21.1 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)概述講解

第二十一章

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)

教學(xué)目標(biāo)1.掌握：化學(xué)發(fā)光、化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑；直接化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）；酶促化學(xué)發(fā)光的原理及關(guān)鍵技術(shù)；化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用（重點(diǎn)）。2.熟悉：電化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理（重難點(diǎn)）、三類(lèi)化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法學(xué)評(píng)價(jià)。3.了解：發(fā)光的概念及分類(lèi)、化學(xué)發(fā)光物的制備。知識(shí)目標(biāo)技能目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)掌握化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的操作流程質(zhì)量控制、生物安全意識(shí)、臨床免疫學(xué)思維1.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。2.化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術(shù)類(lèi)型。3.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技術(shù)。4.電化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理。5.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用。本章要點(diǎn)一化學(xué)發(fā)光免疫分析二三四化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用五目錄化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)概述化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的抗原抗體反應(yīng)技術(shù)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。該技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、分離簡(jiǎn)便、快速、試劑無(wú)毒、安全穩(wěn)定、可自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，在免疫學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛。前言放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)類(lèi)別標(biāo)記物底物最終檢測(cè)信號(hào)均相/非均相反應(yīng)直接化學(xué)發(fā)光免疫分析吖啶酯（AE）無(wú)光強(qiáng)度非均相反應(yīng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析HRPALP魯米諾及其衍生物AMPPD光強(qiáng)度光強(qiáng)度非均相反應(yīng)非均相反應(yīng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析三聯(lián)吡啶釕無(wú)光強(qiáng)度非均相反應(yīng)魯米諾氧途徑免疫分析激發(fā)基團(tuán)+發(fā)光基團(tuán)無(wú)光強(qiáng)度均相反應(yīng)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的類(lèi)型化學(xué)發(fā)光與酶免的對(duì)比酶標(biāo)化學(xué)發(fā)光測(cè)量精度定性/半定量測(cè)量定量測(cè)量人體傷害底物可有致癌性無(wú)有效期較長(zhǎng)長(zhǎng)干擾因素較多極少測(cè)試項(xiàng)目少多化學(xué)發(fā)光與放免的對(duì)比放免化學(xué)發(fā)光測(cè)量精度較高高人體傷害放射性無(wú)有效期較長(zhǎng)長(zhǎng)干擾因素較多極少測(cè)試項(xiàng)目較多多第一節(jié)概述一、發(fā)光發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由低能級(jí)的基態(tài)躍遷到高能級(jí)的激發(fā)態(tài)，然后再返回到基態(tài)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)的激發(fā)能不同可將發(fā)光分為光照發(fā)光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光。1.光照發(fā)光（photoluminescence）發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光。2.生物發(fā)光（bioluminescence）發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲(chóng)的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲(chóng)熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的形式釋放出來(lái)。3.化學(xué)發(fā)光某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱(chēng)為化學(xué)發(fā)光?；鶓B(tài)（低能級(jí)、穩(wěn)定）激發(fā)態(tài)（高能級(jí)、不穩(wěn)定）吸收化學(xué)能光能一個(gè)化學(xué)反應(yīng)要產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以下條件：①該反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能,并由某一步驟單獨(dú)提供,因?yàn)榍耙徊椒磻?yīng)釋放的能量將因振動(dòng)弛豫消失在溶液中而不能發(fā)光②要有有利的反應(yīng)過(guò)程,使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)③激發(fā)態(tài)分子必須具有一定的化學(xué)發(fā)光量子效率釋放出光子,或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個(gè)分子使之進(jìn)入激發(fā)態(tài)并釋放出光子在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物稱(chēng)為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。二.化學(xué)發(fā)光劑作為化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高

物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測(cè)定的物質(zhì)相匹配

能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物

其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果

在所使用的濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒(méi)有毒性

常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物有

1.直接化學(xué)發(fā)光劑

2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

3.電化學(xué)發(fā)光劑

1.直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過(guò)程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。如常用的吖啶酯（acridinium，AE）。吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時(shí),發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光。

目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）。HRP的常用的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物，ALP的發(fā)光底物為金剛烷（AMPPD）（1）魯米諾或其衍生物

魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化，發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，輻射出最大發(fā)射波長(zhǎng)為425nm的光。魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理（2）AMPPD

〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-