28.3HLA分型技術(shù)講解

器官移植及免疫學檢驗教學目標1.掌握：

移植抗原的種類、HLA分型的方法（重難點）；預(yù)防移植排斥反應(yīng)的免疫學檢測（重難點）。2.熟悉：器官移植的概念和種類、移植排斥反應(yīng)的分類（難點）；移植后的免疫學檢測。3.了解：移植排斥反應(yīng)的發(fā)生機制。知識目標技能目標思政-素質(zhì)目標學會常用的HLA分型及交叉配型的方法。責任心、質(zhì)控及生物安全意識、臨床思維一器官移植概述三HLA分型技術(shù)四預(yù)防移植排斥反應(yīng)的免疫學措施五移植后的免疫監(jiān)測六器官移植面臨的主要問題和解決方案設(shè)想二移植排斥反應(yīng)血清學分型細胞學分型基因分型

三HLA分型技術(shù)SD抗原

HLA-ABCHLA-DRDQ補體依賴的細胞毒(CDC)試驗一、HLA血清學分型技術(shù)

將待檢淋巴細胞與一系列已知抗HLA標準分型血清混合后，抗體會特異性結(jié)合表達相應(yīng)HLA抗原的淋巴細胞，在補體的作用下，引起細胞死亡，死亡的細胞可被臺盼藍等染料染色，而活細胞由于細胞膜完整不著色，根據(jù)死亡細胞的百分比，判定其HLA的型別。1.CDC試驗原理2.流式細胞儀分析技術(shù)LD抗原

HLA-D和DP

混合淋巴細胞培養(yǎng)(MLC)二、HLA細胞學分型技術(shù)

兩個基因型不同個體的淋巴細胞，在體外進行混合培養(yǎng)時，由于彼此的HLA不同，能相互刺激導致雙方淋巴細胞活化增殖和分化，進而表現(xiàn)形態(tài)學的變化和細胞的增殖，可通過形態(tài)學或3H-TdR滲入試驗來檢測淋巴細胞反應(yīng)的強度，從而判定其HLA型別。

單向MLC和雙向MLCMLC原理1.RFLP:限制性片段長度多態(tài)性分析2.PCR-SSOP：序列特異性寡核苷酸探針-PCR3.PCR-SSP：序列特異性引物-PCR4.PCR-SSCP：單鏈構(gòu)象特異性-PCR5.SBT分型法：基于序列的HLA分型法6.多熒光微珠免疫分析7.基因芯片三、HLA基因分型技術(shù)

不同個體間的HLA復合體存在核苷酸堿基序列的差異，這種差異造成限制性內(nèi)切酶識別位置及酶切位點數(shù)目的不同，用一組限制性內(nèi)切酶消化、識別、切割這些位點，產(chǎn)生數(shù)量和長度不一的DNA酶解片段，經(jīng)瓊脂糖電泳或用特異性探針與酶解片段進行雜交即可確定HLA的基因型別。也可先對DNA片段進行體外PCR擴增，然后再進行RFLP分析，即PCR-RFLP。1.PCR-RFLP

先對HLA基因片段進行PCR擴增，然后將擴增片段轉(zhuǎn)移至NC膜或尼龍膜上，然后與用放射性核素或酶、地高辛等標記的寡核苷酸探針進行雜交，若待檢DNA與探針序列互補，則兩者結(jié)合，從而確定HLA的基因型別。2.PCR-SSOP

根據(jù)各型別HLA核苷酸堿基序列差異，設(shè)計出一套HLA等位基因的序列特異性引物，對待測DNA進行PCR擴增，因TaqDNA聚合酶沒有3′→5′核酸內(nèi)切酶活性，引物3′端最后一個堿基是否與模板配對決定著能否擴增出產(chǎn)物。若將引物的3′端最后一個堿基設(shè)計在正好有差異的那個堿基序列上，則擴增產(chǎn)物僅需常規(guī)瓊脂糖電泳，根據(jù)特異產(chǎn)物存在與否即可直接對HLA進行分型。3.PCR-SSP

用PCR擴增特定的靶序列,經(jīng)變性使之成為兩條單鏈,然后在無變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。單鏈DNA如果存在堿基差異,即使一個堿基的不同,也會表現(xiàn)出電泳遷移率的不同,據(jù)此可將不同型別的HLA區(qū)分開,達到分型的目的。4.PCR-SSCP

首先用PCR擴增HLA的DNA片段，擴增產(chǎn)物進行純化和測序，將此序列與HLA基因庫的DNA已知序列進行比較，即可獲得HLA的基因型別。最可靠也最徹底的基因分型方法。5.SBT分型法

用標記有生物素的特異性引物分別擴增HLA-A、B、DR等基因座位的特異性片段，擴增產(chǎn)物與已知的寡核苷酸探針（事先包被在不同顏色的磁珠上）進行雜交，洗脫沒有結(jié)合的DNA片段，再與熒光素標記的親和素結(jié)合，多熒光微珠在流式細胞儀上進行結(jié)果判讀，若擴增的DNA片段能與探針結(jié)合則發(fā)熒光，不結(jié)合則無熒光。6.多熒光微珠免疫分析

首先用PCR擴增獲得HLA的DNA片段，用放射性核素或熒光素標記擴增的DNA分子，再與預(yù)先點