23.2 淋巴細胞數量及功能檢測講解

第二十三章

免疫細胞及其功能檢驗技術知識目標1.掌握：單個核細胞和淋巴細胞及其亞群的分離純化；T細胞及其亞群的表面標志和功能檢測方法；B細胞功能檢測方法和原理；NK細胞的表面標志。2.熟悉：NK細胞功能的檢測方法和原理。3.了解：中性粒細胞、巨噬細胞功能檢測方法和原理。能力目標掌握密度梯度離心法分離外周血單個核細胞的操作流程；熟悉FCM和磁珠分離法分離淋巴細胞及其亞群的操作方法。思政-素質目標責任心、質控、生物安全意識、臨床免疫學思維教學目標目錄免疫細胞的分離與純化一淋巴細胞數量及功能檢測二吞噬細胞功能檢測三許多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴細胞數量和功能變化。數量檢測：根據淋巴細胞及其亞群的表面標志。功能測定：包括體內試驗和體外試驗。免疫細胞的分離與純化二一、T細胞數量及功能檢測（一）T細胞的數量檢測根據T細胞表面CD分子檢測：（1）間接熒光免疫法（2）免疫組織化學法：①酶標（ABC法、APAAP法）②金標法（即IGSS法）間接熒光免疫法（二）T細胞功能檢測T細胞增殖試驗：形態(tài)學法、3H-TdR摻入法、MTT法CTL介導的細胞毒試驗：51Cr釋放法抗原特異性T細胞定量檢測：MHC-抗原肽四聚體技術淋巴細胞內細胞因子檢測：流式細胞術體內試驗：結核菌素試驗、PHA皮膚試驗PBMCPHA5％CO2、

37℃培養(yǎng)72h細胞涂片染色顯微鏡檢查該法簡便易行、容易在基層推廣，但主觀因素影響大。形態(tài)學法T細胞增殖試驗未轉化淋巴細胞轉化的淋巴母細胞轉化率（％）＝轉化的淋巴細胞數計數的淋巴細胞總數X100％培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞抗凝全血分離液離心過濾測量放射性3H-TdR摻入法靈敏度高客觀性好原理：外周血T細胞

PHA發(fā)生增殖

MTT含藍色甲顆粒的T細胞

MTT

PHA有機溶劑測吸光度（A）值

計算SI判定細胞增殖結果(SI≧2具有意義)MTT法操作簡便無放射污染51Cr釋放法淋巴細胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細胞腫瘤細胞破壞51Cr釋放測定γ射線CTL介導的細胞毒試驗原理根據T細胞活化的雙識別原理，用生物工程技術將MHC分子在體外組裝，并結合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子復合物，結合流式細胞儀定量檢測抗原特異性T細胞。TMHC-抗原肽四聚體技術MHC-肽四聚體技術淋巴細胞內細胞因子檢測實驗原理:用刺激劑體外激活淋巴細胞，用蛋白轉運抑制劑如莫能霉素阻止細胞因子分泌到細胞外，細胞內蛋白質轉運方式被打亂，引起細胞因子向高爾基體積聚，用流式細胞儀測定淋巴細胞內的細胞因子種類，確定Th1/Th2細胞的百分率。分泌的細胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++Thl和Th2分泌的細胞因子二、B細胞數量及功能檢測（一）B細胞數量檢測根據B細胞表面標志進行檢測：（1）mIg的檢測：免疫熒光、免疫組化（2）

CD分子的檢測：檢測CD19、CD20、CD21、CD22、

CD29以及CD5等（3）小鼠紅細胞受體的檢測：花環(huán)試驗（二）B細胞功能檢測B細胞增殖試驗：3H-TdR摻入法、MTT法（刺激物：小鼠用LPS；人用SPA的金黃色葡萄球菌菌體或抗IgM抗體）B細胞抗體產生能力檢測：溶血空斑試驗、ELISPOT經典溶血空斑試驗1.SRBC致敏的B細胞與SRBC在凝膠介質中混勻；2.抗體形成細胞(Antibodyformingcell,AFC)周圍的SRBC與AFC產生的抗體結合而被致敏；3.加入豚鼠新鮮補體，致敏SRBC激活補體而溶解，在AFC周圍出現肉眼可見的溶血空斑；4.計算溶血空斑的數目。溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗抗體產生B細胞抗原包被酶聯(lián)抗抗體凝膠底物顯色可在單細胞水平上檢測B產生抗體和T細胞分泌細胞因子三、NK細胞數量及功能檢測（一）NK細胞數量檢測根據NK細胞表面標志進行檢測：

CD分子的檢測：檢測CD3、CD56、CD16等（CD3-CD56+CD16+）