細胞培養(yǎng)室設置培訓課件

細胞培養(yǎng)室設置實驗室組成基本設施配置常用器皿、器械培養(yǎng)基的成份、配制與選擇實驗室操作注意事項衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置2一.實驗室組成衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置3一.實驗室組成

細胞培養(yǎng)實驗室的設計是由工作的目的和規(guī)模決定的，其基本要求是：便于隔離、便于操作、便于滅菌、便于觀察。

細胞培養(yǎng)實驗室的設置必須滿足三個基本的需要，即：實驗準備（培養(yǎng)基配制，洗滌與滅菌等）、無菌操作、控制培養(yǎng)。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置4一.實驗室組成基本實驗室

消毒準備室制備室無菌操作室輔助實驗室

細胞學實驗室生化分析室攝影室及暗室衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置基本組成：5一.實驗室組成消毒準備室制備室無菌操作室衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置1.基本實驗室：6一.實驗室組成消毒準備室

功能

一切與實驗有關的準備工作要求

設備的安裝和排列要合理

房間要寬敞明亮，通風條件好

地面要便于清潔、防滑配備

實驗臺，高壓滅菌鍋、排風滅火設備

干熱消毒柜、超聲波清洗器、洗瓶機等。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置7一.實驗室組成制備室

功能

進行培養(yǎng)液及相關試劑的配制要求

在無菌操作臺內(nèi)過濾、除菌。配備

冰箱、天平、真空泵、PH計等。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置8一.實驗室組成無菌操作室地面、天花板及四壁盡可能光潔，無死角，易于清潔。大小適度，層高不高于2.5米。干爽、安靜、清潔、明亮。紫外燈1－2盞，保持室內(nèi)無菌狀態(tài)。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置9一.實驗室組成無菌操作室設置空氣過濾和恒溫恒濕裝置，恒溫溫度26度左右。保持正壓，盡量減少與外界的空氣對流，減少塵埃與微生物侵入。通常由內(nèi)外間組成，外間為緩沖間，用于準備工作。研究人員進入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置10一.實驗室組成細胞學實驗室

對培養(yǎng)材料進行細胞學鑒定和研究，要求清潔、明亮、干燥，使各種光學儀器不受潮濕和灰塵污染。攝影室及暗室

其功能是進行培養(yǎng)材料的攝影記錄和膠片沖印。生化分析室

在以培養(yǎng)細胞產(chǎn)物為主要目的的實驗室中，應建立相應的分析化驗實驗室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進行取樣檢查。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置2.輔助實驗室：11單元小結：

基本的細胞培養(yǎng)室應包括消毒準備室、制備室、無菌操作室。

無菌室的設置標準。

衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置12二.基本設備配置衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置13二.基本設備配置衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置基本設備滅菌設備無菌操作設備光溫控制設備細胞培養(yǎng)設備細胞學鑒定設備14二.基本設備配置冰箱天平酸度計恒溫水浴鍋磁力攪拌器液氮罐純水設備衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置1.基本設備15衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置16衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置17PH7.0～7.4

去離子水

無菌

衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置18衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置19二.基本設備配置蒸汽壓力滅菌鍋干熱消毒柜過濾滅菌裝置噴霧消毒器紫外燈衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置2.滅菌設備20衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置21衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置消毒物理消毒射線、紫外線、干熱、濕熱、濾過化學消毒來蘇兒、新潔爾滅、過氧乙酸、70%酒精220.45μm

0.22μm衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置23二.基本設備配置凈化工作臺生物安全柜衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置3.無菌操作設備24超凈臺原理：內(nèi)設鼓風機，驅動空氣通過高效濾器過濾，凈化后的空氣以水平或垂直氣流的狀態(tài)送出，從而形成無菌潔凈工作環(huán)境。分類：垂直流超凈工作臺，水平流超凈工作臺；單邊操作臺，雙邊操作臺；普通操作臺，醫(yī)用（生物）操作臺。維護：檢查濾膜，定期清洗，更換。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置25生物安全柜根據(jù)主要幾項生物安全柜國際標準的規(guī)定，安全柜可分為一級、二級和三級三大類以滿足不同生物研究和防疫的要求。安全柜的分類級別與生物安全登記無關。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置26一級生物安全柜

保護工作人員和環(huán)境，而不保護樣品。排氣口安裝有HEPA過濾器。無自帶風機，依賴外接通風管中的風機帶

動氣流。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置27二級生物安全柜可提供對樣品，環(huán)境，工作人員的保護。排氣口安裝有HEPA過濾器，獨有特征是具有垂直層狀薄片（無定向的）HEPA過濾器。內(nèi)置風機，形成下沉氣流無自帶風機，依賴外接通風管中的風機帶

動氣流。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置28三級生物安全柜為3－4級實驗室生物安全等級而設計，柜體完全氣閉。通過手套進行操作，俗稱“手套箱”。實驗品通過雙門的傳遞箱進出。適用于高風險的生物實驗。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置29確認通風櫥已經(jīng)打開，并且空氣正在循環(huán)。把框格降低到刻度處不要阻礙空氣流通使用前用70％乙醇擦拭臺面不要使用酒精燈減少手臂再通風櫥內(nèi)晃動衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置30二.基本設備配置時間程序控制器空調及溫度感應器衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置4.光溫控制設備31二.基本設備配置CO2培養(yǎng)箱離心機衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置5.細胞培養(yǎng)設備32溫度：37℃±0.5℃

CO2濃度：5%

相對濕度：100%

定期清洗、消毒

衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置33衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置罐內(nèi)壓力指示接培養(yǎng)箱的管子輸出壓力指示壓力調節(jié)旋鈕流量控制閥門34衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置固定角式轉子水平轉子垂直轉子1000RPM10MIN配平35二.基本設備配置倒置顯微鏡熒光顯微鏡酶標檢測儀流式細胞儀衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置6.細胞學鑒定設備36衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置37衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置單元小結：

細胞培養(yǎng)實驗室基本設備：離心機、倒置顯微鏡、冰箱、無菌操作臺、液氮罐。

II型生物安全柜的使用規(guī)范。

CO2培養(yǎng)箱、離心機的使用規(guī)范。

38三.常用器皿、器械衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置39三.常用器皿、器械解剖器具培養(yǎng)器皿移液器特殊用具衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置40三.常用器皿、器械解剖器具

主要用于解剖動物、取材和原代培養(yǎng)中切割組織。常用的手術器械有手術刀柄及刀片（圓形或尖型）、組織剪、眼科剪（直頭和彎頭）、鑷子（平齒、鼠齒）、尖鑷、止血鉗、持針器等。

各種器械至少要準備兩套，以備輪換消毒用。各種金屬器械使用后，要及時刷洗干凈，用干凈紗布拭干，上一薄層液體石蠟，以防生銹。消毒法采用高壓蒸汽滅菌或采用70％乙醇浸泡消毒。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置41三.常用器皿、器械培養(yǎng)器皿

如溶液瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。多孔培養(yǎng)板材料僅有塑料的一種，適宜少量細胞和單克隆生長，也適宜進行分組比較的生化、藥理、毒理等方面的實驗，其規(guī)格主要有6孔，12孔、24孔、96孔培養(yǎng)板。

移液管和吸管移液管有刻度，可定量移液，有玻璃和塑料2種，常用規(guī)格為10ML、5ML、1ML。

其它器皿燒杯、量筒、漏斗，細胞凍存管等。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置42細胞培養(yǎng)室設置43三.常用器皿、器械移液器電動移液器微量移液器多通道微量移液器衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置44三.常用器皿、器械特殊用具

細胞篩網(wǎng)、細胞刮刀、細胞計數(shù)板衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置45三.常用器皿、器械單元小結：

了解常用器械種類，用途。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置46四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置47四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置細胞培養(yǎng)基的基本要求細胞培養(yǎng)基分類常用細胞培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基的配制細胞培養(yǎng)基的選擇48四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇細胞培養(yǎng)基的基本要求營養(yǎng)成分:12種必須氨基酸、葡萄糖、維生素、無機離子與微量元素促生長因子及激素：胰島素、氫化可的松、泌乳素滲透壓：260－320mOsm/kgpH、氣體：

pH值約7．2～7．4。CO2濃度（5％）

無毒、無污染衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置49四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇細胞培養(yǎng)基分類

按其物質狀態(tài)：

半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類

按其來源：

合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置50四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇天然培養(yǎng)基

最普遍使用的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最為普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質。常見使用最為5-20%。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置51四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇血清培養(yǎng)基主要問題血清的準確成份、含量仍不清楚。批量生產(chǎn)的血清各批量之間差異很大，且保存期至多一年，因此實驗的標準化和連續(xù)性受到限制。對大多數(shù)細胞，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）。

衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置52四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇血清培養(yǎng)基主要問題血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性。價格昂貴衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置53四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇合成培養(yǎng)基：

根據(jù)細胞所需物質的種類和數(shù)量,用化學物質模擬合成、人工設計、配制的培養(yǎng)基。從最初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。酚紅谷氨酰胺衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置55四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM)

不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。優(yōu)點：可避免血清批次間的質量變動，提高實驗結果的重復性。避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。避免血清組分對實驗研究的影響。有利于體外培養(yǎng)細胞的分化?？商岣弋a(chǎn)品的表達水平并使細胞產(chǎn)品易于純化。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置56四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM)缺點：易受某些機械因素和化學因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。成本較高針對性很強，僅適合某一類細胞的培養(yǎng)。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置57四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇無蛋白培養(yǎng)基（proteinfreemidium,PFM）

不含有動物蛋白的培養(yǎng)基。從生物技術發(fā)展的趨勢來看，不含動物蛋白的培養(yǎng)基有廣泛的應用前景，許多利用基因工程技術重組的蛋白質最終要應用于人體，如果在生長過程中使用了含有動物蛋白質的培養(yǎng)基，純化過程就比較復雜，最終要達到一定的質量標準也有一定的難度。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置58四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇限定化學成分培養(yǎng)基(chemicaldefinedmedium,CDM)

指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結構與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細胞、CHO細胞、雜交瘤細胞生長的CDM問世。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置59四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇MEM細胞培養(yǎng)基系列DMEM細胞培養(yǎng)基系列RPMI-1640細胞培養(yǎng)基系列199細胞培養(yǎng)基系列水解乳蛋白細胞培養(yǎng)基歐氏平衡鹽F-10,F-12細胞培養(yǎng)基系列其它類型細胞培養(yǎng)基衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置常用細胞培養(yǎng)基60四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實驗需要決定。

配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。

配制所用的水應是三蒸水，離子濃度很低。

所用器皿應嚴格消毒。

配制好的培養(yǎng)基應馬上過濾，無菌保存于4度。衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置干粉培養(yǎng)基的配制61四.培養(yǎng)基的成份、配置與選擇細胞培養(yǎng)基的選擇衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室細胞培養(yǎng)室設置細胞系細胞類型種組織培養(yǎng)基293成纖維細胞人胚胎腎MEM,10%熱滅活馬血清IMR-90成纖維細胞人肺MEM,10%胎牛血清和NEAAW1-38成纖維細胞人胚胎肺,3月妊娠MEM,10%胎牛血清A549上皮細胞人肺癌F-12K,10%胎牛血清A431上皮型人表皮細胞癌DMEM,10%胎牛血清BHL-100上皮細胞人乳房McCoy'5A,10%胎牛血清BeWo上皮滋養(yǎng)層人絨毛癌F-12K,15%胎牛血清Caco-2上皮細胞人結腸腺癌MEM,10%