22.2 免疫組織化學(xué)檢驗技術(shù)基本知識講解

第二十二章

免疫組織化學(xué)檢驗技術(shù)知識目標(biāo)1.掌握：免疫組化技術(shù)的定義、基本過程、抗原的修復(fù)方法（重難點），抗體的選擇和保存；酶標(biāo)記抗體的免疫組化染色（直接、間接法）的原理，熒光免疫組化標(biāo)本類型和保存。2.熟悉：免疫組化標(biāo)本來源、固定于保存，結(jié)果判斷；非標(biāo)記酶免疫組化的常見類型及原理、親和組織化學(xué)技術(shù)的定義及分類（重點）。3.了解：常見親和組織化學(xué)技術(shù)的原理、優(yōu)缺點及應(yīng)用。能力目標(biāo)掌握抗原的修復(fù)方法，免疫組化標(biāo)本的采集、固定于保存、結(jié)果判斷。思政-素質(zhì)目標(biāo)責(zé)任心、質(zhì)控、生物安全意識、臨床免疫學(xué)思維教學(xué)目標(biāo)目錄概述一免疫組化技術(shù)基本知識二酶免疫組織化學(xué)檢驗技術(shù)三熒光免疫組織化學(xué)檢驗技術(shù)四親和組織化學(xué)檢驗技術(shù)五其他免疫組織化檢驗技術(shù)六免疫組化技術(shù)基本知識二一、標(biāo)本制作標(biāo)本制作是獲得良好的免疫細胞組織化學(xué)分析的保障，良好的細胞和組織學(xué)結(jié)構(gòu)將有助于抗原的準確顯示和定位。

（一）標(biāo)本的主要來源主要有：①活體組織②各種體液及穿刺液③培養(yǎng)細胞等

（二）標(biāo)本的固定與保存

1．組織材料的固定目的

①防止組織細胞的死后變化，以保持其固有形態(tài)②使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)③使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，以便染色后易于鑒別和觀察④固定劑兼有硬化作用，使組織硬化，便于制片⑤防止細胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)⑥經(jīng)過固定的組織能對染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便于辨認。

2．固定劑的選擇最佳固定劑的標(biāo)準①最好地保持細胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)②最大限度地保存抗原的免疫活性

3．固定方法固定方法常用①浸泡法—主要適用于活檢和手術(shù)標(biāo)本以及其它不能進行灌注的組織固定。②灌注法—適用于動物實驗研究。（三）玻片的處理玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步驟之一一般用免疫組織化學(xué)的載玻片均需涂一定的黏合劑，常用的切片黏合劑有樹脂膠、多聚賴氨酸和防脫片劑（四）切片方法的選擇二、抗原處理（一）進行抗原的暴露和修復(fù)的原因1.固定液的影響2.抗體制備的影響

（二）抗原的暴露主要采用酶消化的方法在選擇酶消化時，應(yīng)針對要顯示的不同的抗原成分而選用不同的酶

在日常工作中用胰蛋白酶消化即可

（三）熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)抗原修復(fù)是以高溫、高壓對常規(guī)固定石蠟切片進行抗原修復(fù)以提高抗原抗體的陽性檢出率

微波處理法水浴鍋法壓力鍋法三、抗體處理抗體是免疫組織化學(xué)技術(shù)的首要試劑

（一）抗體的選擇具有高度特異性和穩(wěn)定性的優(yōu)質(zhì)抗體

（二）抗體的稀釋抗原抗體反應(yīng)須有適當(dāng)?shù)谋壤?，過量或不足均不能達到預(yù)期結(jié)果

（三）抗體的合理保存要特別注意保持抗體的生物活性

四、常用標(biāo)記物（一）熒光素如：異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明等（二）酶如：辣根過氧化物酶(HRP)

（三）生物素-親和素系統(tǒng)（四）免疫金標(biāo)記技術(shù)（五）免疫鐵蛋白技術(shù)五、免疫組織化學(xué)技術(shù)的結(jié)果判斷（一）對照染色設(shè)計為了保證免疫組織化學(xué)染色的準確性，證明和肯定陽性結(jié)果的特異性，排除某些非特異性染色，通常需針對第一抗體設(shè)立對照。1.陽性對照用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時進行免疫組織化學(xué)染色。目的是證實所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。

2.陰性對照用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對照。目的是排除假陽性。3.陰性試劑對照是指用于證實在免疫組化染色中所用試劑（尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性）而設(shè)立的同步免疫染色對照，包括有：空白對照、替代對照、吸收試驗和抑制試驗等。4.自身對照是指在同一標(biāo)記切片上的自身組織成分的陰性背景對照。

（二）陽性結(jié)果陽性細胞的顯色可位于細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核免疫顯色強度和陽性細胞密度是定性、定量指標(biāo)陽性細胞的著色形態(tài)（如胞膜型、胞核型、胞質(zhì)(漿)型等）及組織分布特點（如局灶型、彌漫型、片塊型等）主要是定位指標(biāo)哪怕只有少數(shù)細胞陽性（只要是抗原所在部位）也應(yīng)視為陽性表達（三）陰性結(jié)果陰性結(jié)果不能簡單視為抗原不表達，由于染色方法靈敏度有高低之分，有時可因靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)。（四）特異性顯色和非特異性顯色的鑒別

1.分布位置

特異性反應(yīng)必須分布于特定抗原部位非特異性反應(yīng)無一定的分布規(guī)律

2.顯色強度特異性反應(yīng)由于細胞內(nèi)抗原含量不同，顯色強度不一。陽性細胞的染色常定位于細胞，并與陰性細胞間有明顯間隔，而非特異性染色常不限于單個細胞，常為成片的細胞。3.其他在過大的組織塊，中心固定不良也會導(dǎo)致非特異性顯色。

六、質(zhì)量控制