常用的生化反應(yīng)課件

實(shí)驗(yàn)四常用的生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼J(rèn)識(shí)染色方法鑒別細(xì)菌的局限性掌握幾種常用生化反應(yīng)的原理、方法和結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)菌種產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacterarogenes）大腸埃希菌（Escherichiacoli）普通變形桿菌（Proteusvulgaris）銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）糖發(fā)酵試驗(yàn)

細(xì)菌對(duì)各種糖的分解能力及代謝產(chǎn)物不同，可借以鑒別細(xì)菌。一般非致病菌能發(fā)酵多種單糖，如大腸埃希菌能分解葡萄糖和乳糖，產(chǎn)生甲酸等產(chǎn)物，并有甲酸脫氫酶，可將其分解為CO2和H2，故生化反應(yīng)結(jié)果為產(chǎn)酸產(chǎn)氣，以“⊕”表示。傷寒沙門菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，但無甲酸脫氫酶，故生化結(jié)果為產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，以“+”表示。傷寒沙門菌不能分解乳糖，以“-”表示。

O-F試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)菌種接種到2支O-F管中在其中1支管中加入無菌液體石蠟，厚度0.5cm左右。35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。結(jié)果開口管加石蠟管結(jié)果黃色黃色發(fā)酵型（F）黃色綠色氧化型（O）綠色藍(lán)色產(chǎn)堿型VP試驗(yàn)

產(chǎn)氣腸桿菌能使丙酮酸脫羧生成中性的乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇被氧化（在堿性溶液中）生成二乙酰，后者可與含胍基的化合物反應(yīng)生成紅色化合物，稱VP試驗(yàn)陽性。大腸埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，VP陰性。

VP甲液：5%α－萘酚

VP乙液：40%KOH甲基紅試驗(yàn)

產(chǎn)氣腸桿菌使丙酮酸脫羧后形成中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液pH＞5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，為甲基紅試驗(yàn)陰性，大腸埃希菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，培養(yǎng)液呈酸性pH＜5.4，指示劑甲基紅呈紅色，稱甲基紅試驗(yàn)陽性。枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)

能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源的細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鹽，同時(shí)分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，由此使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使指示劑溴麝香草酚藍(lán)（BTB）由淡綠轉(zhuǎn)為深藍(lán)，此為枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陽性。硫化氫試驗(yàn)

變形桿菌、乙型副傷寒沙門菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氫。在有醋酸鉛或硫酸亞鐵存在時(shí)，則生成黑色硫化鉛或硫化亞鐵，可借以鑒別細(xì)菌。尿素分解試驗(yàn)

變形桿菌具有尿素酶，可分解尿素產(chǎn)生氨，培養(yǎng)基呈堿性，以酚紅為指示劑檢測(cè)呈紅色。

陽性陰性

尿素酶試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)原理：硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個(gè)過程：一是在合成過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其他含氮化合物；二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。能使硝酸鹽還原的細(xì)菌從硝酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其他還原性產(chǎn)物。硝酸鹽還原的過程因細(xì)菌不同而異:有的細(xì)菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌；有的細(xì)菌則可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細(xì)菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如假單胞菌等。硝酸鹽還原試驗(yàn)系測(cè)定還原過程中所產(chǎn)生的亞硝酸。過氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn))原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。試劑：3％過氧化氫溶液。方法：取待測(cè)菌涂在玻片上，然后加3％過氧化氫數(shù)滴立即觀察結(jié)果。結(jié)果：有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性。不產(chǎn)生氣泡者為陰性。氧化酶試驗(yàn)克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）

葡萄糖∶乳糖＝1∶10鐵：枸櫞酸鐵銨指示劑：酚紅我們?nèi)藶榈陌迅邔哟砥咸烟?，斜面代表乳糖。葡（－）葡（＋）葡（＋）葡（＋）乳（－）乳（＋）乳（－）H2S（＋）乳（－）

克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）原理

以葡萄糖＋，乳糖－為例

葡萄糖是最早利用的單糖，發(fā)酵葡萄糖的中間產(chǎn)物丙酮酸為酸性，酚紅指示劑為黃色。斜面

1、斜面生長(zhǎng)的菌量多，面積大，跟氧分子接觸的面積也大

氧化

丙酮酸CO2＋H2O中性，PH不變

2、斜面蛋白質(zhì)被細(xì)菌利用，氨基酸被利用產(chǎn)生NH3，堿性，酚紅指示劑為紅色。高層

高層中丙酮酸濃度高，跟氧分子接觸少，在24小時(shí)內(nèi)不會(huì)被氧化，因此仍為黃色。結(jié)果高層－黃色斜面－紅色如葡萄糖＋，乳糖＋，則高層與斜面均為黃色（24小時(shí)內(nèi)）。如果延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，高層中的丙酮酸也會(huì)進(jìn)一步氧化，同時(shí)細(xì)菌利用蛋白質(zhì)后產(chǎn)堿性物質(zhì)越來越多，則高層也會(huì)變?yōu)榧t色。有些細(xì)菌能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氫

H2S＋Fe黑色的硫化亞鐵問：有無葡萄糖－，乳糖＋的情況？為什么？MIU試驗(yàn)思考題：KIA的試驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、用革蘭染色法觀察四種試驗(yàn)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征2、將四種試驗(yàn)