高效液相色譜法及其在中藥分析中的應(yīng)用

關(guān)于高效液相色譜法及其在中藥分析中的應(yīng)用26.03.2024126.03.20242慢中等快色譜分離Temporalcourse淋洗液第2頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.20243按溶質(zhì)在分離過程中的原理：吸附色譜分配色譜離子交換色譜體積排阻色譜親和色譜液相色譜的分類第3頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.20244按色譜固定相的形式：平板色譜（平面色譜）柱色譜按分離的壓力高壓液相色譜（高效液相色譜）中壓液相色譜常壓液相色譜液相色譜的分類第4頁,共74頁，2024年2月25日，星期天H－dp關(guān)系圖第5頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.20246一般也把吸附色譜法稱為液固色譜法。液固色譜法的固定相一般為固體吸附劑，常用的是：碳酸鈣、硅膠、氧化鋁、氧化鎂、活性炭等。其中硅膠最為常用。吸附色譜對中等分子量的油溶性樣品可獲得最佳的分離，而對強(qiáng)極性或離子型的樣品，有時(shí)會發(fā)生不可逆吸附，不能得到滿意的結(jié)果。液固色譜法第6頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.20247吸附劑一般為多孔性的物質(zhì)，在它們的表明存在著分散的吸附中心，溶質(zhì)分子和流動相分子在吸附劑表面的活性中心上進(jìn)行競爭，同時(shí)不同溶質(zhì)之間和同一溶質(zhì)的不同官能團(tuán)之間液也存在競爭。競爭的綜合結(jié)果就是形成不同溶質(zhì)在吸附劑表面吸附、解吸平衡?；驹恚旱?頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.20248吸附解吸X表示溶質(zhì)分子，下標(biāo)m為流動相，s為固定相M表示流動相分子，下標(biāo)m為流動相，s為固定相n為被溶質(zhì)分子取代的流動相分子數(shù)目用一個(gè)式子表示如下：第8頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202410鍵合相固定相：在硅膠的表明用鍵合反應(yīng)把官能基團(tuán)鍵合到表面上，解決固定相流失的問題。正相色譜：流動相極性比固定相極性小反相色譜：流動相極性比固定相極性大鍵合相液相色譜第10頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202412高效液相色譜——固定相

化學(xué)鍵合相硅膠

octadecylSi-[CH2]17-CH3C18octylSi-[CH2]7-CH3C8cyanopropylSi-[CH2]3-CNCNaminopropylSi-[CH2]3-NH2NH2

第12頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202413固定相的其他性能

載體的形狀球形無定形粒徑3~10μm,1.7~2.5μm孔徑<150?分析分子量<2000的化合物;>300?分析分子量>2000的化合物表面積鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度含碳量第13頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202414一般認(rèn)為鍵合相色譜的機(jī)理分配色譜機(jī)理，也有人認(rèn)為它是吸附色譜機(jī)理，其實(shí)應(yīng)該是有兩種成分在里面，現(xiàn)在又有疏溶劑理論等機(jī)理的提出。第14頁,共74頁，2024年2月25日，星期天高效液相色譜儀器第15頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共74頁，2024年2月25日，星期天儲存和輸送液體設(shè)備進(jìn)樣系統(tǒng)柱系統(tǒng)檢測器控制和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第17頁,共74頁，2024年2月25日，星期天選擇流動相的原則：保持色譜柱的穩(wěn)定性化學(xué)惰性適合所用的檢測器對樣品有一定的溶解能力清洗、更換方便、毒性小沸點(diǎn)、粘度等物理性質(zhì)合適第18頁,共74頁，2024年2月25日，星期天反相色譜最常用的流動相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、異丙醇等。水－甲醇體系：大約50％水的時(shí)候粘度最大水－乙腈體系：35％水的時(shí)候粘度最大。第19頁,共74頁，2024年2月25日，星期天存放流動相的容器一定要惰性的，并且有機(jī)溶劑要避光。輸液泵要求流量平穩(wěn),可以調(diào)節(jié)的流量范圍寬，耐高壓。一般是柱塞往復(fù)泵。第20頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202421第21頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202422流動相的混合輸入和洗脫方式離線混合配制濾過脫氣

在線混合低壓在線混合高壓在線混合洗脫等度洗脫梯度洗脫第22頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202423高效液相色譜儀器——泵系統(tǒng)第23頁,共74頁，2024年2月25日，星期天進(jìn)樣系統(tǒng)包括手動進(jìn)樣和自動進(jìn)樣無論手動進(jìn)樣還是自動進(jìn)樣，都要通過六通閥。六通閥進(jìn)樣是高壓系統(tǒng)的需要，既不影響系統(tǒng)的正常運(yùn)行又能夠讓樣品進(jìn)到系統(tǒng)中去。第24頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202425第25頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202426高效液相色譜儀器——進(jìn)樣器第26頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202427反相鍵合相色譜柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。柱溫箱的溫度控制要求比較精確，因?yàn)榱黧w的粘度受溫度的影響較大。柱系統(tǒng)包括色譜柱和柱溫箱第27頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202428測量原理不同分類：光學(xué)性質(zhì)檢測器電學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)檢測器熱學(xué)性質(zhì)檢測器液相色譜檢測器第28頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202429紫外－可見光檢測器示差折光檢測器熒光檢測器蒸發(fā)光散射檢測器化學(xué)發(fā)光檢測器光學(xué)性質(zhì)檢測器：第29頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202430高效液相色譜儀器——檢測器第30頁,共74頁，2024年2月25日，星期天紫外吸收檢測器有三種類型：固定波長紫外吸收檢測器：低壓汞燈提供固定254nm或280nm紫外光?？勺兌嗖ㄩL檢測器：氘燈做光源，光柵分光光二極管陣列檢測器photo－diode－arraydetector（PDAD，PDA,DAD）：鎢燈和氘燈組合光源，進(jìn)入檢測池的不是單色光，而是一段紫外波長上的光。PDA可以輔助定性。第31頁,共74頁，2024年2月25日，星期天DAD檢測器3D圖第32頁,共74頁，2024年2月25日，星期天示差折光檢測器（refractiveindexdetectorRID）：溶液的折射率等于溶劑及其中所含各組分溶質(zhì)的折射率與其各自的摩爾分?jǐn)?shù)的乘積之和。RID是通用型的檢測器，但是靈敏度不高。RID不能用于梯度洗脫。第33頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202434蒸發(fā)光散射檢測器第34頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202435安培檢測器電導(dǎo)檢測器庫侖檢測器介電常數(shù)檢測器極譜檢測器電學(xué)和電化學(xué)檢測器：第35頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202436完成數(shù)據(jù)采集和對儀器的控制。工作站：第36頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202437超高效液相色譜儀（UPLC）超高效液相色譜是分離科學(xué)中的一個(gè)全新類別，它給實(shí)驗(yàn)室?guī)砹诵缕娑鴱?qiáng)大的能力。UPLC?借助于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。第37頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202438高效液相色譜法在藥典中的應(yīng)用項(xiàng)目2000版2005版含量測定109527第38頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202439HPLC與TLC比較(2005版)含量測定TLC-SCHPLC藥材和提取物15175中成藥35352第39頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202440HPLC在中藥質(zhì)量分析和檢測中的應(yīng)用有效成分、指標(biāo)成分的檢測；雜質(zhì)或有關(guān)物質(zhì)檢查；添加物或有害殘留物質(zhì)的檢測；中藥指紋譜分析第40頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202441有效成分、指標(biāo)成分的檢測

人參皂苷的檢測第41頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202442Flavones,Flavanones,andFlavanoneGlycosides

PeakIdentification

1.

Naringin

2.

Neohesperidin

3.

Myricetin

4.

Quercetin

5.

Naringenin

6.

KaempferolColumn:AlltimaC18,3μm,100x4.6mm

MobilePhase:A:50mMPotassiumPhosphate,pH2.5B:ACN

Gradient:(Time,%B)(0,20)(15,40)

FlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat280nm

第42頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Ginkgolides

PeakIdentification

1.

GinkgolideJ

2.

GinkgolideC

3.

GinkgolideA

4.

GinkgolideB

Column:NucleosilC18,5μm,250x2.1mm

PartNo.C-6000B

MobilePhase:Water:Methanol:Tetrahydrofuran(70:20:10)

FlowRate:0.2mL/min

Detector:500ELSD

第43頁,共74頁，2024年2月25日，星期天雜質(zhì)或有關(guān)

物質(zhì)檢查第44頁,共74頁，2024年2月25日，星期天添加物或有害殘留物質(zhì)的檢測

OrganophosphatePesticides

PeakIdentification

1.

MethylParathion

2.

Dichlorvos

3.

Ethoprophos

4.

Azinphos

Column:AlltimaHPEPSC18,5μ,150x4.6mm

MobilePhase:(40:60)methanol:water

FlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat214nm

第45頁,共74頁，2024年2月25日，星期天添加物或有害殘留物質(zhì)的檢測

AflatoxinStandards

PeakIdentification

1.

AflatoxinG2

(0.06μg/mL)

2.

AflatoxinG1

(0.20μg/mL)

3.

AflatoxinB2

(0.06μg/mL)

4.

AflatoxinB1

(0.20μg/mL)

Column:InertsilODS-3V,5μ,150x4.6mm

MobilePhase:(50:50)Methanol:WaterFlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat365第46頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202447中藥指紋譜分析第47頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第48頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.2024492005版HPLC方法應(yīng)用有效成分\特征成分含量測定多成分指標(biāo)含量測定多種檢測器應(yīng)用第49頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202450有效成分\特征成分含量測定第50頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202451有效成分\特征成分含量測定第51頁,共74頁，2024年2月25日，星期天多成分指標(biāo)含量測定第52頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202453ELSD檢測方法應(yīng)用第53頁,共74頁，2024年2月25日，星期天銀杏葉提取物中銀杏酸的限量檢查第54頁,共74頁，2024年2月25日，星期天含量樣品以總酸計(jì)ppm以銀杏酸13：0計(jì)ppm樣品10.40.4樣品20.20.2樣品30.40.4樣品43.83.8樣品52728樣品616671662樣品7524522樣品823392333樣品9392390樣品10316315第55頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202456

高效液相色譜法附錄修訂內(nèi)容(2005版)

修訂內(nèi)容和特點(diǎn)：明確了HPLC方法的幾種分離機(jī)制，為分類應(yīng)用提供了基礎(chǔ)；明確了數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（色譜工作站）作為色譜信號記錄;以較大篇幅增加了色譜柱、檢測器、流動相的內(nèi)容，適應(yīng)快速發(fā)展的、日趨成熟的HPLC技術(shù)的要求。第56頁,共74頁，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進(jìn)入檢測器，色譜信號由記錄儀或積分儀記錄。

高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。高效液相色譜法的主要分離機(jī)制有吸附、分配、離子交換和排阻作用。 2000版2005版第57頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202458對儀器的一般要求(2000版)所用的儀器為高效液相色譜儀。色譜柱的填充劑和流動相的組分應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定。常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠，后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。離子交換填充劑，用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等填充劑，用于分子排阻色譜等。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。在用紫外吸收檢測器時(shí)，所用流動相應(yīng)符合紫外分光光度法(附錄ⅤA)項(xiàng)下對溶劑的要求。第58頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202459對儀器的一般要求(2005版)

1

所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。（1）色譜柱最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用于離子交換色譜；凝膠或高分子多孔微球等填充劑用于分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用于對映異構(gòu)體的拆分分析。第59頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202460對儀器的一般要求(2005版)

2

填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響待測物的保留行為和分離效果?？讖皆?50?以下的填料適合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在300?以上的填料。第60頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202461對儀器的一般要求(2005版)3

以硅膠為載體的一般鍵合固定相填充劑適用pH2～8的流動相。當(dāng)pH大于8時(shí)，可使載體硅膠溶解；當(dāng)pH小于2時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用pH大于8的流動相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機(jī)-無機(jī)雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當(dāng)需使用pH小于2的流動相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機(jī)-無機(jī)雜化填充劑等。第61頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202462對儀器的一般要求(2005版)4(2)檢測器最常用的檢測器為紫外吸收檢測器，其他常見的檢測器有二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。紫外、二極管陣列、熒光、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與待測物的質(zhì)量有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測器屬質(zhì)量型檢測器，對結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與待測物的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測器可以同時(shí)記錄待測物在規(guī)定波長范圍內(nèi)的吸收光譜，故可用于待測物的光譜測定和色譜峰純度的檢查。

第62頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202463對儀器的一般要求(2005版)5紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測器的響應(yīng)值與待測物的質(zhì)量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應(yīng)值與待測物的質(zhì)量通常并不呈線性關(guān)系，必要時(shí)需對響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行計(jì)算。不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應(yīng)至少符合紫外-可見分光光度法（附錄ⅣA）項(xiàng)下對溶劑的要求；采用低波長檢測時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相。第63頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202464對儀器的一般要求(2005版)5

（3）流動相由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機(jī)溶劑的比例通常不應(yīng)低于5％，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。

第64頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202465梯度洗脫

按設(shè)定的時(shí)間程序改變流動相系統(tǒng)溶劑組成的比例的洗脫方法.

例:“以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫”(人參)第65頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第66頁,共74頁，2024年2月25日，星期天26.03.202467梯度洗脫以有機(jī)溶劑相作為流動相A，以水相（含酸、鹽等）為流動相B；使用混合流動相的，以含有機(jī)相比例較高的為流動相A，含水比例高的為流動相B。第67頁,共74頁，2024年2月25日，星期天正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。

正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組成的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體的色譜系統(tǒng)并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。但對某些品種，必須用特定適用牌號的填充劑方能滿足分離要求者，可在該品種項(xiàng)下注明。第68頁,共74頁，2024年2月25日，星期天按各品種項(xiàng)下要求對儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。

色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括分離度、理論板數(shù)、重復(fù)性和拖尾因子等四個(gè)指標(biāo)。其中，分離度和重復(fù)性是系統(tǒng)適用