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文檔簡介

1豬蓋塔病毒分離與鑒定技術規(guī)范本文件適用于豬及其產品中蓋塔病毒病原分離和鑒GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗NY/T541獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運輸技術規(guī)范4縮略語BHK-21：乳倉鼠腎源細胞DNAmarker：DNA相對分子質量5.1.3BHK-21、DMEM培養(yǎng)基、FBS、HEPES緩沖液(1mol/L儲存液)、0見附錄A)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR反應混合液（2×)。25.2主要儀器設備液樣品1mL~2mL，組織裝入無菌自封樣品袋或離心管，血液裝入抗凝GETV分離鑒定時，應在高等級生物安全實驗室操作，按照GB19489（所有部分）的規(guī)定執(zhí)行。取0.5g~1g待檢組織樣品，加入1m按常規(guī)法將BHK-21細胞分裝在25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶分裝含8%FBS的DMEM培養(yǎng)基5mL，細胞濃度應為2×105個/mL~3×105個/mL，培養(yǎng)43的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48每天觀察記錄CPE，通常在接種12h~48h內可出現CPE，胞形態(tài)基本正常或稍有衰老。若出現CPE，將接毒細胞反復凍融三次，4℃3病毒上清液，置-70℃保存，進行病毒核酸鑒定。若接種細胞第1代72h后未出現CPE，按上述收毒方法取，并使用反轉錄試劑盒將提取核酸反轉錄成cDNA，于-20）：）：反應體系見表1，反應體系可根據表中各組分比5131149結果判定9.1RT-PCR9.2病毒分離鑒定5NaCl待上述混合物完全溶解后，加蒸餾水至1000mL，置4℃冰箱中備用，如配制1%的瓊脂糖凝膠和用A.31.0%瓊脂糖凝膠板制備6ACCGAAGAAGCCGAAGAAAAAGCCGCAAAAAGCGAAGGCTAAGAAAAACGAACAGCAAAAGAAGAACGAGAACAAGAAACCACCACCTAAGCAGAAGAACCCGGCTAAGAAGAAGAAACCAGGAAAAAGGGAACGCATGTGCATGAAGATAGAGAATGATTGCATCTTCGAGGTCAAGCTTGACGGTAAGGTCACGGGATACGCCTGCCTAGTCGGGGATAAAGTGATGAAGCCGGCACACGTCAAAGGTGT

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