T-SHRH 012-2018 化妝品 眼刺激試驗 體外重組類似人角膜上皮模型測試

71.100.70C2682Y42上海日用化學品行業(yè)協(xié)會團體標準T/SHRH

012-2018_________________________________________________________________________________________化妝品

眼刺激試驗

體外重組類似人角膜上皮模型測試Cosmetics

Eye

test-

In

Cornea-like

前言…………… 21.范圍………………………… 32.規(guī)范性引用文件…………… 33.基本原理…………………… 34

.儀器和試劑耗材…………… 35.試驗方法…………………… 46.結果判定…………………… 6 本標準按照GB/T1.1-2009給出規(guī)則起草。本標準由上海日用化學品行業(yè)協(xié)會提出和歸口。公司、上海日用化學品行業(yè)協(xié)會。向紅、李瓊、高宏旗、金堅、陳亦華

1 范圍本標準規(guī)定了化妝品原料及成品眼刺激試驗

體外重組類似人角膜上皮模型測試試驗方法。本標準適用于化妝品原料及成品體外眼刺激性測試。本標準可作為眼刺激性動物試驗的替代方法之一，可結合其他方法對眼刺激性進行綜合評價。2 規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。OECD

Reconstructed

human

cornea-like

epithelium

(RhCE)

test

for

identifyingchemicals

not

requiring

classification

labelling

for

irritation

or

eye

3 基本原理涂布作用于三維重組類似人角膜上皮組織模型，一定時間暴露后經(jīng)過清洗、孵育等步驟，通過MTT測試組織細胞生存率，從而判定受試物的刺激性。4 儀器和試劑耗材4.1 設備4.1.1 二氧化碳培養(yǎng)箱4.1.2 生物安全柜4.1.3 多功能酶標儀4.1.4 水浴鍋4.1.5 計時器4.1.6 手術鑷子4.2 試劑耗材4.2.1 重組類似人角膜上皮組織模型4.2.2 6

孔、12

96

孔細胞培養(yǎng)板4.2.3 DPBS

溶液4.2.4 MTT

4.2.5 乙酰甲酯4.2.6 去離子水4.2.7 無菌移液管5 試驗方法5.1 模型接收與準備重組類似人角膜上皮模型經(jīng)4℃低溫運輸至實驗室。運輸過程全程需保持無菌，避免破損。模型接3761.0mL。組織模型外包裝用乙醇消毒，去除無菌紗布，將組織模型小孔取出，注意小孔底部是否有氣泡，如有氣泡則不可用。將組織小孔取出，注意去除凝膠，將其放入含培養(yǎng)基的6孔板中，底部不得有氣泡。組織模型在375%1h1.0

mL測試培養(yǎng)基，在標準培養(yǎng)條件下孵育過夜（16-24h）。5.2 對照選取選擇去離子水作為陰性對照，乙酸甲酯作為陽性對照。5.3 受試物準備5.3.1 測試物質37℃孵育15min，試物測試。5.3.2 受試物

MTT

反應測試一些受試物可能與對受試物與MTT50μ

L或固體50mg1mL

溶液的6孔板中，在標準培養(yǎng)條件下避光孵育約3h。陰性對照采用去離子水。如溶液出現(xiàn)變藍或紫色，則受試物能夠減少MTT，則需要加入死皮對照用于評價受試物是否導致的假MTT反應。5.3.3 有顏色或染色物質的測試對于有顏色物質或應用時變色的物質如其粘附在組織上并與一起提取，其可能干擾的測試，因此應考慮受試物的顏色屬性。皮對照上測試。5.4 受試物測試確定受試物的測試濃度。5.4.1 液體受試物5.4.1.1 預處理組織模型孵育過夜后取出，每孔加入20μ

L

不含鈣鎂的DPBS緩沖液進行潤濕，在標準培養(yǎng)條件（37℃,5%

CO2）孵育。5.4.1.2 受試物暴露每孔加入50μ

L30±2min對于難吸取液體可采用粘液移液器進行吸取加樣。5.4.1.3 潤洗用DPBS3100mL

DPBS在第一個燒杯中潤洗2s32個和第35.4.1.4 浸泡將模型小孔放入含預熱的測試培養(yǎng)基的12孔板中浸泡12±2min，去除模型中殘留的受試物。5.4.1.5 孵育培養(yǎng)基的6120±15min。5.4.2 固體受試物5.4.2.1 預處理組織模型孵育過夜后取出，每孔加入20μ

L

不含鈣鎂的DPBS緩沖液進行潤濕，在標準培養(yǎng)條件（37℃,5%

CO2）孵育。5.4.2.2 受試物暴露每個模型小孔加入50μ

L

DPBS50mg模型小孔中。應避免受試物加入到培養(yǎng)基中。在標準培養(yǎng)條件下孵育6h±。5.4.2.3 潤洗受試物用DPBS潤洗，具體步驟參照。5.4.2.4 浸泡將模型小孔放入含預熱的測試培養(yǎng)基的12孔板中浸泡25±2min，去除模型中殘留的受試物。5.4.2.5 孵育培養(yǎng)基的618±0.25h。5.5 MTT

5.5.1 取

300μL

1.0mg/mL

MTT

溶液加至

孔培養(yǎng)板，將測試后的模型小孔放至

孔板中，標準培養(yǎng)條件下孵育

±10min。5.5.2

2-8

溫振蕩

200L

至

96

570nm測定吸光度。5.5.3 對于固體受試物，將模型小孔放至含

1mL

異丙醇的

6

孔板中，將模型小孔不刺破放至含異丙醇的

6

200L

至

96

個重復，用酶標儀在

測定吸光度。

60.0%

NI5.6 死皮對照處理將未處理的模型測試小孔放置于-20-20℃保存。5.7 測試可接受標準測試結果成立必須滿足以下條件：I

陰性對照OD值>0.8且II

陽性對照30min暴露及暴露其相對生存率均低于50%；III

相同受試物兩個孔生存率的誤差