重組技術(shù)基礎(chǔ)

關(guān)于重組技術(shù)基礎(chǔ)DNA組成與結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)堿基的排列順序二級結(jié)構(gòu)DNA的雙螺旋形式高級結(jié)構(gòu)DNA的超螺旋形式核酸分子組成DNA的分子結(jié)構(gòu)第2頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（一）核酸的分類90%以上分布于細(xì)胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質(zhì)粒等。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脫氧核糖核酸

核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和個(gè)體的基因型(genotype)。參與細(xì)胞內(nèi)DNA遺傳信息的表達(dá)。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。第3頁,共76頁，2024年2月25日，星期天１.戊糖（構(gòu)成RNA）1′2′3′4′5′

-D-呋喃核糖(ribose)（構(gòu)成DNA）

-D-2-脫氧呋喃核糖

(deoxyribose)第4頁,共76頁，2024年2月25日，星期天2.堿基嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)第5頁,共76頁，2024年2月25日，星期天核苷：AR,GR,UR,CR脫氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR3.核苷(ribonucleoside)堿基——核糖（脫氧核糖）

連接方式：C——N糖苷鍵堿基（9/1位）——戊糖（1，位）

1′1第6頁,共76頁，2024年2月25日，星期天核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脫氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

４.核苷酸(ribonucleotide)核苷（脫氧核苷）——磷酸磷酸酯鍵第7頁,共76頁，2024年2月25日，星期天體內(nèi)重要的游離核苷酸及其衍生物AMPcAMP第8頁,共76頁，2024年2月25日，星期天5′端3′端５.核苷酸的連接３，－５，磷酸二酯鍵CGA第9頁,共76頁，2024年2月25日，星期天二、核酸的一級結(jié)構(gòu)定義：

核酸中核苷酸的排列順序（堿基序列）。5′端3′端CGA第10頁,共76頁，2024年2月25日，星期天AGP5

PTPGPCPTPOH3

書寫方法5

pApCpTpGpCpT-OH

3

5

ACTGCT

3

豎式橫式簡化式第11頁,共76頁，2024年2月25日，星期天DNA的空間結(jié)構(gòu)第12頁,共76頁，2024年2月25日，星期天一、DNA的二級結(jié)構(gòu)

（一）雙螺旋結(jié)構(gòu)第13頁,共76頁，2024年2月25日，星期天DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（Watson,Crick,1953）兩條DNA單鏈分子反向平行環(huán)繞，右手螺旋走向，表面大溝與小溝相間。螺旋直徑為2nm，

主鏈：戊糖－磷酸骨架位于外側(cè)

側(cè)鏈：堿基對位于內(nèi)側(cè)堿基平面垂直于螺旋軸堿基距：0.34nm；

螺距：3.4nm；周長：10對堿基。第14頁,共76頁，2024年2月25日，星期天堿基形成氫鍵配對，配對形式為：A=T;G

C）。第15頁,共76頁，2024年2月25日，星期天堿基互補(bǔ)配對TACG第16頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共76頁，2024年2月25日，星期天穩(wěn)定因素：1.氫鍵維持橫向穩(wěn)定性，2.堿基堆積力維持縱向穩(wěn)定性。3.介質(zhì)中陽離子可以有效地屏蔽磷酸基之間的靜電斥力

第18頁,共76頁，2024年2月25日，星期天DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性A型B型Ｚ型第19頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（二）與DNA堿基順序相關(guān)的特殊結(jié)構(gòu)堿基順序顛倒重復(fù)而具有2倍對稱的DNA段落第20頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共76頁，2024年2月25日，星期天鏡像重復(fù)序列第23頁,共76頁，2024年2月25日，星期天tsDNA是在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成的，三條鏈均為同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy），即整段的堿基均為嘌呤或嘧啶。（三）三股螺旋DNA

（tsDNA,也稱H-DNA

）

第24頁,共76頁，2024年2月25日，星期天Py-Pu-Py型，在偏酸性pH中穩(wěn)定，較多見

第25頁,共76頁，2024年2月25日，星期天Hoogsteen堿基配對第26頁,共76頁，2024年2月25日，星期天(四)四螺旋DNA

G四堿基體結(jié)構(gòu)示意圖第27頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共76頁，2024年2月25日，星期天四螺旋DNA的生物學(xué)意義真核染色體末端含有一個(gè)富含G的單鏈DNA尾巴。可自身回折形成HoogsteenG-G堿基對。兩個(gè)DNA分子(染色體)可彼此連接，形成一個(gè)局部四螺旋結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)起著穩(wěn)定染色體和在復(fù)制過程中保持其完整性的作用。第29頁,共76頁，2024年2月25日，星期天(五)酶活性DNA1995年Cuenoud等發(fā)現(xiàn)了具有酶活性的DNA，再次豐富了酶學(xué)。Cuenoud根據(jù)共有序列設(shè)計(jì)并合成了由47個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA-E47，以此連接兩個(gè)底物DNA——S1和S2第30頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共76頁，2024年2月25日，星期天二、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及其在染色質(zhì)中的組裝（一）DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同負(fù)超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反第32頁,共76頁，2024年2月25日，星期天意義DNA超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓?fù)鋵W(xué)變化及其調(diào)控對于DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過程具有關(guān)鍵作用。第33頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（二）原核生物DNA的高級結(jié)構(gòu)第34頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（三）DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是核小體(nucleosome)。DNA：約200bp

組蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4核小體的化學(xué)組成第35頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共76頁，2024年2月25日，星期天RNA的結(jié)構(gòu)StructureofRNA第38頁,共76頁，2024年2月25日，星期天RNA的種類、分布、功能第39頁,共76頁，2024年2月25日，星期天mRNArRNAtRNA第40頁,共76頁，2024年2月25日，星期天一、mRNA的結(jié)構(gòu)與功能hnRNA內(nèi)含子(intron)mRNA

外顯子(exon)第41頁,共76頁，2024年2月25日，星期天*真核細(xì)胞mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)5′末端有甲基化鳥苷帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-

2.3′末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。第42頁,共76頁，2024年2月25日，星期天帽子結(jié)構(gòu)第43頁,共76頁，2024年2月25日，星期天促進(jìn)mRNA由胞核向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位維持mRNA的穩(wěn)定性翻譯起始的調(diào)控帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能第44頁,共76頁，2024年2月25日，星期天*mRNA的功能把DNA的堿基序列翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸順序。DNAmRNA蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯原核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核DNA內(nèi)含子外顯子轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄后剪接轉(zhuǎn)運(yùn)mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細(xì)胞第45頁,共76頁，2024年2月25日，星期天*

tRNA的一級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)含10~20%稀有堿基，如DHU3′末端為—CCA-OH5′末端大多數(shù)為G

具有T

C二、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的結(jié)構(gòu)與功能第46頁,共76頁，2024年2月25日，星期天N,N-二甲基鳥嘌呤N6-異戊烯腺嘌呤雙氫尿嘧啶（DHU）4-巰尿嘧啶

稀有堿基第47頁,共76頁，2024年2月25日，星期天*tRNA的二級結(jié)構(gòu)——三葉草形

氨基酸臂

DHU環(huán)

反密碼環(huán)額外環(huán)

TΨC環(huán)氨基酸臂額外環(huán)第48頁,共76頁，2024年2月25日，星期天*tRNA的三級結(jié)構(gòu)——倒L形*tRNA的功能活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。第49頁,共76頁，2024年2月25日，星期天*rRNA的結(jié)構(gòu)三、rRNA的結(jié)構(gòu)與功能*rRNA的功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場所。第50頁,共76頁，2024年2月25日，星期天rRNA的種類真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNAS（沉降系數(shù)）：單位時(shí)間內(nèi)的沉降速度第51頁,共76頁，2024年2月25日，星期天核酸的理化性質(zhì)ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid第52頁,共76頁，2024年2月25日，星期天1.核酸的溶解度核酸是極性分子，微溶于水，不溶于乙醇或異丙醇。DNA+蛋白質(zhì)→脫氧核糖核蛋白（DNP）：在1mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。RNA+蛋白質(zhì)→核糖核蛋白（RNP）：在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。一、核酸的一般理化性質(zhì)第53頁,共76頁，2024年2月25日，星期天

核酸屬于兩性電解質(zhì)，但因?yàn)榱姿岬乃嵝暂^強(qiáng)，因此總體呈現(xiàn)較強(qiáng)的酸性。具有較低的等電點(diǎn)。當(dāng)溶液的pH

4時(shí)，呈多負(fù)離子狀態(tài)，容易與金屬離子結(jié)合形成鹽。2.酸堿性第54頁,共76頁，2024年2月25日，星期天3.核酸的高分子性質(zhì)粘度：DNA>RNAdsDNA>ssDNA4.核酸的紫外吸收(OD260)單核苷酸>ssDNA(或RNA)>dsDNA第55頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第56頁,共76頁，2024年2月25日，星期天5.核酸的化學(xué)性質(zhì)核酸中的嘌呤和嘧啶能進(jìn)行脫氨、聚合、烷基化等反應(yīng)等。脫氨：C→U第57頁,共76頁，2024年2月25日，星期天脫氨：C→UATCGAATTGCATUGAATTAC千萬年后，G–C將不復(fù)存在第58頁,共76頁，2024年2月25日，星期天聚合紫外光誘導(dǎo)兩個(gè)相鄰嘧啶之間形成二聚體第59頁,共76頁，2024年2月25日，星期天二、DNA的變性(denaturation)定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高 粘度下降浮力密度升高酸堿滴定曲線改變生物活性喪失第60頁,共76頁，2024年2月25日，星期天DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂第61頁,共76頁，2024年2月25日，星期天例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。第62頁,共76頁，2024年2月25日，星期天熱變性解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。第63頁,共76頁，2024年2月25日，星期天Tm：DNA變性時(shí)紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(meltingtemperature,Tm)。第64頁,共76頁，2024年2月25日，星期天影響Tm的因素：1.G+C含量:

G+C越高，Tm越高

2.DNA樣品均一性：

均一的DNA樣品，Tm范圍較狹窄。

3.核酸的種類：

雙鏈RNA＞RNA-DNA雜交鏈＞DNA雙鏈

4.溶液的離子強(qiáng)度：

離子強(qiáng)度高，Tm值高。第65頁,共76頁，2024年2月25日，星期天三、DNA的復(fù)性與分子雜交

DNA復(fù)性(renaturation)的定義在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。減色效應(yīng)

DNA復(fù)性時(shí)，其溶液OD260降低的現(xiàn)象。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing)。第66頁,共76頁，2024年2月25日，星期天不同來源的核酸鏈分子復(fù)性時(shí)形成雜化雙鏈過程叫分子雜交。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。核酸分子雜交(hybridization)第67頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第68頁,共76頁，2024年2月25日，星期天DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性不同來源的DNA分子第69頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第70頁