SIRT1基因啟動(dòng)子在老年退行性心臟瓣膜病中的遺傳和功能變異研究

SIRT1基因啟動(dòng)子在老年退行性心臟瓣膜病中的遺傳和功能變異研究背景:老年退行性心臟瓣膜病(Seniledegenerativeheartvalvulardisease,SDHVD)是一種隨著人們年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的心臟瓣膜功能減退性疾病,至今外科手術(shù)仍然是該病的主流治療方式,尚未有特效藥物的產(chǎn)生。SDHVD的發(fā)病誘因包括高齡、高血壓、高脂血癥、糖尿病、吸煙等因素。大量的研究表明,老年退行性心臟瓣膜病發(fā)病與瓣膜組織的慢性炎癥,脂質(zhì)沉積以及鈣化和骨化等多種病理過(guò)程有關(guān)。SIRT1是一種去乙?；?在機(jī)體內(nèi)與多種生理過(guò)程密切相關(guān),包括炎性反應(yīng)、脂質(zhì)代謝以及鈣化骨化過(guò)程等。由此我們認(rèn)為老年退行性心臟瓣膜病可能與SIRT1基因表達(dá)的變化有關(guān)。而基因啟動(dòng)子能夠調(diào)控基因的表達(dá)水平,探究SIRT1基因啟動(dòng)子的遺傳和功能變異,找出有意義的SIRT1基因啟動(dòng)子DNA序列變異,則可能為老年退行性心臟瓣膜病發(fā)病提供新的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。目的:研究老年退行性心臟瓣膜病病人及健康人群SIRT1基因啟動(dòng)子的DNA序列變異(DSVs),并根據(jù)變異序列構(gòu)架PGL3-basic報(bào)告基因表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)SIRT1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平,探究這些DSVs對(duì)SIRT1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響,從而找出有意義的DSVs。方法:1、選取濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科通過(guò)檢測(cè)確診為老年退行性心臟瓣膜病的病人236例,對(duì)照組人群285例,要求年齡不小于60歲,統(tǒng)計(jì)兩組人群的臨床一般資料。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞并提取基因組DNA。2、根據(jù)SIRT1基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)PCR引物,然后通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段后進(jìn)行直接測(cè)序,通過(guò)與野生型SIRT1基因啟動(dòng)子序列相比發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn),統(tǒng)計(jì)并分析。3、通過(guò)PMD19-T載體篩選出野生型和具有變異位點(diǎn)的SIRT1基因啟動(dòng)子序列的單克隆菌落,再經(jīng)過(guò)質(zhì)粒提取、雙酶切、切膠回收純化,構(gòu)建攜帶野生型和具有DSVs的SIRT1基因啟動(dòng)子序列的PGL3-basic報(bào)告基因表達(dá)載體,并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組PGL3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入人胚腎細(xì)胞(HEK-293細(xì)胞)和大鼠心肌細(xì)胞(H9C2細(xì)胞)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)SIRT1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平并與野生型SIRT1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平相比較,找出能夠顯著影響SIRT1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平的DSVs。結(jié)果:1、通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)12個(gè)DSVs:僅在SDHVD組發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的雜合DSVs:g.4843C>G,在對(duì)照組發(fā)現(xiàn)六個(gè)雜合DSVs:g.4206G>A、g.4667C>G、g.4860C>T、g.4912A>G、g.5042G>A、g.5042G>T。在SDHVD組和對(duì)照組均發(fā)現(xiàn)的DSVs共5個(gè)且均為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs):g.4593A>G(rs3740051)、g.4851A>C(rs932658)、g.4874G>T(rs35995735)、g.4969A>G(rs3740053)、g.4975G>C(rs2394443),但這些DSVs在SDHVD組和對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2、通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)SIRT1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,發(fā)現(xiàn)g.4843C>G在HEK-293細(xì)胞和H9C2細(xì)胞中顯著提高了SIRT1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.05),g.4206G>A、g.4667C>G、g.4912A>G、g.5042G>A在HEK-293細(xì)胞和H9C2細(xì)胞中顯著降低了SIRT1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.05),而g.4860C>T、g.5042G>T只在H9C2細(xì)胞中顯著降低了SIRT1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.05),在HEK-293細(xì)胞中無(wú)影響(P>0.05),這可能是由于組織學(xué)差異導(dǎo)