二代測(cè)序核糖核酸RNA取樣要求

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）的應(yīng)用領(lǐng)域疾病機(jī)制研究，生理調(diào)控，環(huán)境脅迫等方面。在送測(cè)序之前，不同的樣本要怎么處理。

動(dòng)物組織處理保存方法液氮速凍法：1.

無(wú)酶凍存管，液氮中預(yù)冷；2.

活體上迅速取下組織（切成黃豆粒大小的塊狀）；3.

RNase-free

水配制

1×PBS

或生理鹽水快速清洗組織表面的污漬，吸干表面液體后收集進(jìn)凍存管（管的下部分保持在液氮中）；4.

液氮速凍（≥1h）后，轉(zhuǎn)移至-80℃保存，避免反復(fù)凍融。5.

干冰運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室RNA

保護(hù)劑法（以

RNAlater

為例）：1.

將新鮮組織切割成規(guī)定的大小，按比例加入RNAlater中（以Invitrogen品牌貨號(hào)AM7020的RNAlater為例，需要將組織切割成小于各維度均小于0.5cm，加入小于5倍體積RNAlater保存液）；2.

將樣本置于

4°C

保存過(guò)夜（使RNAlater完全滲透組織）；3.

轉(zhuǎn)移至-20℃或

-80℃長(zhǎng)期保存；4.

為避免組織塊在運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中露出液面，應(yīng)將RNAlater灌滿管子。注意事項(xiàng)：1.

不建議寄送用裂解液保存的組織樣本。2.

用RNAlater保存液的組織切割的盡可能小，否則保存液滲透不進(jìn)去容易造成RNA降解，樣品質(zhì)量不合格。3.

測(cè)序需要提供不少于1g的組織植物組織處理保存方法

1.無(wú)酶凍存管，液氮中預(yù)冷；2.盡量選取新鮮、幼嫩、生長(zhǎng)旺盛的組織部位，若為體積偏大的樣本（如果實(shí)），盡量切成小塊；3.（選做）

RNase-free

水配制

1×PBS

或生理鹽水快速清洗組織表面的附著物，吸干表面液體后收集進(jìn)凍存管（管的下部分保持在液氮中）；4.

液氮速凍（≥1h）后，轉(zhuǎn)移至-80℃保存，避免反復(fù)凍融。干冰運(yùn)輸注意事項(xiàng)：1.不建議使用

RNAlater

保存，勿用

Trizol

直接浸泡植物組織；2.表面含有較多蠟質(zhì)或次生代謝產(chǎn)物含量極高的植物組織或根，莖及種子

RNA

得率通常會(huì)較低，為提高

RNA

得率需要加大送樣量（普通送樣量的

3-4

倍）。3.

測(cè)序需要提供不少于2g的組織真菌樣本處理保存辦法1.取

500μl

的菌液，離心去上清（每管200mg）；2.將菌絲體沉淀迅速置于液氮中冷凍（>1h），或加入

trizol

混勻，裂解充分再放入液氮速凍；3.轉(zhuǎn)移至-80℃保存。干冰運(yùn)輸注：測(cè)序需提供不少于3管菌絲體細(xì)菌樣本處理保存方法1.收集對(duì)數(shù)期的菌液（OD600：0.8-1），確定細(xì)菌數(shù)量；2.取

500μl

的菌液置于

1.5ml

離心管（RNase-free）中，離心去上清；3.直接收集菌體沉淀，或加入

trizol

混勻（革蘭氏陽(yáng)性菌需要先研磨充分），裂解充分。放入液氮速凍，一個(gè)樣本請(qǐng)?zhí)峁┻@樣的

3-5

管菌體（菌體數(shù)量要不少于1x109）；4.液氮速凍后的樣本，放-80℃保存，干冰送樣。注意事項(xiàng)：對(duì)人體有毒性或致病性的細(xì)菌必須滅活后再寄送。細(xì)胞樣本處理保存方法1.取生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，確定細(xì)胞數(shù)量；2.貼壁細(xì)胞：用

1×

PBS

緩沖液洗滌細(xì)胞

1-2

次；懸浮細(xì)胞：離心，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，1×PBS

洗滌，離心棄

PBS，洗

1-2

次；3.加入適量

Trizol

裂解液（按

5×106

cells/mltrizol）反復(fù)吹打至裂解充分，形成清亮透明不粘稠液體；4.轉(zhuǎn)移至無(wú)酶離心管中，-80℃保存。注意事項(xiàng)：1.較大量細(xì)胞（5×104

以上）必須裂解充分后再寄送，勿將干凍的細(xì)胞直接寄送；2.微量細(xì)胞（103-5×104

以下）可

PBS

洗滌后直接液氮速凍（>1h），-80℃保存；3.超微量細(xì)胞（103

及以下）請(qǐng)具體聯(lián)系技術(shù)人員；4.細(xì)胞樣本以具體抽提獲得總

RNA

質(zhì)檢的量和質(zhì)量為準(zhǔn)進(jìn)行常規(guī)/微量建庫(kù)；5.細(xì)胞消化用胰酶注意把握消化程度，胰酶會(huì)消化細(xì)胞膜上的膜蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，破裂的細(xì)胞會(huì)釋放RNase導(dǎo)致RNA

降解。血液樣本處理保存方法1.使用抗凝采血管采集全血；2.輕輕倒轉(zhuǎn)采血管混合4-5次，使抗凝劑與血液混勻；3.快速轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的凍存管中，按照

250μl/管分裝，加

750μlTrizolLS/Trizol

混勻（也可按

1:5

比例添加）；4.液氮速凍（≥1h）后，轉(zhuǎn)移至-80℃保存。干冰運(yùn)輸注意事項(xiàng)：1.不建議使用肝素抗凝管，抗凝劑推薦：EDTA、檸檬酸鈉；2.紅細(xì)胞有核物種，如禽類、魚類等，需按照1:8或1:10

比例添加TrizolLS/Trizol；3.采樣后一周內(nèi)必須提取RNA，避免RNA

的降解；4.勿直接凍存新鮮血液，以免冰凍血液溶解，破裂的細(xì)胞釋放RNase導(dǎo)致RNA

降解。5.

提供血液不少于2mL。6.

血清和血漿RNA含量較低，無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)測(cè)序。只進(jìn)行微量建庫(kù)（即small

RNA建庫(kù)測(cè)序）。Total

RNA保存建議及送樣要求1.

TotalRNA

一般長(zhǎng)期保存于-80℃冰箱，干冰寄送；2.

盡量避免多