國家自然科學(xué)基金完整的標(biāo)書范文

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20**年國家自然科學(xué)基金面上項目題目：研究真核起始因子X-Y軸調(diào)控糖基轉(zhuǎn)移酶對腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用機制摘要：大腸癌手術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中，肝、肺轉(zhuǎn)移是最常見的轉(zhuǎn)移模式，但其機制一直未能闡明。在前期研究中，我們建立了大腸癌遠處轉(zhuǎn)移的特征分子譜式，發(fā)現(xiàn)真核起始因子Z家族的成員X和Y在肝轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。X-Y軸能夠介導(dǎo)大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，X可促進細胞獲得運動能力，并在轉(zhuǎn)移灶中通過Y的相互作用促進細胞異常增殖。進一步實驗表明，X能調(diào)節(jié)下游糖基轉(zhuǎn)移酶，可能激活腸癌細胞膜表面半乳糖殘基，從而通過與肝細胞膜上特異性受體相互作用而使腸癌細胞“定居”于肝臟。可見，X-Y調(diào)節(jié)軸對于大腸癌肝轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。本項目擬在此基礎(chǔ)上，從大樣本回顧性分析中總結(jié)X-Y對于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的臨床相關(guān)性和預(yù)后判斷價值。同時，在細胞和動物模型中進一步深入探討其在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移調(diào)控中的作用方式和調(diào)控分子機制，解析下游效應(yīng)途徑及靶點。一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）：一、立項依據(jù)大腸癌是一種發(fā)生在結(jié)腸或直腸中的癌癥，是最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病人約八百萬，占所有惡性腫瘤的10%-15%，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的第三位。隨著手術(shù)、化療、放療水平的提高，大腸癌患者的生存率有了較大的提高，但遠處轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的最主要因素。在美國大腸癌中有90%的死亡由腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移所致。因此，通過研究大腸癌轉(zhuǎn)移機制，正確認識大腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移模式，制定合理的術(shù)后隨訪方案，采取有針對性的干預(yù)措施，提高生存率至關(guān)重要。我們的研究關(guān)注于肝轉(zhuǎn)移中的特異分子標(biāo)志，其中兩個成員屬于真核起始因子Z家族：X和Y。Z真核起始因子在真核生物翻譯起始過程中起著重要作用，但其在腫瘤中的作用尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)Y基因在大腸癌細胞中高表達，其表達被干擾后，細胞增殖能力顯著抑制，細胞凋亡比例提高?？紤]到X與Y之間存在相互結(jié)合，我們進一步觀察了兩者之間的交互作用。有意思的是，X對于Y的促惡性增殖功能是必需的，表現(xiàn)在沉默X表達之后，過表達Y對大腸癌細胞的增殖調(diào)控失活。我們提出科學(xué)假設(shè)：真核起始因子X-Y軸能夠調(diào)控大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，X可介導(dǎo)細胞獲得運動能力，并且在轉(zhuǎn)移灶中調(diào)節(jié)Y發(fā)揮促進腫瘤細胞繼發(fā)性增殖的作用，具體作用機制有待闡明。在哺乳動物中，Z因子的亞基有8種，按分子量從大到小排列而命名。Z因子參與真核細胞翻譯過程，而調(diào)節(jié)蛋白合成在維持細胞生長控制中起重要作用。Z因子不僅能通過促進mRNA與40s亞基結(jié)合，而且還可以獨自與游離的40s亞基結(jié)合，影響40s亞基與60s亞基及其他亞基蛋白的結(jié)合或解離。Z家族成員一般含有PCI和MPN結(jié)構(gòu)域，這兩類結(jié)構(gòu)域都參與蛋白-蛋白相互作用，部分還具有RNA識別結(jié)構(gòu)域，可能參與RNA的結(jié)合。除此之外，Z因子還被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控細胞周期的作用。通過調(diào)節(jié)不同類型的mRNA的翻譯起始，Z因子就可以選擇性地調(diào)控蛋白的合成，從而對腫瘤細胞的生長的轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為進行調(diào)控。Z家族中部分成員已證實在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，已報道的包括：A、B、C、D等。Y的致癌作用由申請人首先報道，隨后其在膠質(zhì)瘤和呼吸系統(tǒng)腫瘤中的作用也被其他研究者發(fā)現(xiàn)。而關(guān)于X與惡性腫瘤的關(guān)系目前還未見文獻報道，可見在針對X、Y兩個分子尤其是交互作用方面，申請人尚居于領(lǐng)先的研究地位。早期的研究表明，X在包含Y蛋白的復(fù)合物與40S核糖體亞基結(jié)合的過程中扮演著關(guān)鍵的鏈接作用。缺失X時，兩者的結(jié)合不穩(wěn)定，并會降低翻譯起始系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力。最近的研究表明，W可以與X競爭性地結(jié)合Y，形成不同的Z復(fù)合物。這些Z復(fù)合物可以招募tRNA或mRNA，從而調(diào)節(jié)下游基因表達，進而影響腫瘤細胞的生長、遷移等生物學(xué)過程。在最近的研究中，我們進一步深入探討了X的調(diào)控機制。我們發(fā)現(xiàn)，在敲減X后，腸癌細胞中多個關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點發(fā)生了改變，其中包括3個半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（β1,3-GalT;β1,4-GalT-1;β1,4-GalT-7）的表達降低。糖基化是一種常見的蛋白翻譯后修飾，參與細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、侵襲、免疫應(yīng)答等多種生命活動。糖基化紊亂可以導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化，而糖基轉(zhuǎn)移酶的表達和活性與包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的惡性化程度相關(guān)。之前的研究表明，β1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1可以通過調(diào)節(jié)EGFR影響肝癌細胞的生長和凋亡，而β1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶3可以通過調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白信號通路影響神經(jīng)細胞瘤的侵襲能力。此外，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的激活可以使細胞膜上蛋白糖基化程度增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，X的調(diào)控機制可能通過影響半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達和活性，從而影響腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。試建立預(yù)測模型，評估其臨床預(yù)后價值。2)利用腸癌細胞株和動物模型，探究X-Y調(diào)節(jié)軸在腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用機制，重點研究X對半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)作用及其與肝細胞表面特異性受體ASGPR的相互作用，進一步明確X-Y調(diào)節(jié)軸的信號通路和作用靶點。2、研究目標(biāo)1)明確X-Y調(diào)節(jié)軸在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用機制，揭示其內(nèi)在調(diào)節(jié)機理，為腸癌預(yù)后的判斷和治療提供新的理論依據(jù)。2)建立X-Y表達水平與腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測模型，為臨床預(yù)后評估提供參考。3)探究X對半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)作用及其與ASGPR的相互作用，為開發(fā)新的肝轉(zhuǎn)移靶點提供思路。3、擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題1)X-Y調(diào)節(jié)軸在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用機制是什么？其內(nèi)在調(diào)節(jié)機理是什么？2)X-Y表達水平與腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測模型的準(zhǔn)確性如何？是否可以在臨床應(yīng)用中發(fā)揮作用？3)X對半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)作用及其與ASGPR的相互作用機制如何？是否可以作為新的肝轉(zhuǎn)移靶點？本研究旨在建立基于X、Y表達的分子預(yù)測模型，并評價其在臨床上的適用價值。為此，我們將在腸癌細胞株中過表達和沉默X、Y基因，觀察細胞功能變化，并進一步應(yīng)用裸鼠成瘤和肝轉(zhuǎn)移動物模型進行驗證，以觀察X、Y對于腸癌惡性增殖和轉(zhuǎn)移發(fā)生的影響。通過細胞、動物和組織水平的研究數(shù)據(jù)，我們將闡明X、Y在腸癌發(fā)生和進展中的功能作用。在研究過程中，我們將重點闡明X與糖基轉(zhuǎn)移酶之間的調(diào)控關(guān)系和作用靶點，X與細胞運動性信號通路靶分子的調(diào)節(jié)關(guān)系，Y復(fù)合物調(diào)節(jié)的信號通路與效應(yīng)分子，以及X與Y相互結(jié)合的序列位點和精細調(diào)控。通過這些分析結(jié)果，我們將進一步探討X調(diào)節(jié)大腸癌肝轉(zhuǎn)移模式的具體作用機制。本研究的第一個關(guān)鍵科學(xué)問題是X和Y在大腸癌肝轉(zhuǎn)移中的臨床意義。我們將通過大樣本組織中檢測這兩個分子的表達，并利用病理和隨訪數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以獲得多因素條件下這兩個靶標(biāo)的臨床價值。為此，我們將建立規(guī)范化的組織樣本庫，并積累隨訪數(shù)據(jù)，運用統(tǒng)計方法進行分析。在方法學(xué)上，我們將采用商業(yè)化抗體進行檢測，不存在困難。通過本研究，我們將深入探討X-Y軸在調(diào)控大腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用機制，為腸癌的治療和預(yù)防提供新的思路和方法。本課題的第二個關(guān)鍵問題是X-Y軸在大腸癌肝轉(zhuǎn)移中的調(diào)控分子機制。我們需要闡明Y介導(dǎo)的遷移功能及糖基轉(zhuǎn)移酶信號途徑的效應(yīng)分子和作用方式，并確認Y與X結(jié)合的精細調(diào)控及促進腫瘤細胞增殖的分子機制。這方面的工作依賴于扎實的前期工作。首先，我們已經(jīng)得到了Y和X沉默后功能表型的結(jié)果。即Y可調(diào)控細胞增殖，而X能夠調(diào)節(jié)細胞遷移，并影響Y對腫瘤的促增殖作用。在此基礎(chǔ)上，我們將有的放矢地進行機制研究。其次，我們已篩查和驗證到X可通過調(diào)節(jié)兩個糖基轉(zhuǎn)移酶對腸癌細胞肝臟種植起到調(diào)節(jié)作用。在本課題中，我們需要深入研究的是揭示X如何調(diào)節(jié)細胞遷移功能，其下游調(diào)節(jié)糖基轉(zhuǎn)移酶是否與肝臟特異性的轉(zhuǎn)移相關(guān)，以及它們具體的作用機制是怎樣的。在邏輯清晰的機制通路假設(shè)中，我們只需逐條驗證，即可真正揭開X作用通路的神秘面紗。最后，Y和X之間的cross-talk有創(chuàng)新性且立足于前期研究的數(shù)據(jù)支持。只需將X-Y復(fù)合物調(diào)節(jié)的位點和下游與細胞增殖功能相關(guān)的機制闡釋清楚，即可形成完成的研究故事?？紤]到腫瘤細胞增殖機制方面報道眾多，可參考模式豐富，這方面的研究也不會有太大的科學(xué)風(fēng)險。三、擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析1.技術(shù)路線我們將采用基因芯片鑒定X、Y在腸癌肝轉(zhuǎn)移組織中特異性高表達。然后，我們將使用Y基因RNAi慢病毒感染和X基因RNAi慢病毒感染來降低它們的表達。我們已經(jīng)得到了Y沉默后SW1116細胞增殖能力顯著降低的結(jié)果。而X沉默后SW1116細胞增殖被抑制，遷移能力顯著降低。我們還將使用X基因過表達慢病毒感染和Y基因過表達慢病毒感染來提高它們的表達。我們已經(jīng)得到了Y沉默后，過表達X，SW1116細胞增殖有稍許增強的結(jié)果。而X沉默后，過表達Y對SW1116細胞增殖、遷移無顯著影響。我們認為X-Y軸可能調(diào)控大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此，我們將使用裸鼠移植瘤模型來驗證這個假設(shè)。我們還將使用基因芯片篩選X沉默后下游分子變化。我們認為半乳糖基轉(zhuǎn)移酶可能是X調(diào)節(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移模式的關(guān)鍵。因此，我們將使用裸鼠腸癌肝轉(zhuǎn)移模型來驗證這個假設(shè)。我們將使用qPCR、WB驗證X對半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控。我們還將使用EMSA/Co-IP實驗來驗證X-Y的RNA/蛋白相互作用。我們將對X的序列進行分段，分別構(gòu)建載體，用Co-IP的方法檢測與Y結(jié)合的區(qū)域。我們還將對目標(biāo)序列區(qū)域進行分析，設(shè)計點突變，驗證XY結(jié)合的位點。我們將收集500例腸癌組織和肝轉(zhuǎn)移組織樣本。然后，我們將使用免疫組化檢測X、Y蛋白表達和定位。最后，我們將根據(jù)臨床的病理資料/預(yù)后和隨訪資料分析X、Y表達對腸癌預(yù)后的臨床意義，以及對腸癌細胞體內(nèi)成瘤能力的影響。InvivonoftheX-YaxisintheXXXbeta-1,4-galactosyltransferase.2.ResearchMethods2.1XXXofXandYintheXXX.1)Retrospectivelycollectedclinicalspecimensof500casesofcoloncancer。includingsurgicalresectedcoloncancertissues。matchedlivermetastases。andXXX200cases。andparaffinblockswerepreparedfor300cases。Allcaseswerediagnosedclinically。graphically。XXX。andnopreoperativeadjuvanttreatmentwasperformed。ThecaseswereXXXeen2008and2013.andfollow-updatawerecomplete.2)XXXissuens。withnegative。tumor。andXXX.3)SPSS16.0arewasusedtoXXXanalysisonthenandnofXandYandclinicalXXXXandYXXXusclinicalfactors。XandYn。coloncancerlivermetastasis。XXX。andprognosis.2.2XXXoftheXandYgenesinXXX.1)PreparedX-XXXX-silencedcelllines。withXXXwereusedtoobservethegrowthcurveofcellsafterXsilencing。andcloneXXX。Atthesametime。alentivirusvectoroverexpressingXwasprepared.2)InstableX-silencedcoloncancercells。XXX。instableY-silencedcoloncancercells。alentivirusvectoroverexpressingXwasXXX.3)XXXtheeffectofYandXontheinvivoXXXXXXgroupsincludedblankcontrols。Y-silencedgroups。X-silencedgroups。X-silencedgroupswithYn。andY-XXX.計合適的引物，制備X和Y的蛋白質(zhì)表達并純化，然后進行電泳遷移實驗，觀察X和Y之間的結(jié)合情況。通過改變反應(yīng)條件，如添加競爭性DNA或反應(yīng)體系中添加不同濃度的鹽，進一步驗證X和Y之間的相互作用關(guān)系。建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型，觀察肝臟中的轉(zhuǎn)移灶，統(tǒng)計分析Y和X對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移能力的影響，明確Y和X在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移過程中的作用。實驗分為空白對照、Y沉默組、X沉默組、X沉默組+Y過表達組、Y沉默組+X過表達組。利用qRT-PCR和免疫組化方法檢測Y/X以及下游半乳糖苷酶的mRNA和蛋白的表達，制備部分腫瘤組織成冰凍切片，利用FITC和TRITC雙標(biāo)記免疫熒光染色，使用激光共聚焦顯微鏡觀察X與Y的共定位情況。通過基因芯片Microarray分析X過表達/沉默后基因表達譜變化情況，對原始數(shù)據(jù)進行歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化，差異表達分析，明確X消減后表達發(fā)生改變的下游調(diào)控分子，芯片結(jié)果中有顯著差異的潛在作用分子，設(shè)計引物，通過qRT-PCR進行二次表達驗證。ork、orks、ork重建，解析X調(diào)控結(jié)腸癌細胞運動能力的信號通路網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建X為核心的信號分子網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)X基因沉默后影響的信號通路結(jié)果（半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及其上游調(diào)節(jié)信號通路），利用信號通路抑制劑處理X穩(wěn)定過表達/沉默后結(jié)腸癌細胞和對照細胞，檢測不同分子信號對X表達及功能的作用，驗證阻斷這些信號通路后對X在結(jié)腸癌中的功能表型的影響。采用信號通路高通量檢測蛋白芯片，根據(jù)以上實驗分析的通路情況，訂購相應(yīng)通路的PathwayArray試劑盒，檢測X基因表達變化后的特定通路關(guān)鍵蛋白的變化。分別構(gòu)建X、Y的真核表達載體，共轉(zhuǎn)293T，通過免疫共沉淀（Co-IP）驗證XY的相互結(jié)合作用。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)模擬X與Y的結(jié)合位點，制備不同氨基酸的突變體，采用RNAi方法敲減互作蛋白表達，接著轉(zhuǎn)入互作蛋白的突變體，檢測細胞功能表型變化。通過免疫共沉淀（Co-IP）驗證X與Y之間的結(jié)合位點特異性。進行EMSA實驗驗證X與Y之間的相互作用關(guān)系，設(shè)計合適的引物，制備X和Y的蛋白質(zhì)表達并純化，然后進行電泳遷移實驗，觀察X和Y之間的結(jié)合情況。本研究旨在研究X作為Y調(diào)節(jié)蛋白對下游RNA進行調(diào)控的精細機制。為了確保研究目標(biāo)的可行性，我們進行了大量的預(yù)實驗，并且已經(jīng)證實了Y可以調(diào)節(jié)結(jié)腸癌的惡性增殖。本項目是對前期研究工作的進一步補充和完善，具有較好的可行性。我們的課題組成員長期從事結(jié)直腸癌的診治和發(fā)生發(fā)展機制研究，具有豐富的經(jīng)驗和扎實的研究基礎(chǔ)。我們使用的實驗技術(shù)也都是我們之前已經(jīng)涉及過的，所需的主要儀器設(shè)備也已經(jīng)具備。此外，我們的課題組成員大部分為中青年業(yè)務(wù)骨干，每個人均有自己的研究專長，能保障本