P62調(diào)節(jié)Nrf2信號(hào)通路在弓形蟲(chóng)感染中的作用機(jī)制研究

P62調(diào)節(jié)Nrf2信號(hào)通路在弓形蟲(chóng)感染中的作用機(jī)制研究弓形蟲(chóng)病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)引起的一種機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)病,對(duì)我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)危害巨大,可造成家畜高熱、神經(jīng)癥狀、呼吸困難、孕畜流產(chǎn)、畸形胎甚至死胎現(xiàn)象的發(fā)生。弓形蟲(chóng)幾乎可以感染全部溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞,作為在食物鏈最頂端的人類(lèi),通過(guò)食入生肉或未煮熟的肉食后,從而感染弓形蟲(chóng)。弓形蟲(chóng)病作為一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)病,在全球范圍內(nèi)高度流行,世界上有三分之一的人類(lèi)受到該病的影響,對(duì)公共衛(wèi)生安全危害巨大。在人類(lèi)中弓形蟲(chóng)病主要的發(fā)病癥狀為孕婦流產(chǎn)、產(chǎn)畸胎、弱胎甚至死胎,以及兒童生長(zhǎng)發(fā)育緩慢甚至死亡等。而在家畜中,弓形蟲(chóng)多感染豬,主要發(fā)病癥狀為家畜高熱、神經(jīng)癥狀、呼吸困難、孕畜流產(chǎn)、畸形胎甚至死胎,病畜產(chǎn)出弱仔后,其后代成活率很低。弓形蟲(chóng)病對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)危害巨大,在豬、牛、羊和雞中均有該病報(bào)道,其中以豬的感染率最高。活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)是細(xì)胞中氧代謝的副產(chǎn)物,對(duì)細(xì)胞內(nèi)多種通路的激活都有重要的意義。ROS在細(xì)胞中濃度較低時(shí),會(huì)參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,然而過(guò)多的ROS會(huì)使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡,引起細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和內(nèi)脂質(zhì)的氧化損傷,引發(fā)細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致組織器官損傷和細(xì)胞死亡。當(dāng)弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞后,蟲(chóng)體蛋白或由其所引起的細(xì)胞因子會(huì)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS,用于清除蟲(chóng)體,這也是天然免疫反應(yīng)抵抗弓形蟲(chóng)感染的重要過(guò)程之一。但是過(guò)量的ROS對(duì)細(xì)胞生存具有毒性作用,此時(shí)由核因子E2相關(guān)基因2(NuclearFactorErythroid2-relatedfactor2,Nrf2)調(diào)控的基因表達(dá)后參與抗氧化應(yīng)激的防御體系中,用以維持機(jī)體的氧化還原平衡,從而起到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用?？墒?目前弓形蟲(chóng)感染后是如何調(diào)控宿主細(xì)胞ROS水平的機(jī)理還尚不清楚P62蛋白是選擇性自噬中重要的受體蛋白之一,同時(shí)作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心可以參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞通路,作為自噬受體蛋白被人們廣泛認(rèn)識(shí)。P62-Keap1-Nrf2信號(hào)通路作為非經(jīng)典的抗氧化基因表達(dá)通路,可以啟動(dòng)多種具有細(xì)胞保護(hù)性抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。為針對(duì)豬抗病育種潛在基因靶點(diǎn)篩選工作,本研究利用RAW264.7細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)RH株后檢測(cè)Nrf2信號(hào)通路激活情況、ROS水平、宿主細(xì)胞自噬水平及Nrf2的抑制蛋白Keap1的變化情況。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)CRISP/Cas9技術(shù)、WesternBlot、Real-timePCR、流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察等技術(shù)手段,分析了Nrf2下游靶基因轉(zhuǎn)錄水平、Nrf2基因敲除細(xì)胞系的細(xì)胞活力狀態(tài)、P62蛋白表達(dá)水平及其在細(xì)胞內(nèi)的定位和弓形蟲(chóng)引起的細(xì)胞自噬水平等,得到的主要結(jié)果如下:(1)弓形蟲(chóng)感染后會(huì)引起RAW264.7細(xì)胞ROS水平上調(diào)且隨著加弓形蟲(chóng)感染劑量增加ROS水平呈劑量依賴(lài)模式;(2)弓形蟲(chóng)感染RAW264.7細(xì)胞會(huì)激活Nrf2抗氧化信號(hào)通路,通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)Nrf2下游靶基因轉(zhuǎn)錄情況發(fā)現(xiàn),弓形蟲(chóng)感染可以顯著引起由Nrf2啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的下游細(xì)胞保護(hù)性基因HO-1(P<0.05)、GSTA-1(P<0.01)和NQO-1(P<0.05)的轉(zhuǎn)錄活性升高;(3)成功構(gòu)建Nrf2敲除細(xì)胞系,在弓形蟲(chóng)感染的Nrf2基因敲除細(xì)胞系中,相較于野生型細(xì)胞,Nrf2抗氧化信號(hào)通路下游靶基因GSTA-1(P<0.001)和NQO-1轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)(P<0.001),ROS表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì),且Nrf2基因敲除后會(huì)顯著抑制IFN-γ和TNF-α誘導(dǎo)后的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)感染弓形蟲(chóng)的生長(zhǎng)復(fù)制;(4)弓形蟲(chóng)感染會(huì)導(dǎo)致NIH/3T3(P<0.001)和HEK293T(P<0.001)細(xì)胞P62蛋白表達(dá)顯著下調(diào),RAW264.7(P<0.001)、THP-1(P<0.05)和原代小鼠細(xì)胞腹腔巨噬細(xì)胞P62蛋白表達(dá)顯著上調(diào),且缺失Nrf2核轉(zhuǎn)錄因子對(duì)弓形蟲(chóng)感染所引起的P62蛋白表達(dá)沒(méi)有影響;(5)成功構(gòu)建p62敲除細(xì)胞系,弓形蟲(chóng)RAW264.7細(xì)胞感染會(huì)激活P62調(diào)控的Nrf2抗氧化信號(hào)通路,通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染的P62基因敲除細(xì)胞系中,相較于野生型細(xì)胞,P62抗氧化信號(hào)通路下游靶基因HO-1(P<0.05)、GSTA-1(P<0.001)和NQO-1(P<0.001)轉(zhuǎn)錄水平都顯著下調(diào);(6)弓形蟲(chóng)感染RAW264.7細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞自噬水平升高,通過(guò)WesternBlot分析顯示,隨著感染弓形蟲(chóng)時(shí)間的增加,自噬的Marker蛋白LC3-II蛋白表達(dá)呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.05);(7)弓形蟲(chóng)感染RAW264.7細(xì)胞后,會(huì)通過(guò)P62介導(dǎo)的選擇性自噬降解Keap1蛋白,從而激活Nrf2抗氧化通路,通過(guò)WesternBlot結(jié)果顯示,在P62基因敲除細(xì)胞中,Keap1蛋白降解被抑制?？偠灾?Nrf2信號(hào)通路對(duì)于維持活