鱗柄小奧德蘑多糖對小鼠具有免疫調(diào)節(jié)能力

鱗柄小奧德蘑（Oudemansiellafurfuracea），又稱為長根小奧德蘑鱗柄變種(O.radicatavar.furfuracea)，或者是鱗腿長根金錢菌(Collybiaradicatavar.furfuracea)[1]，現(xiàn)為蘑菇目（Agaricales）膨瑚菌科（physalacriaceae）狹義小奧德蘑屬（Oudemansiella）一獨立品種。這種蘑菇的味道極其鮮美，營養(yǎng)價值豐富，是人類餐桌上的首選。而且它有“草雞樅”和“露水雞樅”的稱號，因為鱗柄小奧德蘑屬于腐生生菌，易于人工栽培，重要的是其經(jīng)濟價值較高[2]，所以越來越多的人不斷的嘗試種植，目前在河北、北京和山東均有人工種植。目前國內(nèi)對于該菌的研究主要集中在育種和栽培等方面[3]，但是有關(guān)鱗柄小奧德蘑粗多糖的生物活性方面還未見報道。多糖是一種天然高分子化合物，由單糖聚合而成，在動植物、微生物中分布極廣[4]，也很重要，有的是構(gòu)成動植物細胞壁的組成成分，如肽聚糖和纖維素；有的是作為動植物儲藏的養(yǎng)分，如糖原和淀粉，還有我們今天要說的蘑菇多糖，它是一種水溶性蛋白多糖，具有特殊的生物活性[4]。多糖的功能多種多樣，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤，抗凝血以及降三高的作用[5-6]，因此有“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”這一美稱[6]。多糖生物學(xué)一直都是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，現(xiàn)代生物學(xué)的研究熱點，隨著這些領(lǐng)域的發(fā)展，多糖對人體的巨大優(yōu)勢被呈現(xiàn)出來，尤其是多糖生物活性與免疫系統(tǒng)的聯(lián)系漸漸的被人類所了解，比如在癌癥的免疫調(diào)節(jié)方面就發(fā)揮著巨大的作用，好多抗腫瘤的藥物當(dāng)中就有免疫治療物的成分。近年來許多科學(xué)家也對一些種類的多糖進行了有關(guān)免疫調(diào)節(jié)的實驗，可見科學(xué)家極大重視免疫調(diào)節(jié)劑的研究[4]。如宮麗華等利用柘木根多糖研究對小鼠腹腔巨噬細胞的激活及抑瘤作用[7]；張莘莘等利用黑靈芝多糖研究對體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細胞功能的影響[8]；王晶等利用阿魏側(cè)耳胞外多糖研究對小鼠巨噬細胞的激活作用[9]等。但是目前，尚未有鱗柄小奧德蘑多糖相關(guān)研究報道[3]。巨噬細胞是一種免疫細胞，具有許多功能。它們是研究細胞吞噬作用，細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細胞不但容易存活而且容易獲得，易于培養(yǎng)，并且可以純化。它也屬于非增殖性細胞群，可在適當(dāng)條件下存活2-3周。因為它們主要用作原代培養(yǎng)，所以很難長期存活。它們也是一群來自單核細胞組織中的白細胞，而單核細胞又來源于骨髓中的前體細胞。巨噬細胞和單核細胞都屬于吞噬細胞，參與脊椎動物的非特異性防御（先天免疫）和特異性防御（細胞免疫）[7]。它們的主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式進行細胞碎片和病原體的吞噬（即吞噬和消化），并激活淋巴細胞或其他免疫細胞對病原體作出反應(yīng)?？偠灾鼈兇蠖鄶?shù)分布在各大組織中，經(jīng)常在炎癥反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著其獨特的作用[10]。被譽為我們?nèi)梭w的消防戰(zhàn)士。正常情況下巨噬細胞大多處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，一旦受到其它因素的激活就可產(chǎn)生許多不同的細胞因子，引起一系列的免疫應(yīng)答[11]，對多種疾病的臨床治療有巨大作用。NO、TNF-α、IL-1、IL-6是巨噬細胞分泌的主要細胞因子，NO被認為是“巨噬細胞活化的標(biāo)志物之一”[12]，也是巨噬細胞受到活化后分泌的一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子?？墒窃谝郧癗O被認為是極其不穩(wěn)定的物質(zhì)，在空氣中很快轉(zhuǎn)變成二氧化氮產(chǎn)生刺激作用。氮氧化物主要損害呼吸道，使人出現(xiàn)胸悶，呼吸窘迫。NO濃度過高還可導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥，NO是近年來發(fā)現(xiàn)的一種氣體信使分子，它可以通過彌散的方式激活鳥苷酸環(huán)化酶，生成環(huán)磷酸鳥苷，而發(fā)揮各種生物學(xué)效應(yīng)，尤其是最近NO與巨噬細胞之間的關(guān)系被人們所熟知并逐漸運用到科研和醫(yī)療中。TNF-α被稱為腫瘤壞死因子，它可以促進T細胞產(chǎn)生各種炎癥因子，進而促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生。它主要是與靶細胞表面的受體結(jié)合降低其溶酶體膜的通透性引起靶細胞溶解[13]，并且影響靶細胞糖代謝反應(yīng)，促進其死亡[10]。TNF-α不僅自身可以參與到免疫反應(yīng)中，一些其他的細胞因子的釋放也會受到TNF-α的影響，共同對組織造成損傷[8]。IL-1.和IL-6都屬于白細胞介素的一種。白細胞介素是由多種細胞產(chǎn)生并作用于多種細胞的一類細胞因子。由于最初是在白細胞產(chǎn)生又在白細胞間發(fā)揮作用，所以由此得名，現(xiàn)在仍一直沿用。最初是指由白細胞產(chǎn)生又在白細胞間起調(diào)節(jié)作用的細胞因子?，F(xiàn)在是指一類分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能已基本明確，具有重要調(diào)節(jié)作用而統(tǒng)一命名的細胞因子，它和血細胞生長因子同屬細胞因子，兩者相互協(xié)調(diào)，相互作用，共同完成造血和免疫調(diào)節(jié)功能。白細胞介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細胞，介導(dǎo)T、B細胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。它還是一種專門針對白細胞病態(tài)的一種藥物，可以很好控制白細胞的數(shù)量，一定量的白細胞介素還可以顯著增強人體免疫力。IL-1一般是由巨噬細胞產(chǎn)生，能夠增強細胞殺傷力，增強抗感染力，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中尤為重要。而IL-6大多則為多細胞產(chǎn)生，能夠使B細胞產(chǎn)生抗體，參與機體的免疫調(diào)節(jié)，代謝調(diào)節(jié)[14]。它們都是人體不可缺少的細胞因子。本論文通過原代培養(yǎng)法建立小鼠腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)體系，采用熒光探針標(biāo)記和雙抗體夾心法檢測細胞內(nèi)NO含量和TNF-α、IL-1和IL-6的分泌量，研究鱗柄小奧德蘑粗多糖對巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)作用的影響。2.1.3液體配制。F12K：選粉劑一瓶，準(zhǔn)確稱量2.50gNa2CO3，0.1g鏈霉素，0.06g青霉素，然后一塊倒入潔凈的錐形瓶中，加入950ml超純水充分?jǐn)嚢枞芙猓胮H試紙調(diào)pH至7.2，再倒入1L的容量瓶進行定容，在超凈工作臺里過濾以除去一些雜質(zhì)和肉眼看不到的細菌，最后進行分裝，放在-20℃的環(huán)境中保存?zhèn)溆?。D-Hanks平衡鹽溶液：準(zhǔn)確稱量8gNacl，0.12gNa3PO4，0.4gKCl，0.06gKH2PO4，0.35gNaHCO3于潔凈的錐形瓶中，加入超純水約950ml充分?jǐn)嚢枞芙?，調(diào)pH至7.2，再倒入1L的容量瓶進行定容，在超凈工作臺里過濾以除去一些雜質(zhì)和肉眼看不到的細菌，最后進行分裝，放在-20℃的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?.2實驗方法2.2.1多糖的提取將鱗柄小奧德蘑子實體用流水沖洗表面除去泥沙，置于60℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎機粉碎，200目篩絹過濾后乙醇除脂[15]，低溫烘干。按照1:40的料液比；1h的提取時間，90℃的提取溫度，3次的提取次數(shù)為提取條件，熱水浸提[16-17]，離心（4000r/min4℃20min）取上清。將上清濃縮4倍用濃度為75%的乙醇沉淀，4℃過夜，離心收集沉淀，用95%乙醇、無水乙醇、丙酮醇沉，Sevage（氯仿：正丁醇=4:1）試劑除蛋白，直至中間層無白色沉淀；自來水流水透析24h，蒸餾水透析12后真空冷凍干燥得鱗柄小奧德蘑子實體粗多糖。2.2.2巨噬細胞的收集和培養(yǎng)（1）小鼠脫頸處死，立即放入75%的酒精中浸泡1min，重復(fù)2次轉(zhuǎn)入超凈工作臺，取5ml的F12K輕輕的注射進小鼠腹腔，輕柔腹部，在無菌的環(huán)境下打開腹腔，從內(nèi)取出細胞懸液放到離心管里，1500r/min離心10min，棄上清，用含15%血清的完全培養(yǎng)基懸浮細胞。（2）血細胞計數(shù)板統(tǒng)計細胞數(shù)量，調(diào)節(jié)細胞密度為6×106個/ml，接種至24孔細胞培養(yǎng)板，每孔1ml，放置在37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2.2.3多糖處理待細胞貼壁后，加入鱗柄小奧德蘑粗多糖處理，設(shè)空白對照組、陽性對照組和實驗組?？瞻讓φ战M添加等量的完全培養(yǎng)液，陽性對照組添加終濃度為20mg/L的脂多糖（LPS），實驗組分別添加終濃度為25、50、100和200mg/L的抽濾后鱗柄小奧德蘑粗多糖溶液。每組設(shè)3個重復(fù)。多糖處理24h后，收集細胞上清液-20°C冷藏備用。2.2.4細胞內(nèi)NO含量的檢測——熒光探針法（1）在24孔細胞培養(yǎng)板置入無菌的細胞爬片，按2.2.2方法收集細胞并接種，待細胞貼壁后，添加脂多糖和不同濃度鱗柄小奧德蘑多糖處理。（2）多糖處理48h后，取出細胞爬片，細胞面朝上。參照DAF-FMDA熒光探針說明說明書，加入探針（探針：稀釋液=1:400），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育30min。（3）細胞用D-Hanks洗滌2-3次，將未進入細胞內(nèi)的DAF-FMDA去除。（4）快速的在熒光顯微鏡下觀察并且拍照，整個過程要避光處理。2.2.5TNF-α、IL-1、IL-6分泌量的測定——雙抗體夾心法按試劑盒要求操作。2.2.6統(tǒng)計分析采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）是為了組間差異性比較。P<0.01，表示差異極顯著；P<0.05，表示差異顯著。光學(xué)顯微鏡觀察顯示，體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細胞（見圖1）呈不規(guī)則性，貼壁生長，細胞透光性較好3.2巨噬細胞NO分泌的檢測熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與空白對照相比，添加終濃度為25~200mg/L多糖處理后，巨噬細胞內(nèi)探針的熒光亮度顯著增強（見圖2）。說明48h多糖處理后的巨噬細胞可使NO的分泌量顯著增加A，空白對照組；B~E，25、50、100、200mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理組；F，20mg/LLPS處理組。A,control;B~E,thetreatmentgroupof25、50、100、200mg/LOudemansiellafurfuraceaＦ,thetreatmentgroupof20mg/LLPS.3.3巨噬細胞TNF-α、IL-1和IL-6分泌量的測定酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果（見表）顯示，與空白對照相比，25~200mg/L的鱗柄小奧德蘑粗多糖可極顯著提高巨噬細胞對IL-6的分泌量，100~200mg/L的鱗柄小奧德蘑粗多糖可顯著提高巨噬細胞對TNF-α、IL-1的分泌量。表1鱗柄小奧德蘑多糖對小鼠巨噬細胞TNF-α、IL-1、IL-6分泌量的影響Table1EffectsofpolysaccharidesfromOudemansiellafurfuraceaonTNF-α、IL-1、IL-6ofmurinemacrophages與空白對照組相比，顯著差異（P<0.05）用“*”表示，極顯著差異（P<0.01）用“**”表示4.1NO分泌量的檢測NO是細胞內(nèi)信號分子，參與機體的免疫調(diào)節(jié)。巨噬細胞活化后，胞內(nèi)的NO合成酶基因被激活從而生成NO[12]。F-FMDA，它可以穿過細胞膜進入胞內(nèi)與酯酶作用形成不能穿過細胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身只有微弱的熒光，但是與NO反應(yīng)后就能出現(xiàn)非常強烈的熒光現(xiàn)象，根據(jù)熒光亮度可以判斷細胞內(nèi)NO的多少[20]。與空白對照相比，25~200mg/L鱗柄小奧德蘑粗多糖和20mg/LLPS處理組細胞內(nèi)綠色熒光的強度和平均光密度明顯增強。說明，25~200mg/L鱗柄小奧德蘑粗多糖可以促進巨噬細胞產(chǎn)生NO，且具有濃度依賴性。4.2TNF-α、IL-1、IL-6分泌量的測定TNF-α是巨噬細胞分泌的一種多效細胞因子，在體外和體內(nèi)對腫瘤細胞均有顯著作用，不僅如此，它還具有多種免疫調(diào)節(jié)作用[7]。IL-1是巨噬細胞產(chǎn)生的一類細胞因子，其生物學(xué)作用十分廣泛，主要包括調(diào)節(jié)機體免疫和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用[18]。IL-6是多細胞分泌的一類細胞因子，不僅能促進Ｂ細胞前體產(chǎn)生抗體，而且能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細胞增殖、分化并提高其免疫功能[19]。由表１可知，隨著鱗柄小奧德蘑多糖添加量的提高，TNF-α、IL-1、IL-6分泌量均顯著上升。其中，100~200mg/L鱗柄小奧德蘑多糖可顯著增加小鼠巨噬細胞TNF-