《細胞的破碎與分離》課件

第三章細胞的破碎與分離1精選課件ppt第三章細胞的破碎與分離1精選課件ppt本章的主要內容常見的細胞壁結構細胞破碎技術包涵體的純化方法2精選課件ppt本章的主要內容常見的細胞壁結構細胞破碎技術包涵體的純化方法2概述不同類型的細胞分泌目標產物的類型：動物細胞多分泌到細胞外培養(yǎng)液植物細胞多為胞內產物微生物（細菌/酵母/真菌）胞內、胞外，對于胞內產物需要收集菌體或細胞進行破碎。3精選課件ppt概述不同類型的細胞分泌目標產物的類型：3精選課件ppt概述大多數情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標產物存在于發(fā)酵液中。有些目標產物存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產生的大多數蛋白質是在細胞內沉積。脂類物質和一些抗生素包含在生物體中。4精選課件ppt概述大多數情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標產大多數情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標產物存在于發(fā)酵液中。有些目標產物存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產生的大多數蛋白質是在細胞內沉積。脂類物質和一些抗生素包含在生物體中。概述5精選課件ppt大多數情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標產物存細胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破壞細胞壁和細胞膜，使細胞內容物包括目的產物成分釋放出來的技術，是分離純化細胞內合成的非分泌型生化物質（產品）的基礎。定義6精選課件ppt細胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破壞細胞壁和細胞膜，微生物細胞和植物細胞外層均為細胞壁，細胞壁里面是細胞膜，動物細胞沒有細胞壁，僅有細胞膜。通常細胞壁較堅韌，細胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細胞破碎的阻力主要來自于細胞壁。不同細胞壁的結構和組成不完全相同，故細胞壁的機械強度不同，細胞破碎的難易程度也就不同。細胞壁結構對破碎的影響7精選課件ppt微生物細胞和植物細胞外層均為細胞壁，細胞壁里面是細胞膜，動物細菌細胞壁結構幾乎所有細菌的細胞壁都是由肽聚糖組成，它是難溶性的聚糖鏈；相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯，構成了細胞壁的三維網狀結構，包圍在細胞周圍；使細胞具有一定的形狀和強度。8精選課件ppt細菌細胞壁結構幾乎所有細菌的細胞壁都是由肽聚糖組成，它是難溶細菌細胞壁結構破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網狀結構，其網結構的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數量和其交聯的程度。革蘭氏陰性菌的細胞壁結構與革蘭氏陽性菌有很大不同。

革蘭氏陰性菌典型的生物是大腸桿菌，通過這種細胞生產了很多細胞重組的產物。藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素大腸桿菌治療侏儒病α-干擾素大腸桿菌治療毛狀細胞白血病等9精選課件ppt細菌細胞壁結構破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網狀結構，其10精選課件ppt10精選課件ppt酵母細胞壁的結構示意圖最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀，上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯鍵連接成網狀。在該層的內部，有甘露聚糖-酶的復合物。破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結構交聯的緊密程度和它的厚度。11精選課件ppt酵母細胞壁的結構示意圖最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構成了真菌的細胞壁真菌的細胞壁較厚，主要由多糖組成，其次還含有較少量的蛋白質和脂類。不同的真菌，細胞壁的組成有很大的不同，其中大多數真菌的多糖壁是由幾丁質和葡聚糖構成，少數含纖維素。與酵母和細菌的細胞壁一樣，真菌細胞壁的強度和聚合物的網狀結構有關，不僅如此，它還含有幾丁質或纖維素的纖維狀結構，所以強度有所提高。12精選課件ppt真菌的細胞壁真菌的細胞壁較厚，主要由多糖組成，其次還含有較少細胞壁的組成和結構微生物革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細菌酵母菌真菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白質葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白質(6-8%)脂類(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂類蛋白質13精選課件ppt細胞壁的組成和結構微生物革蘭氏革蘭氏酵母菌真菌壁厚20-80細胞破碎技術14精選課件ppt細胞破碎技術14精選課件ppt細胞破碎技術15精選課件ppt細胞破碎技術15精選課件ppt細胞破碎技術16精選課件ppt細胞破碎技術16精選課件ppt細胞破碎方法及其原理機械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學破碎有機溶劑：表面活性劑：酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結構破壞，而使細胞破碎。通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而達到細胞破碎17精選課件ppt細胞破碎方法及其原理機械破碎搗碎法物理破碎溫度差破碎法化學破一機械法機械破碎法又可分為：高壓勻漿破碎法（homogenization）高速珠研磨破碎法（beadgrinding）超聲波破碎法（ultrasonication）18精選課件ppt一機械法機械破碎法又可分為：18精選課件ppt進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內含物。在珠液分離器的協助下，珠子被滯留在破碎室內，漿液流出從而實現連續(xù)操作。破碎中產生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法（Beadmill）原理：19精選課件ppt進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨NetzschLM-20型珠磨機園盤以兩種位置交錯地安裝在軸上，一種處于徑向，一種與軸傾斜，徑向盤使磨料沿徑向運動，傾斜盤則產生軸向運動。由于交錯的運動，提高了破碎效率。A-具有冷卻夾套的圓筒形磨室B-具有冷卻裝置的攪拌軸和圓盤C-環(huán)形震動俠縫分離器D-變速馬達1和2料液進出口3和4攪拌冷卻劑進出口5和6磨室冷卻劑進出口20精選課件pptNetzschLM-20型珠磨機園盤以兩種位置交錯地安裝在珠磨機破碎作用方程破碎作用是相對于時間的一級反應速度過程，符合下列公式：

ln[1/(1-x)]=Ktx—破碎率；K一一級反應速度常數；t一時間。K與攪拌轉速、細胞懸浮液濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠裝量和珠體直徑，以及溫度等相關。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、減少大分子目的產物的失活、減少由于高破碎率產生的細胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來的困難。該式中t在間歇操作時為破碎操作時間，連續(xù)操作時為細胞懸浮液在破碎室內的平均停留時間，即t=V/QV為破碎室的有效體積（即為懸浮液的體積），Q為料液流量。21精選課件ppt珠磨機破碎作用方程破碎作用是相對于時間的一級反應速度過程，符膠體磨德國進口珠磨機22精選課件ppt膠體磨德國進口珠磨機22精選課件ppt甘蔗葉片和莖總RNA的提取及mRNA的分離純化

圖2-1甘蔗葉片總RNAFig.2-1TotalRNAisolatedfromsugarcaneleaf

圖2-2甘蔗莖總RNAFig.2-2TotalRNAisolatedfromsugarcanestem1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示28S、18S和5SrRNA特征條帶清晰，說明得到的總RNA完整性好，沒有可見的降解，也無明顯的基因組DNA污染。結果與分析23精選課件ppt甘蔗葉片和莖總RNA的提取及mRNA的分離純化圖2-1甘蔗甘蔗葉片和莖mRNA呈彌撒分布，長度都分布在0.5～3kb范圍內，完全符合建庫要求。圖2-3mRNA電泳檢測結果Fig.2-3AgarosegelanalysisofmRNAM:1kbmarker;1:葉片mRNA;2:莖mRNAM:1kbmarker;1:leaf,smRNA;2:stem,smRNA甘蔗葉片和莖總RNA的提取及mRNA的分離純化結果與分析24精選課件ppt甘蔗葉片和莖mRNA呈彌撒分布，長度都分布在0.5～3kb雙鏈cDNA（dscDNA）的合成及檢測圖2-4甘蔗葉片雙鏈cDNAFig.2-4ThedscDNAofsugarcaneleaf圖2-5甘蔗莖雙鏈cDNAFig.2-5ThedscDNAofsugarcanestem甘蔗葉片和莖dscDNA都分布在0.5～3kb之間。說明所獲得的dscDNA是完整的。甘蔗葉片和莖dscDNA圖片差異較大，是用于電泳檢測的dscDNA用量差異造成。

結果與分析25精選課件ppt雙鏈cDNA（dscDNA）的合成及檢測圖2-4甘蔗葉片雙2.高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）利用高壓使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞破碎，細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。原理：——大規(guī)模細胞破碎的常用方法，在微生物細胞和植物細胞的大規(guī)模處理中常采用26精選課件ppt2.高壓勻漿法（High-pressurehomogeni高壓勻漿器的排出閥27精選課件ppt高壓勻漿器的排出閥27精選課件ppt影響高壓勻漿器細胞破碎因素被破碎的細胞分率符合如下公式：

ln[1/(1-R)]=KNPɑ

式中R—破碎率，為N次循環(huán)后，蛋白質的釋放量Rn與最大釋放量Rm之比；K－與溫度有關的速度常數；P－操作壓力，MPa；ɑ－與微生物種類有關的常數。28精選課件ppt影響高壓勻漿器細胞破碎因素被破碎的細胞分率符合如下公式：28易造成堵塞的團狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽性菌含有包含體的基因工程菌不宜采用高壓勻漿法的細胞類型。影響勻漿破碎的主要因素：壓力、溫度、通過勻漿器閥的次數29精選課件ppt易造成堵塞的團狀或絲狀真菌不宜采用高壓勻漿法的細胞類型。影大、中、小型高壓勻漿器30精選課件ppt大、中、小型高壓勻漿器30精選課件ppt超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。超聲波的細胞破碎效率與細胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關。3.超聲破碎法（Ultrasonication）31精選課件ppt超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩超聲波破碎的機理一般認為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),液體中局部空穴的形成、增大和閉合產生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細胞上造成了剪切力，使細胞內液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。操作過程產生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進行。32精選課件ppt超聲波破碎的機理32精選課件ppt33精選課件ppt33精選課件ppt超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于多數微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細菌比G+細菌易破碎，對酵母菌的效果較差。但超聲波產生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低由于對冷卻的要求相當苛刻，所以不易放大，但在實驗室小規(guī)模細胞破碎中常用。34精選課件ppt超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于多數機械法的缺點（1）需要高的能量并且產生高溫和高的剪切力，容易使不穩(wěn)定產品變性失活；（2）就破碎的有機體或釋放的產物而論，它們是非專一的，并且產生碎片微粒尺寸的大范圍細分布，大量細顆粒給分離帶來了困難。35精選課件ppt機械法的缺點（1）需要高的能量并且產生高溫和高的剪切力，容易二非機械破碎方法非機械法又可分為：酶溶破碎法（enzymelysis）化學破碎法（chemicaltreatment）滲透壓沖擊破碎法（osmoticshock）凍融破碎法（freezingandthawing）36精選課件ppt二非機械破碎方法非機械法又可分為：36精選課件ppt1.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內切酶殼多糖酶等酶解是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜。37精選課件ppt1.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法常酶解法的特點是專一性強，因此在選擇酶系統時，必須根據細胞的結構和化學組成來選擇。溶菌酶（lysozyme)能專一性地分解細胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷鍵，因此主要用于細菌類細胞壁的裂解。革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產生溶壁現象。但對于革蘭氏陰性菌，單獨采用溶菌酶無效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。放線菌的細胞壁結構類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于細胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。植物細胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。（1）外加酶法38精選課件ppt酶解法的特點是專一性強，因此在選擇酶系統時，必須根據細胞的結有時采用幾種酶的混合物會產生更好的效果，加入時需確定相應的次序。

對酵母細胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質-甘露聚糖結構，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細胞膜破裂，釋出胞內產物。（1）外加酶法39精選課件ppt有時采用幾種酶的混合物會產生更好的效果，加入時需確定相應的次優(yōu)點：產品釋放的選擇性高；抽提的速率和收率高；產品的破壞最少；條件溫和，對PH值和溫度等外界條件要求低；不殘留細胞碎片。缺點：溶酶價格高，溶酶法通用性差，產物抑制的存在。酶溶法的優(yōu)缺點40精選課件ppt優(yōu)點：缺點：酶溶法的優(yōu)缺點40精選課件ppt（2）自溶法（Autolysis）

自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過程中，大多數都能產生一種能水解細胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去。自溶作用：改變其生長環(huán)境（溫度、ｐＨ、緩沖液），可以誘發(fā)產生過剩的這種酶或激發(fā)產生其它的自溶酶，以達到自溶目的。缺點是：易引起所需蛋白質的變性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。41精選課件ppt（2）自溶法（Autolysis）自溶作用是酶解的另一種某些化學試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內物質有選擇地滲透出來。2.化學滲透法（Chemicalpermeation）該法取決于化學試劑的類型以及細胞壁膜的結構與組成。

42精選課件ppt某些化學試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯（1）酸、堿處理法酸處理可以使蛋白質水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。堿能溶解細胞壁上脂類物質或使某些組分從細胞內滲漏出來。成本低，反應激烈，不具選擇性。采用酸堿調節(jié)溶液的PH值，改變細胞所處的環(huán)境，從而改變兩性產物——蛋白質的電荷性質，使蛋白質之間或蛋白質與其他物質之間的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取。43精選課件ppt（1）酸、堿處理法酸處理可以使蛋白質水解成氨基酸，通常采用6（2）表面活性劑無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細胞壁上的脂蛋白結合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解細胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；非離子型如TritonX-100和吐溫（Tween）等對疏水性物質具有很強的親和力，能結合并溶解磷脂，破壞內膜的磷脂雙分子層，使某些胞內物質釋放出來。44精選課件ppt（2）表面活性劑無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是非離子型，能被細胞壁脂質層吸收后，使胞壁膜溶脹，細胞破裂，胞內物質被釋放出來。乙醇、異丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級醇等。（3）有機溶劑與水中氫鍵作用，削弱溶質分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。鹽酸胍和脲是常用的變性劑。45精選課件ppt能被細胞壁脂質層吸收后，使胞壁膜溶脹，細胞破裂，胞內物質被釋通用性差；時間長，效率低，一般胞內物質釋放率不超過50%；有些化學試劑有毒。化學試劑的加入常會給隨后產物的純化帶來困難，并影響最終產物純度?；瘜W滲透法優(yōu)缺點：缺點：優(yōu)點：對產物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質仍滯留在胞內；細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。46精選課件ppt通用性差；化學滲透法優(yōu)缺點：缺點：優(yōu)點：46精選課件ppt2.物理法（Physicalpermeation）滲透壓沖擊法凍結-融化法干燥法47精選課件ppt2.物理法（Physicalpermeation）滲透壓沖1）滲透壓沖擊法滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細胞內水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當達到平衡后，將介質快速稀釋，或將細胞轉入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內，引起細胞快速膨脹而破裂。僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細胞壁有缺陷，強度減弱。48精選課件ppt1）滲透壓沖擊法滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法48精選課2）凍結-融化法將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復多次而達到破壁作用。一方面使細胞膜的疏水鍵結構破裂，另一方面胞內水結晶，使細胞內外溶液濃度變化，引起細胞膨脹而破裂。適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復多次。49精選課件ppt2）凍結-融化法將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化3）干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥使細胞結合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內物質就容易被抽提出來。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質50精選課件ppt3）干燥法氣流干燥使細胞結合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。51精選課件ppt51精選課件ppt選擇破碎方法的依據細胞處理量；細胞壁強度和結構(高聚物交聯程度、種類和壁厚度)；目標產物對破碎條件的敏感性；破碎程度；目標產物的選擇性釋放52精選課件ppt選擇破碎方法的依據細胞處理量；52精選課件ppt選擇性釋放目標產物的一般原則⑴僅破壞或破碎存在目標產物的位置周圍當目標產物存在于細胞膜附近時，可采用較混和的方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結－融化法等。當目標產物存在于細胞質內時，則需采用強烈的機械破碎法．當目標產物處于與細胞膜或細胞壁結合的狀態(tài)時，調節(jié)溶液PH值，離子強度或添加與目標產物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標產物容易溶解釋放。(2)機械破碎法和化學法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標產物釋放率條件下，降低細胞的破碎程度。53精選課件ppt選擇性釋放目標產物的一般原則⑴僅破壞或破碎存在目標產物的位置破碎率的測定與破碎技術的研究方向

1.破碎率的測定直接測定法目的產物測定法導電率測定法采用染色法把破碎的細胞與未破碎的細胞區(qū)別開來。如破碎的革蘭氏陽性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細胞呈紫色，而受損害的細胞呈亮紅色。將破碎后的細胞懸浮液離心，測定上清液中目的產物含量或活性，并與100%破碎率的標準值比較，計算其破碎率。細胞破碎后，大量帶電荷的內含物被釋放到水相，使導電率上升。54精選課件ppt破碎率的測定與破碎技術的研究方向1.破碎率的測定直接測定2.破碎技術的研究方向多種破碎方法相結合與上游過程相結合與下游工程相結合55精選課件ppt2.破碎技術的研究方向多種破碎方法相結合55精選課件ppt基因工程表達產物后處理的特殊性基因工程菌培養(yǎng)液不同表達形式的前處理胞外分泌型表達：離心,收集液相→濃縮→純化。胞內表達：胞內可溶性表達：離心,收集菌體→細胞破碎→離心，收集上清→純化胞內周質表達：離心,收集菌體→低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標物→離心,收集上清液→純化。不溶性包涵體：離心,收集菌體→細胞破碎→離心,收集沉淀→包涵體洗滌→目標蛋白變性溶解→復性→純化。56精選課件ppt基因工程表達產物后處理的特殊性基因工程菌培養(yǎng)液不同表達形式的外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產物占菌體總蛋白外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長激素>30%形成包涵體β-內酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體57精選課件ppt外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產物占菌體總蛋白外源蛋白的積累包含體的形成包涵體：一種蛋白質不溶性聚集體，包括目標蛋白、菌體蛋白等。目標蛋白一級結構是正確的，但立體結構是錯誤的，所以沒有生物活性。包涵體的形成：大腸桿菌中目標產物的表達水平過高，超過正常代謝水平，過多表達產物聚集在細胞內，形成不溶性的包涵體。高表達產生的積聚物在細胞內部形成不溶物原因？蛋白過量積聚，超過溶解度，導致沉淀；②蛋白生成太快，分子間疏水基團相互作用而聚集沉淀；③蛋白生成太快，分子內部二硫鍵的錯誤連接導致沉淀；④表達蛋白過多，與其結合/誘導組分不足，不能形成溶解狀態(tài)⑤蛋白質自身不穩(wěn)定。58精選課件ppt包含體的形成包涵體：一種蛋白質不溶性聚集體，包括目標蛋白、菌基因工程包涵體的純化方法收集菌體細胞細胞破碎包涵體的洗滌目標蛋白的變性溶解目標蛋白的復性包含體的出現不僅增加了生物分離設計的難度，也為蛋白質折疊機理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態(tài)的目標產物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標蛋白恢復應有的天然活性。59精選課件ppt基因工程包涵體的純化方法收集菌體細胞細胞破碎包涵體的洗滌目標包涵體獲得

幾種常見的工藝路線(一)機械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）離心提取包含體加變性劑溶解除變性劑復性60精選課件ppt包涵體獲得

幾種常見的工藝路線(一)機械破碎離心提取包含體加特點:是利用了包含體與細胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細胞碎片和可溶性蛋白質分開，獲得了干凈的包含體，再對包含體溶解復性。優(yōu)點：擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內毒素等雜質，使后面的分離純化簡單了。從這個角度上講，包含體的形成對分離純化亦有好處。缺點:要經過幾次離心才能除去大部分的細胞碎片，加工時間較長。路線1的特點61精選課件ppt特點:是利用了包含體與細胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細包涵體獲得

幾種常見的工藝路線（二）機械破碎膜分離獲得包涵體加變性劑溶解包含體除變性劑復性62精選課件ppt包涵體獲得

幾種常見的工藝路線（二）機械破碎膜分離獲得包涵體路線（二）應用了膜分離技術，用微孔膜除去可溶性蛋白質。優(yōu)點是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。缺點：細胞碎片和包含體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常常導致可溶性蛋白質的滯留。路線2的特點63精選課件ppt路線（二）應用了膜分離技術，用微孔膜除去可溶性蛋白質。包涵體獲得

幾種常見的工藝路線（三）化學破碎（加變性劑）離心除細胞碎片除變性劑復性64精選課件ppt包涵體獲得

幾種常見的工藝路線（三）化學破碎離心除細胞碎片除用化學法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設備和時間，比前兩者更適合于實驗室操作。缺點是所有的可溶性雜質都沒有除去，混雜在產物中間，給后續(xù)分離帶來困難。

路線三：65精選課件ppt用化學法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道1）包涵體的洗滌細胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復性時會與目標蛋白一起復性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質類雜質。洗滌劑濃度以溶解雜質，不溶解包涵體中表達產物為原則。66精選課件ppt1）包涵體的洗