熒光定量PCR技術(shù)原理與結(jié)果分析-圖文

熒光定量PCR技術(shù)原理與結(jié)果分析_圖文.ppt一、含義二、優(yōu)越性三、應(yīng)用四、定量方法五、熒光材料六、結(jié)果分析一、含義實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-TimeQuantitativePCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。二、優(yōu)越性特異性熒光定量PCR具有引物和探針的雙重特異性，故與傳統(tǒng)的PCR相比，特異性大為提高。敏感性熒光定量PCR的敏感度通常達(dá)E2拷貝/ml，對(duì)數(shù)期分析，線性范圍很寬，為0-E11拷貝/ml。一般來(lái)講臨床標(biāo)本中病原體的數(shù)目為0-E10/拷貝，在此范圍內(nèi)熒光定量PCR定量較為準(zhǔn)確，標(biāo)本不需稀釋。重復(fù)性熒光定量PCR結(jié)果相當(dāng)穩(wěn)定，因?yàn)橛蛑翟O(shè)置在指數(shù)擴(kuò)增期.在此階段，各反應(yīng)組分濃度相對(duì)穩(wěn)定，沒(méi)有副作用，CT與熒光信號(hào)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。與終點(diǎn)法相比CT值能更穩(wěn)定，更精確地反映起始模板的拷貝數(shù)。自動(dòng)化無(wú)PCR后續(xù)操作步驟，降低產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)性。三、應(yīng)用用于核酸的定量如RNA、DNA的定量用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，RNA變異分析，溶解曲線分析等。四、定量方法1.

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的絕對(duì)定量2.

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定量

3.

比較CT法的相對(duì)定量

五、熒光材料熒光探針和熒光染料

SYBRgreenI

水解探針TaqMan

分子信標(biāo)

雜交探針SYBRgreenI未結(jié)合的SYBRgreenI水解探針TaqMan熒光素淬滅劑

與目標(biāo)序列互補(bǔ)FAMTETJOEHEXVIC

TAMRADABCYL探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)光能量轉(zhuǎn)移Taq游離的探針熒光基團(tuán)

淬滅劑

延伸時(shí)，Taq酶水解探針，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離而發(fā)出熒光，形成熒光信號(hào)

Taq發(fā)出熒光光另一波長(zhǎng)的熒光分子信標(biāo)熒光基團(tuán)莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)

淬滅劑

莖(5-7bp)

環(huán)（15-30bp）FAMTexasRed探針雜交到DNA模板光發(fā)出熒光DNA模板淬滅劑

莖

環(huán)光淬滅雜交探針5’5’5’發(fā)出熒光5’5’5’5’六、結(jié)果分析基線（Baseline）指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。光域值threshold的設(shè)定一般將PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值是PCR3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。CT值表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值