以神經(jīng)氨酸酶為靶點(diǎn)的抗流感病毒先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)

以神經(jīng)氨酸酶為靶點(diǎn)的抗流感病毒先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染性疾病,嚴(yán)重影響了人類的生命健康。近年來,人感染H5N1型高致病性禽流感病例的頻繁出現(xiàn),新型H1N1病毒開始在世界范圍內(nèi)的傳播,H7N9型禽流感病毒首次引起人類的感染,都一度造成了社會的恐慌,流感已經(jīng)成為了一個(gè)全球性的敏感話題。神經(jīng)氨酸酶(NA)是甲型和乙型流感病毒的表面蛋白,在流感病毒的感染和復(fù)制過程中發(fā)揮了重要作用,主要表現(xiàn)在：①催化宿主細(xì)胞表面受體末端的唾液酸與糖蛋白之間糖苷鍵的裂解,促進(jìn)新生病毒從感染的細(xì)胞中釋出；②阻止子代病毒從宿主細(xì)胞釋出后的聚集；③裂解呼吸道黏膜中的唾液酸,阻止病毒滅活并促進(jìn)病毒在呼吸道中的傳播。雖然甲型流感病毒NA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10種亞型,但構(gòu)成其活性中心的氨基酸序列是高度保守的,這使NA成為抗流感病毒藥物設(shè)計(jì)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。自從1999年,zanamivir(商品名Relenza)和oseltamivir(商品名Tamiflu)上市以來,NA抑制劑成為抗流感的主要手段,也成為抗流感藥物領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。隨后,多種結(jié)構(gòu)類型的NA抑制劑相繼被發(fā)現(xiàn),如苯甲酸類、環(huán)戊烷類、吡咯烷類、多聚體類等。另外兩種高效NA抑制劑peramivir(商品名Rapiacta)和Laninamivir(商品名INAVIR)也已經(jīng)在少數(shù)幾個(gè)國家上市。在已獲批準(zhǔn)的NA抑制劑中,口服劑oseltamivir是抗流感的首選藥物,在很多國家及地區(qū)被廣泛使用。最近幾年,針對oseltamivir耐藥的病毒株不斷增多,如H5N1型禽流感病毒和多種季節(jié)性H1N1、H3N2型流感病毒株,這使oseltamivir的臨床應(yīng)用受到一定限制。Zanamivir和peramivir分別通過吸入和靜脈注射方式給藥,雖然使用率低,但也有耐藥病毒株的出現(xiàn)。鑒于目前的抗流感形勢及流感病毒的潛在威脅,開發(fā)新型、高效的NA抑制劑仍具有重要現(xiàn)實(shí)意義。本研究論文應(yīng)用基于受體和配體的合理藥物設(shè)計(jì)原理與方法,共設(shè)計(jì)合成了22類,135個(gè)化合物,經(jīng)兩種抗病毒模型初步篩選,發(fā)現(xiàn)了兩類具有較好抗流感病毒活性的活性先導(dǎo)化合物。論文共分六個(gè)章節(jié),主要包括三部分內(nèi)容,分述如下：第一部分：通過文獻(xiàn)調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)很多天然產(chǎn)物,如黃酮、查爾酮及其他一些多酚類化合物都能夠較好地抑制流感病毒NA的活性,而且在細(xì)胞中還表現(xiàn)出一定的抗流感病毒增殖能力。這些化合物在結(jié)構(gòu)上不符合經(jīng)典NA抑制劑的藥效團(tuán)特征,與oseltamivir、zanamivir等抑制劑也有很大的差別。為了尋找一類結(jié)構(gòu)新穎的NA抑制劑,在本研究中,我們根據(jù)黃酮類NA抑制劑藥效團(tuán)模型,以2,4-二氨基為基本結(jié)構(gòu)片段,建立了一個(gè)結(jié)構(gòu)多樣性的小分子化合物庫。另外,對具有弱NA抑制活性的咖啡酸進(jìn)行修飾,合成了3個(gè)系列衍生物。通過體外抑酶活性篩選及結(jié)構(gòu)優(yōu)化,共得到92個(gè)化合物。其中,只有咖啡酸衍生物具有較高的NA抑制能力,而且在細(xì)胞中也表現(xiàn)出一定的抗病毒能力,例如化合物(G3)、(G4)、(M1)、(M2)和(P2)等。進(jìn)一步的酶抑制動力學(xué)研究表明,本研究發(fā)現(xiàn)的咖啡酸衍生物為非競爭性NA抑制劑,這表明這些化合物與經(jīng)典NA抑制劑的作用位點(diǎn)不同,很可能是通過一種新的結(jié)合方式對NA發(fā)揮抑制作用的。第二部分：本課題組前期發(fā)現(xiàn)了一些具有中等活性的L-羥脯氨酸衍生物類NA抑制劑,在此基礎(chǔ)上,我們根據(jù)五元環(huán)NA抑制劑的結(jié)構(gòu)特征,繼續(xù)對其進(jìn)行研究。①將L-羥脯氨酸環(huán)上C-4位的羥基變?yōu)殡一?在吡咯環(huán)氮原子上引入疏水性基團(tuán)：②在吡咯環(huán)氮原子上引入脒基,將L-羥脯氨酸環(huán)上C-4位的羥基變?yōu)榘被?通過對氨基的化學(xué)修飾,引入疏水基團(tuán)；③在吡咯環(huán)氮原子上引入脒基,將L-羥脯氨酸環(huán)上C-4位的羥基變疊氮,利用Click反應(yīng)引入三氮唑,得到三類新型化合物。體外抑酶試驗(yàn)顯示,這些L-羥脯氨酸衍生物都只具有較微弱的酶抑制活性,與對照藥(oseltamivircarboxylate)相比有很大的差距。分子對接分析發(fā)現(xiàn),這些化合物中引入的基團(tuán)在空間上不能與酶活性中心的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合,這可能是其活性差的主要原因。第三部分：2006年Nature報(bào)道,Group-1的NA(N1,N4,N5和N8)在其活性中心附近有一個(gè)較大的150-cavity,該口袋可以作為一個(gè)輔助結(jié)合位點(diǎn)用于開發(fā)高選擇性的NA抑制劑。根據(jù)這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn),我們以oseltamivir為先導(dǎo)化合物,對其結(jié)構(gòu)中的氨基進(jìn)行修飾,設(shè)計(jì)合成了取代的胍基類(T系列)和仲胺類(U系列)兩個(gè)系列,共31個(gè)化合物,化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)過1H-NMR、13C-NMR和HRMS確證。經(jīng)查閱文獻(xiàn)證實(shí),所合成的目標(biāo)化合物均為新型化合物。體外酶抑制活性試驗(yàn)顯示,本研究合成的oseltamivir衍生物大部分具有N1選擇性,U系列化合物的活性明顯高于T系列?；钚宰詈玫膬蓚€(gè)化合物(U12)和(U19)對N1的抑制活性比oseltamivir羧酸鹽提高了8倍。在雞胚試驗(yàn)中,(U12)也被發(fā)現(xiàn)具有很好的體內(nèi)抗流感病毒活性。通過計(jì)算機(jī)模擬對接發(fā)現(xiàn),(U12)中C-5位仲胺氮原子上的聯(lián)苯甲基片段能夠很好地與150-cavity結(jié)合,而其它部分則占據(jù)酶活性中心,與晶體結(jié)構(gòu)中oseltamivir羧酸鹽的空間結(jié)構(gòu)大體上重合,這證明150-cavity完全可以作為一個(gè)輔助結(jié)合區(qū)用于開發(fā)高活性、高選擇性NA抑制劑。結(jié)論與總結(jié)：本研究利用兩種藥物設(shè)計(jì)思路分別發(fā)現(xiàn)了兩類新型NA抑制劑,咖啡酸類和oseltamivir衍生物類?？Х人岜旧砭哂卸喾N生物活性,我們基于咖啡酸設(shè)計(jì)的部分化合物對于流感病毒在酶和細(xì)胞水平上都表現(xiàn)出較好的活性,優(yōu)于大部分報(bào)道過的活性天然產(chǎn)物。咖啡酸衍生物是一類全新的NA抑制劑,值得進(jìn)一步進(jìn)行研究。高致病性H5N1型禽流感病毒和H1N1型流感病毒是兩種對人類威脅最大的流感病毒,自從150-cavity被發(fā)現(xiàn)以來,選擇性NA抑制劑的研究一直備受關(guān)注,然而至今未有進(jìn)展。我們通過合理藥物設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)的