天津大學(xué)《生物技術(shù)》課件-重組與克隆

第五節(jié)基因工程的基本技術(shù)23(一)、什么是基因重組√利用限制性內(nèi)切酶和其他一些酶類，切割和修飾載體及目的基因，并將二者連接起來。(二)、重組的形式5·把DNA片段從某一類型的載體上無性繁殖到另一類型載體上-如從重組的噬菌體載體克隆到質(zhì)粒-從某一質(zhì)?？寺〉搅硪环N質(zhì)粒62.粘性末端連接T7來源不同、識別同樣的核苷酸靶子序列、形成同樣的末端-由同尾酶產(chǎn)生的DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補(bǔ)作用彼此連接起來的，但原來的酶切位點(diǎn)將被破壞，有時(shí)可能會產(chǎn)生一個(gè)同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接：G5'GATCC9·具有平頭末端的酶切載體只能與平頭末端的目的基因連接，平頭末端連接效率很低·增加DNA濃度，同時(shí)用數(shù)倍于黏性末端的連接酶處理同聚物造成延伸部分，利用同聚物序列之間的退火作用完成連接應(yīng)用互補(bǔ)的同聚物加尾法連接DNA片段>用化學(xué)方法人工合成>具有特定的一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識別位點(diǎn)和切割序列的雙股平端DNA短序列>將其接在目的基因片段和載體DNA上，使它們具有新的內(nèi)切酶位點(diǎn)十十連接酶第五節(jié)基因工程的基本技術(shù)原核生物細(xì)胞是較為理想的受體細(xì)胞類型：√沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源DNA與裸√基因組簡單，,便于對引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析√多為單細(xì)胞生物，容易獲得一致性的試驗(yàn)材料，且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快√大腸桿菌、枯草桿菌、假單孢菌、放線菌很多真核生物基因不能在大腸桿菌中表達(dá)出具有生物活性√原核生物細(xì)胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)，即使許多真核生物基因能得以表達(dá)，得到的也多是無特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈√原核生物細(xì)胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用√原核細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)這在一定程度上制約了原核受體細(xì)胞作為生物反應(yīng)器進(jìn)行異源真核生√動(dòng)物細(xì)胞：常用的動(dòng)物受體細(xì)胞有Hela細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞態(tài)的細(xì)胞；采用冰浴+CaCl?處理獲得受體。熱休克后，將受體菌在不含抗生素的培養(yǎng)液中生長至少半小時(shí)以上，使其蛋白得到足夠表達(dá)，以便能在含抗生素的瓊脂培養(yǎng)板上生性改變DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的技術(shù)路線包括制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化處理。-磷酸鈣沉淀法(calciumphosphate-DN白質(zhì)外殼里，通過噬菌體感染宿主細(xì)胞將其導(dǎo)入，并在宿主菌體內(nèi)擴(kuò)(三)共轉(zhuǎn)化(co-transformation)整合有報(bào)告基因的細(xì)胞極易識別和篩選出來，所以共轉(zhuǎn)化過程的同時(shí)也可以確定細(xì)胞內(nèi)是否存在外源基因。在動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控的研究中，報(bào)告基因也被廣泛應(yīng)因作為報(bào)告基因，具有檢測速度快、靈敏度比cat基因高30～1000倍、費(fèi)用低、不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)，得(四)電轉(zhuǎn)化·高壓電穿孔法。在受體細(xì)胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，使質(zhì)合時(shí)所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中·用于真核細(xì)胞(動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞)和原核細(xì)胞(大腸桿菌)的外源DNA的直接導(dǎo)入(五)基因槍法(genegun)·又稱高速微型子彈射擊法、微彈射擊法子彈射入完整的細(xì)胞或組織內(nèi)。400m/s-鎢或金微粒(01-3μm)受精卵發(fā)育成胚胎，并繁殖成轉(zhuǎn)基因小鼠子代后per析結(jié)票(六)脂質(zhì)體