TRB3AMPK信號(hào)通路介導(dǎo)肥胖和糖尿病狀態(tài)下脂肪組織功能紊亂的機(jī)制研究

TRB3/AMPK信號(hào)通路介導(dǎo)肥胖和糖尿病狀態(tài)下脂肪組織功能紊亂的機(jī)制研究研究背景肥胖和2型糖尿病均是與生活方式密切相關(guān)的代謝疾病,二者在全球呈廣泛流行趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界約有10億人超重或過(guò)度肥胖。胰島素抵抗是肥胖和2型糖尿病的重要特征。脂肪組織功能紊亂在胰島素抵抗(insulinresistance,IR)發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。因此,探討肥胖和2型糖尿病狀態(tài)下脂肪組織胰島素抵抗產(chǎn)生的深層機(jī)制,建立以機(jī)制為導(dǎo)向的治療措施成為近年來(lái)防治肥胖和糖尿病發(fā)生的研究熱點(diǎn)。脂肪組織與胰島素抵抗密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),脂肪組織不僅僅是一個(gè)能量?jī)?chǔ)存器官,還是重要的內(nèi)分泌器官;作為機(jī)體最大的內(nèi)分泌器官,脂肪組織通過(guò)分泌脂肪因子參與調(diào)節(jié)體內(nèi)胰島素靶器官的生物效應(yīng)。脂肪組織在調(diào)節(jié)免疫和維持機(jī)體糖脂代謝平衡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。脂肪組織的形態(tài)特性、分布、大小、分化程度、分泌功能等與胰島素敏感性息息相關(guān),然而肥胖和糖尿病狀態(tài)下,脂肪組織功能紊亂的具體分子機(jī)制尚不清楚。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)在脂肪組織功能紊亂的發(fā)生、發(fā)展中具有不可忽視的作用。機(jī)體的脂肪組織、肝臟組織、骨骼肌以及胰腺當(dāng)中均存在著大量的AMPK,其活化過(guò)程主要是通過(guò)分解代謝功能的開(kāi)啟以及合成代謝功能的關(guān)閉來(lái)實(shí)現(xiàn),從而使機(jī)體內(nèi)的代謝與能量平衡處于一種穩(wěn)態(tài);所以目前AMPK被普遍認(rèn)為是調(diào)控機(jī)體能量代謝平衡“總開(kāi)關(guān)”;現(xiàn)有的研究已經(jīng)表明,AMPK廣泛介入了機(jī)體主要組織的糖脂代謝調(diào)控過(guò)程,很有可能會(huì)成為防治肥胖和2型糖尿病的一個(gè)新靶點(diǎn)。TRB3是調(diào)節(jié)AMPK信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。TRB3基因具有廣泛的生物活性,與機(jī)體的糖脂代謝以及IR存在著密切的聯(lián)系。目前已經(jīng)有大量研究表明,TRB3具有直接調(diào)節(jié)AMPK的功能,是AMPK信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。因此我們推測(cè)TRB3可能通過(guò)抑制AMPK活性,從而加重脂肪組織糖脂代謝功能紊亂,進(jìn)而誘導(dǎo)肥胖和糖尿病患者胰島素抵抗的發(fā)生和發(fā)展。本研究以胰島素抵抗脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染,誘導(dǎo)TRB3基因沉默,綜合運(yùn)用油紅O染色和分子生物學(xué)技術(shù)研究TRB3基因沉默后脂肪細(xì)胞功能紊亂的變化,探討TRB3/AMPK信號(hào)傳導(dǎo)通路在脂肪細(xì)胞胰島素抵抗中的作用及其可能的分子機(jī)制。研究目的通過(guò)采用高糖高胰島素以及軟脂酸刺激誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞,使之出現(xiàn)胰島素抵抗,從細(xì)胞水平探討TRB3基因沉默對(duì)胰島素抵抗(IR)和AMPK信號(hào)通路的影響。實(shí)驗(yàn)方法1.誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞購(gòu)自ATCC。采用“雞尾酒法”,應(yīng)用3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(IBMX)、胰島素和地塞米松將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞。成熟的脂肪細(xì)胞經(jīng)過(guò)低糖無(wú)血清DMEM的24h預(yù)處理,隨機(jī)分為:對(duì)照組和胰島素抵抗組(IR組);對(duì)照組和游離脂肪酸組(FFA組)。對(duì)照組使用低糖的DMEM培養(yǎng),胰島素抵抗組應(yīng)用高糖高胰島素刺激分化成熟的脂肪細(xì)胞,即向分化成熟的脂肪細(xì)胞中加入高糖(25mM)高胰島素(10nM)培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h;游離脂肪酸組應(yīng)用軟脂酸刺激分化成熟的脂肪細(xì)胞,即向分化成熟的脂肪細(xì)胞中加入軟脂酸培養(yǎng)基(0.75mM軟脂酸),繼續(xù)培養(yǎng)24h。2.油紅O染色分化成熟的脂肪細(xì)胞使用PBS輕輕沖洗兩遍,4%多聚甲醛固定15min。然后,PBS洗去多聚甲醛,油紅O染液染色30min。多余的染液使用PBS漂去,使用顯微鏡拍照。3.甘油三酯含量測(cè)定提取各組脂肪細(xì)胞中的甘油三酯,應(yīng)用TriglycerideQuantificationKit(Abcam)測(cè)定各組脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TriglycerideTG)的含量4.脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)將每一組脂肪細(xì)胞采用培養(yǎng)基(10%FBS+1%2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(2-NBDG)+lnMinsulin)培養(yǎng)30min,棄培養(yǎng)基,PBS重懸細(xì)胞,將細(xì)胞以l×l04/每孔種在96孔板。在485nm激發(fā)波長(zhǎng)和535nm發(fā)射波長(zhǎng)下對(duì)每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。5.TRB3-siRNA腺病毒體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)脂肪細(xì)胞隨機(jī)分為游離脂肪酸空載體組(FFA+vehicle)、游離脂肪酸TRB3siRNA組(FFA+TRB3siRNA)、胰島素抵抗空載體組(IR+vehicle)、胰島素抵抗TRB3siRNA組(IR+TRB3siRNA),胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)方法同上。FFA+TRB3siRNA組、IR+TRB3siRNA組的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)加入TRB3腺病毒,培養(yǎng)72h后獲取脂肪細(xì)胞。6.RealTime-PCR檢測(cè)收集新鮮的成熟脂肪細(xì)胞,應(yīng)用Trizol法提取mRNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光RealTime-PCR技術(shù)檢測(cè)各組脂肪細(xì)胞中TRB3的mRNA相對(duì)表達(dá)量。7.Westernblot檢測(cè)獲取新鮮成熟脂肪細(xì)胞,提取脂肪細(xì)胞蛋白質(zhì),應(yīng)用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)脂肪細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)、胰島素受體底物-1(IRS-1)、TRB3、磷酸化AMPK(p-AMPK)以及AMPK的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型建立與對(duì)照組相比,高糖+高胰島素刺激24h后,脂肪細(xì)胞IRS-1和GLUT4蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.001);與對(duì)照組相比,高糖+高胰島素刺激24h后,脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取明顯下降(P<0.00l)。與對(duì)照組相比,軟脂酸刺激脂肪細(xì)胞24h后,脂肪細(xì)胞的IRS-1和GLUT4蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.001);與對(duì)照組相比,軟脂酸刺激24h后,脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取明顯下降(P<0.001)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,高糖+高胰島素刺激培養(yǎng)分化成熟的脂肪細(xì)胞,出現(xiàn)了胰島素抵抗;軟脂酸刺激培養(yǎng)分化成熟的脂肪細(xì)胞也出現(xiàn)了胰島素抵抗。2.胰島素抵抗脂肪細(xì)胞脂質(zhì)含量檢測(cè)油紅O染色顯示,與對(duì)照組相比,高糖+高胰島素刺激24h后,脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴體積顯著增大,脂滴數(shù)量明顯增多。甘油三酯試劑盒檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,高糖+高胰島素刺激24h后,脂肪細(xì)胞中的TG含量顯著增多(P<0.001)。油紅O染色顯示,與對(duì)照組相比,軟脂酸刺激培養(yǎng)24h后,脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴體積明顯增大,脂滴數(shù)量明顯增多。甘油三酯試劑盒檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,軟脂酸刺激24h后,脂肪細(xì)胞中的TG含量明顯增多(P<0.001)。上述結(jié)果說(shuō)明高糖高胰島素或軟脂酸刺激后脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加,提示出現(xiàn)代謝功能障礙。3.胰島素抵抗對(duì)TRB3/AMPK信號(hào)通路的影響與對(duì)照組相比,IR組脂肪細(xì)胞TRB3蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.001),AMPK磷酸化水平顯著降低(P<0.001)與對(duì)照組相比,FFA組脂肪細(xì)胞TRB3蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.001),AMPK磷酸化水平顯著降低(P<0.001)。上述結(jié)果說(shuō)明胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞TRB3通路激活,抑制AMPK磷酸化。4.TRB3siRNA轉(zhuǎn)染抑制脂肪細(xì)胞TRB3表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示:TRB3siRNA組脂肪細(xì)胞TRB3mRNA基因的表達(dá)相對(duì)于空載體組顯著下降(P<0.001)。Westernblot結(jié)果顯示:TRB3siRNA組脂肪細(xì)胞TRB3的蛋白表達(dá)水平相對(duì)于空載體組顯著降低(P<0.01)。說(shuō)明TRB3腺病毒轉(zhuǎn)染能夠有效下調(diào)TRB3表達(dá)。5.TRB3基因沉默改善脂肪細(xì)胞胰島素抵抗與IR+vehicle組相比,IR+TRB3siRNA組脂肪細(xì)胞IRS-1與GLUT4蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)。與FFA+vehicle組相比,FFA+TRB3siRNA組脂肪細(xì)胞IRS-1與GLUT4蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)。以上結(jié)果顯示,TRB3基因沉默改善脂肪細(xì)胞胰島素抵抗。6.TRB3基因沉默后AMPK信號(hào)通路的改變與IR+vehicle組相比,IR+TRB3siRNA組脂肪細(xì)胞中AMPK的磷酸化程度顯著升高(P<0.001)。與FFA+vehicle組相比,FFA+TRB3siRNA組脂肪細(xì)胞中AMPK的磷酸化水平顯著上升(P<0.001)。上述結(jié)果說(shuō)明TRB3基因沉默后AMPK磷酸化增加,從而改善脂肪細(xì)胞胰島素抵抗。結(jié)論1.高糖+高胰島素或軟脂酸刺激下脂肪細(xì)胞IRS-1和GLUT4的蛋白表達(dá)水平均明顯降低,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力顯著下降,甘油三酯含量明顯增加,結(jié)果提示我們成功構(gòu)建了胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞模型。2.胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞TRB3蛋白表達(dá)水平顯著增加;TRB3基因沉默后,AMPK的磷酸化水平顯著增加,脂肪細(xì)胞代謝功能異常得到明顯改善,胰島素抵抗減輕。研究背景肥胖能夠引起胰島素抵抗,而胰島素抵抗是導(dǎo)致2型糖尿病的重要原因。脂肪組織作為胰島素抵抗的始發(fā)部位,在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。脂肪組織功能紊亂在肥胖引起的胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用。脂肪組織不僅是儲(chǔ)存游離脂肪酸的場(chǎng)所,而且具有復(fù)雜的內(nèi)分泌功能,產(chǎn)生大量的激素和細(xì)胞因子,在糖脂代謝的調(diào)節(jié)中具有重要作用,與代謝綜合征、糖尿病和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在肥胖和糖尿病狀態(tài)下,脂肪組織功能紊亂,是促炎因子的豐富來(lái)源,這些促炎因子可直接引起血管損傷、胰島素抵抗和動(dòng)脈粥樣硬化。然而,調(diào)控脂肪組織功能紊亂的具體分子機(jī)制尚不清楚。脂肪組織與胰島素抵抗密切相關(guān)。脂肪組織分為內(nèi)臟脂肪組織、皮下脂肪組織和棕色脂肪組織,以往研宄多集中于各類脂肪組織對(duì)胰島素抵抗的作用,較少有研究對(duì)不同類型的脂肪對(duì)胰島素抵抗的作用進(jìn)行比較,有研究顯示,與皮下脂肪組織相比,內(nèi)臟脂肪組織的增加與胰島素抵抗關(guān)系更為密切;同時(shí),棕色脂肪組織亦與胰島素抵抗密切相關(guān)。脂肪組織胰島素抵抗的產(chǎn)生與脂肪組織功能紊亂有關(guān),但脂肪組織功能紊亂的機(jī)制并不清楚。TRB3可能是介導(dǎo)脂肪組織功能紊亂的關(guān)鍵分子。流行病學(xué)顯示,在胰島素抵抗的肥胖患者和2型糖尿病患者中TRB3水平顯著增加。我們論文一研宄發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)的胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞TRB3表達(dá)顯著上調(diào),而TRB3表達(dá)下調(diào)后脂肪細(xì)胞胰島素敏感性改善。因此,TRB3可能是參與脂肪組織功能紊亂和胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵基因。近年研宄證實(shí),TRB3是AMPK信號(hào)通路上游的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。AMPK功能失調(diào)可導(dǎo)致脂肪組織功能紊亂和胰島素抵抗的發(fā)生。然而,TRB3/AMPK信號(hào)通路在肥胖和2型糖尿病大鼠脂肪組織功能紊亂中的作用尚不清楚。在本研究中,我們成功建立了肥胖和2型糖尿病大鼠模型,探討TRB3基因沉默是否通過(guò)調(diào)控糖脂代謝和胰島素抵抗改善脂肪組織功能紊亂及其相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法1.動(dòng)物模型的建立(1)健康雄性SD大鼠40只,購(gòu)買于山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,大鼠體逋范圍120g±20g;隨機(jī)將SD雄性大鼠(n=40)分為四組:高脂飲食空載體組(HF+vehicle)、高脂飲食TRB3siRNA組(HF+TRB3siRNA)、糖尿病空載體組(DM+vehicle)、糖尿病TRB3siRNA組(DM+TRB3siRNA),按照我們以往實(shí)驗(yàn)研宄方法,采用高脂飲食構(gòu)建肥胖大鼠模型,采用高脂飲食輔以小劑量STZ(27.5mg/kg)構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型。2.TRB3-siRNA腺病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)大鼠造模成功后12周,給予HF+TRB3siRNA組、DM+TRB3siRNA組大鼠頸靜脈注射TRB3腺病毒,給予HF+空載體組以及DM+空載體組大鼠頸靜脈注射pAdxsi空病毒載體,注射2周以后再經(jīng)大鼠的頸靜脈應(yīng)用同樣方法補(bǔ)充注射一次,TRB3腺病毒注射4周后實(shí)施安樂(lè)死并留取標(biāo)本。3.大鼠血液生化指標(biāo)的測(cè)定各組動(dòng)物禁食12h后,頸靜脈取血,分別檢測(cè)各組大鼠血清中TG(Triglyceride)、總膽固醇(Totalcholesterol,TC)、空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG)和空腹胰島素(fastinginsulin,FINS)水平,并根據(jù)公式(ISMn(FBGxFINS)-1)計(jì)算出大鼠的胰島素敏感指數(shù)(insulinsensitivityindex,ISI)。4.Westemblot冰上裂解脂肪和肝臟組織,Bradford法檢測(cè)總蛋白濃度。一抗使用TRB3(Calbiochem),p-AMPK/AMPK(CellSignalingTechnology)^p-Akt/Akt(CellSignalingTechnology),隨后孵育偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的二抗。TRB3以P-actin作為內(nèi)參,磷酸化蛋白以總蛋白作為內(nèi)參。5.脂肪組織TG和糖原的檢測(cè)應(yīng)用TriglycerideQuantificationKit(Abeam)測(cè)定各組脂肪組織內(nèi)甘油三醋(TriglycerideTG)的含量;應(yīng)用Glucose(HK)assaykit(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)測(cè)定各組脂肪組織糖原含量。6.病理學(xué)檢測(cè)取出4%多聚甲醛固定的各組大鼠脂肪組織,脫水浸蠟后石蠟包埋,切5pn切片,HE染色觀察脂肪細(xì)胞大體形態(tài),Image-proPlus圖像分析儀檢測(cè)附睪及皮下脂肪組織細(xì)胞橫截面積。肝臟置于4%多聚甲醛固定液浸泡固定24小時(shí)后,脫水浸蠟后石蠟包埋,制作如m厚的石蠟切片,用于肝臟HE染色;將置于4%多聚甲醛固定液浸泡固定24小時(shí)的肝臟,OCT包埋,制作5Mm厚的冰凍切片,用于肝臟油紅O染色,采用Image-proPlus圖像分析儀對(duì)油紅0染色圖片進(jìn)行分析,半定量分析肝臟脂質(zhì)沉積情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.各組大鼠的一般狀況比較實(shí)驗(yàn)?zāi)?與HF+vehicle組相比,DM+vehicle組實(shí)驗(yàn)大鼠的水和食物的攝入量以及排尿量均顯著升高(P<0.01?尸<〇.〇〇1)。各組實(shí)驗(yàn)大鼠的體重未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.各組大鼠生化指標(biāo)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)?與HF+vehicle組相比,DM+vehicle組實(shí)驗(yàn)大鼠的血清空腹血糖(FBG)水平顯著升高(尸<0.01),而胰島素敏感指數(shù)(ISI)顯著下降(尸<0.01)。另外各組大鼠空腹胰島素(FINS)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)均未見(jiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.TRB3基因沉默改善2型糖尿病大鼠代謝紊亂與DM+vehicle組相比,DM+TRB3siRNA組大鼠的水?dāng)z入量以及排尿量均顯著下降(尸<〇.〇5?P<0.01),ISI顯著增加(P<0.05)。4.TRB3基因沉默改善肥胖和2型糖尿病大鼠脂肪組織重構(gòu)采用Image-proPlus對(duì)各組大鼠附睪及皮下脂肪細(xì)胞橫截面積進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:與空載體組相比,TRB3基因沉默顯著降低肥胖和2型糖尿病大鼠皮下脂肪和附睪脂肪組織的細(xì)胞面積,脂肪細(xì)胞排列更加整齊和均勻。同時(shí),TRB3基因沉默減輕了棕色脂肪白色化。5.TRB3基因沉默后脂肪組織糖脂代謝功能的變化與DM+vehicle組相比,DM+TRB3siRNA組附睪脂肪組織中甘油三酯含量顯著降低,糖原含量顯著增加(PO.05?P<0.01);棕色脂肪組織中甘油三酯含量顯著降低(P<0.05),糖原含量無(wú)顯著性變化。與HF+vehicle組相比,HF+TRB3siRNA組皮下脂肪組織中甘油三酯含量無(wú)顯著性變化,糖原含量顯著增加(P<0.05)。6.TRB3基因沉默后脂肪組織中TRB3表達(dá)情況Westernblot結(jié)果顯示:與HF+vehicle組相比,HF+TRB3siRNA組實(shí)驗(yàn)大鼠的三種脂肪組織(EATSATBAT)TRB3表達(dá)水平顯著均降低(尸<0.001);DM+vehicle組大鼠三種脂肪組織TRB3表達(dá)水平均比HF+vehicle組明顯增加(P<0.001);與DM+vehicle組相比,DM+TRB3siRNA組實(shí)驗(yàn)大鼠的三種脂肪組織TRB3表達(dá)水平顯著降低(戶<0.001)。7.TRB3基因沉默后脂肪組織AMPK信號(hào)通路的變化附睪脂肪:與HF+vehicle組相比,HF+TRB3siRNA組實(shí)驗(yàn)大鼠的附睪脂肪內(nèi)p-AMPK蛋白表達(dá)水平顯著增加(尸<0.001);DM+vehicle組大鼠附睪脂肪內(nèi)p-AMPK表達(dá)水平比HF+vehicle組明顯降低(P<0.001);與DM+vehicle組相比,DM+TRB3siRNA組實(shí)驗(yàn)大鼠的附睪脂肪內(nèi)p-AMPK蛋白表達(dá)水平顯著增力口(F<0.001)。皮下脂肪:與HF+vehicle組相比,HF+TRB3siRNA組實(shí)驗(yàn)大鼠的皮下脂肪內(nèi)p-AMPK蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);與DM+vehicle組相比,DM+TRB3siRNA組實(shí)驗(yàn)大鼠的皮下脂肪內(nèi)AMPK磷酸化水平未見(jiàn)顯著變化。棕色脂肪:與HF+vehicle組相比,HF+TRB3siRNA組實(shí)驗(yàn)大鼠的棕色脂肪內(nèi)p-AMPK蛋白表達(dá)水平顯著增加(尸<0.001);與DM+vehicle組相比,DM+TRB3siRNA組實(shí)驗(yàn)大鼠的棕色脂肪內(nèi)AMPK磷酸化水平顯著增加(P<0.001)。8.TRB3基因沉默后肝臟脂質(zhì)沉積和肝臟組織重構(gòu)采用Image-proPlus對(duì)各組大鼠肝臟油紅?染色圖片進(jìn)行分析,半定量分析結(jié)果顯示,與HF+vehicle組相比,DM+vehicle組實(shí)驗(yàn)大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯増加(P0.001);與HF+vehi