浴中保溫15分鐘，離心收集上清液。再用2倍冷丙酮使上清液沉淀，靜置過夜。然后離心收集沉淀，上清液可回收丙酮。K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，用離心法除去雜質，收集上清液準備上柱。先把二乙胺乙基葡萄糖凝膠離子交換劑裝入3厘米×40厘米的柱中(即柱長40厘米，柱內(nèi)徑3厘米),用pH為7.6,2.5微摩爾/升的K2HPO4-KH2PO4緩沖液上柱，等流出液的pH為7.6時，然后將樣品上柱，用pH7.6,2.5~50微摩爾/升的K2HPO4-KH2PO4緩沖液進行梯度洗脫(洗脫液濃度從2.5微摩爾/升開始逐漸加大至最終濃度達50微摩爾/升，這樣便形成一個洗脫梯度),收集具有超氧化物岐化酶的活性峰，將洗脫液倒入透析袋中，在蒸餾水中進行透析(透析方法是利用小分子物質在溶液中通過透析袋，而蛋白質和黏多糖等大分子不能通過透析袋的性質而達到不同大小分子分離的一種方法),然后將透析液經(jīng)過濾濃縮后，冷凍干燥即為超氧化物岐化酶產(chǎn)品。凝血酶是機體凝血系統(tǒng)中的天然成分，由兩條肽鏈組成，多肽鏈之間以二硫鍵相連接。凝血酶在體內(nèi)以凝血酶原形式存在，在一定條件下凝血酶被激活并轉化為有活性的一種蛋白質水解酶。分子量335800,白色，無定形粉末，溶于水，不溶于有機溶劑。目前國內(nèi)主要從牛血漿及人血漿中制備凝血酶原，再經(jīng)激活物激活而成為凝血酶。它可催化血纖維蛋白原中血纖維肽A和B的斷裂，轉變成不溶性血纖維蛋白凝塊。凝血酶在臨床上應用廣泛，常以干粉或溶液局部涂于傷口及手術處，控制毛細血管血液滲出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙時出血等。有時也可口服，用于胃和十二指腸出血。凝血酶局部止血效果好，且無副作用。目前凝血酶的應用范圍正日漸擴大，由單純的局部外敷發(fā)展到外科手術、耳鼻喉、口腔、婦產(chǎn)、泌尿及消化道等部位出血的止血，亦可作為多種外用止血藥物的重要原料，其止血效果優(yōu)于“對氨基苯甲廣大用戶歡迎，將廣泛應用于臨床。由于臨床使用該藥日漸廣泛，將使目前十分緊俏的凝血酶更趨緊缺。因此，生產(chǎn)前景看好，只要原料有保證，技術過關，就可獲得產(chǎn)品。1.血液需選用新鮮的牛血液，防止混入其他雜質。盛血液的器具一定要干凈。1.857,150℃時失去結晶水，溫度3.醋酸學名乙酸。無色澄清液體，有刺激氣味，相對密度1.049,沸點118℃,溶于水、乙4.氯化鈉白色立方晶體或細小結晶粉末，相對密度2.165,熔點801℃,味咸，中性，有雜質時易潮解，溶于水和甘油，難溶于乙醇。選用一級工業(yè)品。5.氯化鈣白色立方晶體，易潮解，相對密度2.15,熔點782℃,沸點大于1600℃,溶于水、乙醇。本工藝中用作激活劑，選用分析純試劑。6.丙酮無色，易揮發(fā)、易燃液體。有微香氣味，相對密度0.7893,沸點56.5℃,與水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿等混溶，能溶解油、脂肪、樹脂和橡膠。其蒸汽與空氣形成爆炸性混合物，化學性質活潑。本工藝中用作沉淀劑，選用化學純試劑。7.乙醇又稱酒精。無色、透明、易揮發(fā)、易燃的液體，有酒味和刺激辛辣滋味，相對密度0.789,沸點78.4℃,溶于水、甲醇、乙醚、氯仿等。有吸濕性，能與水形成共沸混合物。其蒸汽與空氣形成爆炸性混合物。本工藝中用來洗滌凝血酶，選用工業(yè)乙醇。8.乙醚又稱二乙醚。是易流動的無色透明液體，有令人爽快的特殊氣味，其蒸汽能使人失去知覺，甚至死亡，相對密度0.7135,沸點34.5℃,難溶于水，易溶于乙醇和氯仿等溶劑，極易揮發(fā)和著火，與空氣組成的混合物極易爆炸。常用作溶劑和麻醉劑。本工藝主要用于洗滌凝血酶，選用化學純試劑。使用時，操作人員應注意防護，避免吸入，周圍應杜絕明火并保持空9.草酸鉀又名乙二酸鉀。這里用于測定凝血酶活性，選用分析純試劑。10.標準纖維蛋白原這里用于測定凝血酶效價，選購藥檢部門提供的標準品。(二)凝血酶的提取工藝1.分離血漿，提取凝血酶原取牛血液，按每千克血液加3.8克檸檬酸三鈉投料，攪拌均勻，裝入離心管中，以3000轉/分的速度離心15分鐘，分出血細胞(可供制備血紅素),收集血漿。把血漿溶于10倍的蒸餾水中，用1%濃度的醋酸調(diào)節(jié)pH至5.3,在離心機上離心15分鐘，2.凝血酶原的激活在30℃條件下，將凝血酶原溶于1~2倍的0.9%氯化鈉溶液中，攪拌均勻，加入占凝血酶原重量1.5%的氯化鈣，攪拌15分鐘，在4℃下放置1.5小時左右，保證凝3.淀淀分離凝血酶將激活的凝血酶溶液用離心機離心15分鐘，棄去沉淀。上清液移入塘瓷桶中，加入等量的預冷至4℃的丙酮，攪拌均勻，在冷處靜置過夜，然后用離心機分離，收集沉淀，上清液可供回收丙酮。沉淀用丙酮洗滌并研細，在冷處靜置3天左右，然后過濾，沉淀分別用乙醇和乙醚洗滌一次，放置在干燥器或石灰缸中干燥，即得凝血酶粗品。4.除雜，沉淀，干燥把粗品溶于適量(1倍左右)的0.9%氯化鈉溶液中，在0℃放置6小時以上，然后用濾紙過濾，濾出的沉淀再用0.9%氯化鈉溶液溶解，在0℃放置6小時以上，過濾，合并2次濾液，用1%醋酸溶液調(diào)節(jié)pH為5.5。然后離心，棄去沉淀，收集上層清液。在清液中加入2倍量預冷至4℃的丙酮，靜置3小時，離心30分鐘，收集沉淀。沉淀再浸泡于冷丙酮中，靜置過夜，然后過濾，沉淀分別用無水乙醇、乙醚各洗滌一次，干燥即得產(chǎn)品。(三)凝血酶效價測定1.標準纖維蛋白測定法凝血酶的單位定義為活度量，即1毫升標準纖維蛋白原溶液在28℃、15秒鐘內(nèi)產(chǎn)生凝集的量為一個單位。具體做法，將凝血酶樣品配成適當濃度，取0.2毫升加入0.8毫升0.125%纖維蛋白原溶液，于28℃測定其凝結時間(先將凝血酶配成一定濃度，測得的凝結時間去除15,再乘以溶液濃度),得到每毫克樣品所含單位的估算值。再按估算值配成0.2毫升含1個單位的凝血酶溶液，取0.2毫升加入0.8毫升0.125%纖維蛋白原溶液中，凝結時間為15秒。2.草酸鹽牛血清測定法即1毫升草酸鹽牛血清在28℃、15秒鐘內(nèi)產(chǎn)生凝集，則含凝血酶2.25單位。具體做法，1份牛血清與1份等滲草酸鉀溶液(1.85%)混合，離心分離得草酸鹽牛血清(-40℃只能保存2個星期)。取幾只試管，各加0.9毫升草酸鹽牛血清，依次加入不同稀釋度的凝血酶樣品溶液0.1毫升，通過反復試驗，確定適宜的稀釋度，使之在15秒鐘內(nèi)產(chǎn)生凝集。同前面的定義一樣，在15秒鐘出現(xiàn)凝集的試管含2.25單位凝血酶。估量稀釋度后，很快就可確定凝血酶原液的滴定度及每毫升或每毫克凝血酶的單位。國外已有報道以牛血漿為原料制備凝血酶，原有的凝血酶制備方法，獲得的凝血酶效價最高約每毫克干重950單位，即每毫克氮約6600單位。沃爾特等報道，經(jīng)過改進的凝血酶制備方法，其分離獲得效價為每毫克氮約12000單位的凝血酶組分。并由溶解度曲線表明制劑含有兩個明顯不同溶解度的活性組分，它們的效價分別是每毫克氮10086單位及13365單位，從而推斷凝血酶有兩個活性組分，即存在兩個天然凝血酶分子。采用一般方法制備的凝血酶，通常為灰白色粉末，將其溶于生理鹽水中，通常得到的是半透明膠狀懸濁液。這是因為含有雜質的緣故。若制備過程中采取了透析及硫酸銨進行分級分離等步驟處理，凝血酶的純度將大大提高。其精品色雪白，極易溶于水，水溶液澄清透明，醫(yī)療價值更高。因此，根據(jù)需要，可制備凝血目前國際上僅有英、美、日等少數(shù)發(fā)達國家能在低溫狀態(tài)下，從人或牛血液中人工提取凝血酶，但因受其生產(chǎn)環(huán)境、血源等因素制約，其產(chǎn)量很小，遠遠滿足不了市場需要，其產(chǎn)品主要用于生化制藥產(chǎn)品的鑒定，很少直接用于臨床，因其價格十分昂貴，很難被用戶接受。當前我國凝血酶產(chǎn)品已應用于臨床，但由于技術原因、原料分散等因素的制約，故產(chǎn)量也比較小，遠遠滿足不了國內(nèi)臨床的需求。隨著凝血酶應用的不斷推廣，用量迅速擴大。加之世界一些地區(qū)戰(zhàn)亂，傷病人員增加，對高效局部止血藥的需求量更難以估計，產(chǎn)供矛盾也將更為突出，市場價格有增無減，國內(nèi)外市場前景相當廣闊。凝血酶是以凝血酶原的形式存在于人或牛血液中，而我國人口眾多，屬于食肉大國，其牛血源均白白流失，成為污染環(huán)境的一大公害。提取凝血酶既可變廢為寶，為國家創(chuàng)匯，又可解決環(huán)境污染問題，所以生產(chǎn)前景是樂觀的。血紅素是由原葉啉與一個二價鐵原子構成的稱為鐵葉啉的化合物，具有很高的實用價值。在食品行業(yè)中，血紅素可代替肉制品中的發(fā)色劑亞硝酸鹽及人工合成色素。它可使肉制品產(chǎn)生一種誘人的鮮艷紅色，增加其外觀美感。如在西式方腿和紅腸制品中添加血紅素，其制品切面色澤均勻，鮮艷美觀，保持肌肉固有的天然色彩，組織結構細密無空泡，口感韌性強，味道純正，同時增加了營養(yǎng)價值。更重要的是使用血紅素可減少亞硝酸鹽的致癌作用。在制藥行業(yè)中，血紅素可作為半合成膽紅素原料，而且是制備抗癌的特效藥。另外，血紅素在臨床具備為補鐵劑，可治療因缺鐵引起的貧血癥(在兒童、婦女中較為常見)。目前臨床上用的非血紅素補鐵劑，主要從植物性食物中提取，以氫氧化鐵絡合物形式存在。這種鐵絡合物在人體中吸收率很低，并含有對人體有害的成分。而血紅素補鐵劑(即亞鐵血紅素)可直接被人體吸收，吸收率高達10%~20%。我國民間早有吃血治療貧血的經(jīng)驗，但原血有異味，易腐敗變質，難以作為補鐵劑用于臨床。從血中提取血紅素，可解決這一問題。血紅素補鐵劑將取代目前常用的補從牛血中提取血紅素及血紅素補鐵劑，目前在國內(nèi)外廣泛引起人們的關注。牛血來源豐富。但不少地區(qū)，因原料分散，部分除食用外，都作廢物棄去。因此，開發(fā)利用牛血具有很重要的經(jīng)濟價值。以往提取血紅素一般用冰醋酸加熱法，此法工藝流程長，效率低，成本高。從實踐中人們總結出四種比較適用的方法，這些方法都是基于以下原理進行的。血液中的血紅蛋白是由4分子亞鐵血紅素和1分子珠蛋白結合而成的。在pH小于3時，亞根據(jù)此性質，提取時先從血液中分離出血細胞液，然后加水將血細胞液溶解(即溶血),調(diào)節(jié)pH至3左右，加入適量丙酮，可使蛋白質凝固，亞鐵血紅素則溶于丙酮液中。此時若加入醋酸鈉和揉酸，即可使血紅素沉淀析出。如加入羧甲基纖維素(CM-C)陽離子交換劑，血紅素可被羧甲基纖維素吸附，然后過濾，就可以分離出血紅素。(一)原料及試齊2、醋酸鈉無色、透明結晶或白色顆粒，相對密度1.45,熔點58℃,溶于水，稍溶于乙醇，其水溶液呈弱堿性反應。在干燥空氣中風化，120℃時失去結晶水，溫度再高即分解。這里3.檸檬酸三鈉這里用作抗凝劑，選用化學純試劑。8.氫氧化鈉又名燒堿、火堿、苛性堿。純品是白色、透明的晶體，相對密度2.130,熔點318.4℃。工業(yè)品中含少量的氯化鈉和碳酸鈉，是白色不透明的固體，有片狀、塊狀、粒狀和棒狀等。吸濕性很強，易溶于水，同時強烈放熱。它是一種強堿，對皮膚、織物、紙張等有強腐蝕性。這里選用一級工業(yè)品。配制溶液過程中，需使用耐堿腐蝕的容器，例如玻璃、陶瓷、塑料類容器，不可使用鐵容器。操作人員需戴防護手套，濺于皮膚或衣物上時應及時用水沖洗。9.鹽酸氯化氫的水溶液，純品無色，工業(yè)品因含有雜質而呈黃色，濃度在36%左右，相對密度1.19,在空氣中發(fā)煙，有刺激臭味。它是一種強酸，對皮膚、織物、紙張等有腐蝕性。這里用作pH調(diào)節(jié)劑，可選用工業(yè)品。稀釋時所用容器及操作時的注意事項，同氫氧化鈉。氣味，有收斂性。見光或露置空氣中，色漸變黑。溶于水、醇和丙酮，難溶于苯、醚和三氯甲烷。與蛋白質、淀粉、明膠、多種生物堿和金屬鹽類能生成不溶性的沉淀；遇鐵鹽則生成藍黑色沉淀。應避光密封保存。這里用作吸附劑，選用化學純試劑。11.吡啶(CsHsN)又稱氮(雜)苯。無色或微黃色液體，有特殊的臭味，相對密度為0.9780,沸點115.56℃,溶于水、乙醇、乙醚、苯、石油醚和動植物油。是許多有機化合物的優(yōu)良溶劑，并能溶解許多無機鹽。有顯著的但不是很強的堿性。可燃燒，其蒸汽與空氣形成爆炸13.氨水分子式為NH3.H2O,它是氣體氨的水溶液，有強烈的刺激氣味，相對密度小于1,含氨越多，相對密度越小。一般工業(yè)品含量在20%~28%,主要用作液體肥料，也是一種重要的試劑，這里用作溶劑，選用分析純試劑。(二)醋酸鈉法提取1.工藝流程見圖4-4。圖4-4醋酸鈉法提取流程圖(1)分離血細胞、溶血將新鮮牛血移入塘瓷桶中，加入0.8%檸檬酸三鈉(每100千克牛血加0.8千克),攪拌均勻，裝入離心管中，以3000轉/分的速度離心15分鐘，棄去清液(可供提取凝血酶用),收集血細胞，加入等量蒸餾水，攪拌30分鐘，使血細胞溶血。然后加5倍量(2)抽提在濾液中加4~5倍體積的丙酮溶液(其中含丙酮體積3%的鹽酸),用1摩爾/升鹽酸校正pH為2~3,攪拌抽提10分鐘左右，然后過濾，濾渣干燥得蛋白粉，收集濾液備用。(3)沉淀將濾液移入另一塘瓷桶中，用1摩爾/升氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為4~6,然后加濾液量1%的醋酸鈉，攪拌均勻，靜置一定時間，血紅素即以無定形黑綠色沉淀析出，抽濾(或過濾)(4)干燥把血紅素沉淀用布袋吊干，置于石灰缸中干燥1~2天，即得產(chǎn)品(也可用干燥器干燥)。(三)蒸餾法提取1.工藝流程見圖4-5。圖4-5蒸餾法提取流程圖(1)分離血細胞將新鮮牛血放入塘瓷桶中，每100千克牛血加0.8千克檸檬酸三鈉，攪拌均勻，裝入離心管中，以3000轉/分的速度離心15分鐘，棄去上清液，收集血細胞。加入等體積的蒸餾水，攪拌30分鐘，使血細胞溶血，再加5倍體積的氯仿，濾去纖維，收集濾液。(2)抽提把上述經(jīng)除去纖維的血細胞移入另一塘瓷桶中，加4~5倍體積的丙酮溶液(其中含丙酮體積3%的鹽酸),用1摩爾/升鹽酸校正pH至2~3,攪拌抽提10分鐘，然后過濾，收集濾(3)蒸餾將上述溶液裝入蒸餾瓶中(裝瓶體積為2/3),于水浴上蒸餾回收丙酮(溫度控制在60℃左右),待濾液濃縮至干時，即有沉淀析出。倒入抽濾漏斗中過濾，收集沉淀。(4)干燥把沉淀抽干后，置于石灰缸中1~2天即得產(chǎn)品。產(chǎn)品為無定形黑綠色粉末狀物，(四)鞭酸法提取1.工藝流程見圖4-6。圖4-6鞭酸法提取流程圖(1)分離血細胞將新鮮牛血放入塘瓷桶中，加0.8%檸檬酸三鈉，攪拌均勻，裝入離心管中，以3000轉/分的速度離心10分鐘，棄去血漿，收集血細胞。加入等量蒸餾水，在0~4℃條件下攪拌30分鐘，使血細胞溶血，然后加入1:5氯仿(即1份溶血液加入5份氯仿),過濾收集濾液(含血細胞)備用。(2)提取將血細胞濾液移入另一容器中，加4~5倍體積含3%鹽酸的丙酮溶液，充分攪拌，攪拌抽提10分鐘以上，過濾，收集提取液，濾渣經(jīng)干燥得蛋白粉。(3)沉淀在提取液中加5%鞭酸，攪勻靜置過夜，血紅素呈針狀結晶析出，離心分出血紅素沉淀物，用蒸餾水沖洗3~4次，至洗出液變清，然后用布袋吊干。(4)干燥把干沉淀包好放入石灰缸中，干燥1~2天，即得血紅素成品，裝瓶保存。(五)羧甲基纖維素(CM-C)法提取1.工藝流程見圖4-7。圖4-7羧甲基纖維素(CM-C)法提取流程圖(1)分離血細胞將新鮮牛血移入塘瓷桶中，加入0.8%檸檬酸三鈉，攪勻后在離心機上以3000轉/分的速度離心15分鐘，分出血細胞，棄去血漿。(2)提取將血細胞移入另一塘瓷桶中，加3倍左右蒸餾水，攪拌30分鐘溶血，用1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)pH至2~3,按血細胞液體積1:10或1:15的比例，加入羧甲基纖維素懸浮液，攪勻，靜置3~4小時后在離心機上分出清液。(3)沉淀將分出的清液，用2摩爾/升氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5.5左右，靜置沉淀分層，然后(4)干燥把沉淀物壓干，置于60~70℃真空干燥，干燥后研磨，過0.177孔徑篩，即得(六)冰醋酸法提取(1)提取先將牛血4倍體積的冰醋酸放入密閉的提取缸中，然后加大量新鮮牛血，加熱至90℃,攪拌下恒溫30分鐘，然后室溫靜置過夜。(2)沉淀洗滌干燥，室溫靜置過夜后，缸中即有亮晶晶的沉淀物析出，然后濾出沉淀，沉淀分別用50%醋酸溶液、蒸餾水、乙醇、乙醚洗滌，即得粗品血紅素。(七)血紅素精制1.工藝流程見圖4-8。(1)提取先將血紅素4倍量的吡啶，7倍量的氯仿倒入瓶中，然后加入粗品血紅素，充分振蕩30分鐘，過濾后收集濾液。圖4-8血紅素精制流程圖(2)沉淀先把適量冰醋酸加熱至沸騰后，加入各占1/7體積(相對干冰醋酸而言)的飽和氯化鈉溶液和鹽酸，隨著加入濾液，攪勻后過濾，濾渣用氯仿洗滌，合并兩次濾液，靜置過(八)血紅