果蠅大實(shí)驗(yàn)-轉(zhuǎn)基因果蠅的雜交重組和鑒定

果蠅大實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)基因果蠅的雜交重組和鑒定實(shí)驗(yàn)日期：4/5～5/24實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：生物舊館遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)者：2010080086鄭世喜同組實(shí)驗(yàn)者：胡璞，蘭陸紅，謝雨辰，潘新蕾實(shí)驗(yàn)?zāi)康模翰迦朐谕粋€(gè)染色體上的不同目的基因（分別處于兩個(gè)品系果蠅中）通過重組交換整合到同一品系果蠅的同一染色體上，并得到可以穩(wěn)定保存的品系（balanced或homozygous）。背景知識(shí)：轉(zhuǎn)基因果蠅（transgenicfly）是將帶有目的基因的質(zhì)粒通過顯微注射轉(zhuǎn)入白眼果蠅卵中，這些質(zhì)粒上一般帶有P轉(zhuǎn)座子序列（PelementsaretransposablepiecesofDNAthatrandomlyinsertthemselvesintogenomicDNA），使得目的基因可以插入到果蠅染色體中。一般使用白眼果蠅的卵進(jìn)行顯微注射，質(zhì)粒上帶有的mini-white基因（紅眼）可以作為轉(zhuǎn)基因成功的標(biāo)記（marker），帶有目的基因的果蠅將成為紅眼果蠅。mini-white的表達(dá)量決定了果蠅眼睛紅色的深淺，這與目的基因插入位置和copy數(shù)目有關(guān)（可請(qǐng)學(xué)生思考為什么——插入位置附近的染色體結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子決定mini-white表達(dá)量，純和果蠅比雜合果蠅表達(dá)量也高，有多個(gè)插入位點(diǎn)的比單個(gè)插入位點(diǎn)的表達(dá)量高，一般情況下只有一個(gè)插入位點(diǎn)）。常用的帶P轉(zhuǎn)座子載體示意圖如下：實(shí)驗(yàn)提供的轉(zhuǎn)基因果蠅，由于受質(zhì)粒大小的限制，一般一個(gè)轉(zhuǎn)基因果蠅品系只能轉(zhuǎn)入一個(gè)目的基因，有時(shí)需要把不同目的基因整合到同一個(gè)果蠅品系中，研究?jī)蓚€(gè)基因的功能及相互作用等。如果兩個(gè)目的基因都插在不同果蠅品系的同一個(gè)染色體上，可以通過遺傳重組的方法得到重組型后代（眼睛顏色），重組型后代將在同一個(gè)染色體上同時(shí)帶有兩個(gè)目的基因，并可以建立穩(wěn)定保持的品系。例如有基因A的轉(zhuǎn)基因果蠅系tA和基因B的轉(zhuǎn)基因果蠅系tB，A和B分別插在tA和tB的三號(hào)染色體上（t表示transgenic），通過重組交換可以得到三號(hào)染色體上同時(shí)帶有基因A和基因B的轉(zhuǎn)基因果蠅系tAB，將tAB穩(wěn)定保存即可。重組實(shí)驗(yàn)還需要帶TM3平衡子(balancer)的果蠅來輔助，帶平衡子的果蠅相應(yīng)染色體不能發(fā)生重組，使得雜交過程和鑒定方法更為簡(jiǎn)單。另外，還需要應(yīng)用到一個(gè)UAS-Gal4系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞的driver，為GMR-Gal4，進(jìn)行重組成功的鑒定。GAL4/UAS系統(tǒng)是目前果蠅中十分常用的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（見下圖說明）。該系統(tǒng)利用組織特異性的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，將GAL4基因與啟動(dòng)子或增強(qiáng)子相連接,建立GAL4轉(zhuǎn)基因系，通過這種啟動(dòng)子以細(xì)胞和組織特異性的方式來控制GAL4的表達(dá)。另外，將UAS與靶基因融合，建立帶有UAS-靶基因的轉(zhuǎn)基因系。在雜交后代中,特異性表達(dá)的GAL4能以同樣的方式調(diào)節(jié)UAS-靶基因的表達(dá)。FigureSEQFigure\*ARABIC1果蠅中GAL4/UAS系統(tǒng)(DanielStJohnston,2002)實(shí)驗(yàn)材料：轉(zhuǎn)基因果蠅A、B/Ser(翅膀缺刻)、+/Sbbalancer（白眼，平衡子Sb，短剛毛）的果蠅以及GMR-Gal4果蠅。其中，tA果蠅系為純合體，轉(zhuǎn)入Tau基因，該轉(zhuǎn)基因與GMR-Gal4果蠅系進(jìn)行雜交，其在GMR-Gal4的驅(qū)動(dòng)下，產(chǎn)生子代的成體果蠅眼睛缺陷，表現(xiàn)為發(fā)育不全。tB果蠅系為純合致死，帶有一個(gè)Serrate（翅膀缺刻）的balancer，其自身帶有GFP基因，能自發(fā)綠色熒光，在熒光顯微鏡下可觀察。本實(shí)驗(yàn)中可能用到的balancer為：染色體Balancer顯性表型標(biāo)記（dominantphenotypicmarker）純合（homozygous）3TM3Sb（短剛毛）致死（lethal）3TM3Serrate（翅膀缺刻）致死（lethal）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：P:FP:F1:F2:F2’:A/AB/SerA/BA/Ser+/SbA/BA/BA/SbB/SbAB/SbB/+?GMR-Gal4?GMR-Gal4?GMR-Gal4?GMR-Gal4?GMR-Gal4?GMR-Gal4?GMR-Gal4?GMR-Gal4AB/+/SbA/+/+殘刻翅不涌短剛毛AB/Sb+/Sb實(shí)驗(yàn)步驟：A/A和B/Ser雜交。（我們組分別做了A/A(♂)xB/Ser(♀)和A/A(♀)xB/Ser(♂)）他們的后代當(dāng)中挑出A/B(♀)。后代有A/B和A/Ser，A/Ser是殘刻翅果蠅，雌雄通過觀察幾個(gè)明顯的特征來篩選挑出A/B(♀)。A/B(♀)和+/Sb進(jìn)行雜交。后代有8中可能，當(dāng)中/+不會(huì)涌出來，挑出短剛毛果蠅，即，包含Sb的果蠅。（不包含/Sb）挑出的果蠅可能的基因是：A/Sb、B/Sb、AB/Sb。（其他果蠅都是白眼的）挑出8只雄蠅，分開放培養(yǎng)瓶里，跟GMR-Gal4進(jìn)行雜交。檢驗(yàn)他們的子代既有A的特性又有B的特性的。（既有眼睛缺陷又有綠色熒光）找回他們的父親，即AB/Sb，跟+/Sb進(jìn)行雜交。FigureSEQFigure\*ARABIC2成蠅短剛毛參考圖片F(xiàn)igureSEQFigure\*ARABIC3果蠅突變體參考圖片1FigureSEQFigure\*ARABIC4果蠅突變體參考圖片2實(shí)驗(yàn)過程：親代雜交。我們做了4瓶A/AXB/Ser雜交組合，編號(hào)分別為1,2,3,4。各雜交瓶蠅的數(shù)量和類別如下：1：A/A(♀)3只，B/Ser(♂)4只；2：A/A(♂)3只，B/Ser(♀)2只；3：A/A(♀)3只，B/Ser(♂)4只；4：A/A(♂)3只，B/Ser(♀)2只；F1的數(shù)量和性狀。我們從四個(gè)雜交瓶產(chǎn)生的后代中選出大約40只，從中再挑選正常翅的處女蠅14只，它們的基因型應(yīng)為A/B。我們把這14只處女蠅與+/Sb的雄蠅做了4組雜交，編號(hào)①，②，③，④。雜交瓶的情況如下：A/B（♀）3只，+/Sb（♂）5只;A/B（♀）4只，+/Sb（♂）4只;A/B（♀）4只，+/Sb（♂）5只;A/B（♀）3只，+/Sb（♂）3只;F2后代的數(shù)量和性狀。②③④雜交瓶很給力，產(chǎn)生了大概有兩百多的子代。我們只打算挑選其中的雄蠅。因?yàn)橄乱徊诫s交需要將F2雄蠅單個(gè)與GMR/Gal4雌蠅雜交，挑選出的雄蠅太多培養(yǎng)基不夠用。最后我們挑選出9只短剛毛、紅眼的雄蠅，他們的基因型應(yīng)該為A/Sb,B/Sb,AB/Sb這三種中的其中一種。不幸的是這9只中有一只后來被粘死了，我們最終做了8瓶雜交，編號(hào)分別為甲，乙，丙，丁，戊，己，庚，辛。F2與GMR/Gal4處女蠅的雜交狀況。質(zhì)量不好的培養(yǎng)基害人不淺。我們的八個(gè)雜交瓶里的培養(yǎng)基放了兩天就開始萎縮，變粘稠，里面的果蠅陸陸續(xù)續(xù)被粘死，最終我們只剩下乙瓶是兩只親本都活著的，也只有乙瓶長(zhǎng)出了幼蟲。這個(gè)結(jié)果給我們帶來了很大影響。由于已經(jīng)接近大實(shí)驗(yàn)的截止日期，我們決定不再重新挑選果蠅進(jìn)行雜交，把所有希望都放在了這僅存的一瓶F3上。乙瓶雄性親本與+/Sb雜交。我們?cè)谝移坷镉腥g幼蟲爬上瓶壁后，把寄托著我們唯一希望的雄蠅乙轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)瓶和一只+/sb處女蠅進(jìn)行雜交。若乙的基因型是AB/Sb的話，這個(gè)雜交瓶的后代就是可以穩(wěn)定遺傳的后代，即我們最終想要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。F3的數(shù)量及檢測(cè)結(jié)果。最后共產(chǎn)生47只F3后代，我們麻醉了所有的F3后代，一部分拿去檢驗(yàn)熒光，一部分拿去觀察眼睛的發(fā)育情況。實(shí)驗(yàn)討論和結(jié)果：我們?cè)瓉淼膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是F1的子代中挑紅眼短剛毛，跟+/Sb雜交，把它們的子代跟GMR-Gal4進(jìn)行雜交反過頭來驗(yàn)證哪只是AB/Sb果蠅。但是后來由于上述的方法比較耗時(shí)間，我們時(shí)間有限，所以改成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法的。（兩種方法最后達(dá)到的檢驗(yàn)效果是一樣的）拿到A和B果蠅之后先進(jìn)行自交，用得到的子代進(jìn)行雜交。一共雜交了四個(gè)瓶，每個(gè)瓶雄蠅比雌蠅多一些（保證雜交）。雜交生出來的子代有A/B和A/Ser，因?yàn)閹er基因，會(huì)出現(xiàn)殘刻翅，我們很容易分辨出A/B和A/Ser。挑出的A/B當(dāng)中挑處女蠅，因?yàn)槲覀冃枰狝基因和B基因在同一條染色體上，而只有雌蠅會(huì)發(fā)生重組。雌性A/B和雄性+/Sb進(jìn)行雜交，子代的基因型有八種可能：A/Sb、B/Sb、AB/Sb、/Sb、A/+、B/+、AB/+和/+。其中/+直接致死，不會(huì)涌出來。帶野生型基因的是白眼，直接處死，/Sb也是白眼，直接處死。剩下的是A/Sb、B/Sb和AB/Sb。三個(gè)基因型都是紅眼短剛毛。短剛毛的形狀可以參考figure2，檢驗(yàn)是不是短剛毛的時(shí)候看果蠅背部剛毛群的最后沿兒處最容易分辨。Sb果蠅在此位置的剛毛短、直、末端沒有彎曲和變細(xì)。F2代眼睛顏色很多樣，有深紅色、淺紅色、橙色、錢橙色、白色等。但是只要不是白色說明是有這個(gè)基因，只是由于雜交重組基因的量少了一些。其中挑雄蠅跟雌性GMR-Gal4進(jìn)行雜交（因?yàn)橄乱徊娇此麄兊淖哟?，反過來還要跟+/Sb進(jìn)行雜交，雌蠅的話不是處女蠅，會(huì)之前雜交過的雄性的基因會(huì)留在雌蠅里，影響下次雜交出來的子代，所以用雄蠅），這是每一瓶放一只雄蠅和一只雌蠅。我們組一共做了8瓶。但是由于培養(yǎng)基配的太軟了，除了“乙”瓶，另外七瓶的果蠅都粘死了。沒辦法，我們只能把乙瓶里的雄蠅（父親）拿出來檢驗(yàn)熒光。下面是我們照的熒光檢測(cè)照片。FigureSEQFigure\*ARABI