雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)及類黃酮化合物生物合成的調(diào)控

雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)及類黃酮化合物生物合成的調(diào)控報(bào)告提綱一、雪蓮花的研究背景二、雪蓮植物愈傷組織誘導(dǎo)

三、雪蓮高產(chǎn)黃酮細(xì)胞系的篩選四、雪蓮細(xì)胞的固體、懸浮培養(yǎng)（搖床、發(fā)酵罐）五、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化六、誘導(dǎo)子在雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用七、毛狀根培養(yǎng)技術(shù)八、轉(zhuǎn)基因技術(shù)在雪蓮中的應(yīng)用九、雪蓮細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有效成分一、雪蓮花的研究背景（雪蓮的種類及生長環(huán)境）雪蓮屬菊科（Compositae）鳳毛菊屬（SaussureaDC.）雪兔子屬亞屬（SubgenEriocoryne(DC.)）和雪蓮花亞屬（Subgen.AmphilaenaLipsch.）通稱為雪蓮花。我國雪蓮有40多種及3個(gè)變種，常被用作生藥的雪蓮植物有12種和1變種。雪蓮花同等入藥，但有優(yōu)劣之分。雪蓮產(chǎn)于西藏、新疆、甘肅、青海、四川及云南等地。雪蓮?fù)ǔＩL在海拔3500~4500米的高山流石灘上，其生長環(huán)境氣候多變，冷熱無常，雨雪交替，最高月平均溫度3-5℃，最低月平均溫度零下19—21℃，年降水量800mm，無霜期僅有50天左右。由于環(huán)境惡劣，雪蓮生長緩慢，4-5年才能開花結(jié)實(shí)。花期7月，種子8月成熟。續(xù)一、雪蓮花的主要品種及研究的進(jìn)展續(xù)一、雪蓮種類與療效1.雪蓮為菊科風(fēng)毛菊屬多年生草本植物；2.藥效顯著，為我國傳統(tǒng)的珍稀藥用植物資源；3.生境惡劣，被列為國家二級(jí)珍稀保護(hù)植物；4.新疆雪蓮(Sausureainvolucrata

)

和水母雪蓮(Sausureamedusa)

，用藥歷史悠久，為雪蓮中的上品。功能與主治：民間用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高山不適應(yīng)和各種婦科疾病等，具有散寒除濕、活血通絡(luò)的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明雪蓮還具有強(qiáng)心、抗癌、抗氧化、抗疲勞等功能。

續(xù)一、雪蓮的主要功能和主要成分續(xù)一、雪蓮的主要藥用成份主要藥用成份： 黃酮類、木質(zhì)素類、生物堿類和多糖類物質(zhì)；雪蓮黃酮類物質(zhì)： 芹菜素、木犀草素、槲皮素、異鼠李素、柯伊立素、高車前素、Jaceosidin、花色素及上述物質(zhì)的糖甙（例如蘆丁）；其他療效顯著的物質(zhì)：

紫丁香甙、牛蒡子甙、秋水酰堿、雪蓮內(nèi)酯等。續(xù)一、雪蓮的主要藥用成份結(jié)構(gòu)續(xù)一、類黃酮化合物合成途徑二、雪蓮植物愈傷組織誘導(dǎo)（一）、原料植物材料的制備在組織培養(yǎng)中，材料必須完全無菌。有些植物材料的表面有絨毛，消毒劑溶液不容易浸潤到表皮，可以在消毒及處理之前先將材料在70%酒精中浸泡數(shù)十秒，或者在消毒及溶液中加入幾滴表面活性劑T。-80，都會(huì)提高殺菌的效果。表面消毒劑對(duì)于植物組織也是有毒的。因此要正確選擇消毒劑的濃度和處理時(shí)間，以盡量減少組織的死亡。材料在表面消毒處理后，必須在無菌蒸餾水中漂洗3-4次，以除掉所有殘留的殺菌劑，否則就會(huì)妨礙愈傷組織的發(fā)生。續(xù)二、雪蓮植物愈傷組織誘導(dǎo)以植物的莖、葉、花或莖尖為材料，應(yīng)用無菌操作方法，使其在人工條件下，能夠分裂、增殖、分化發(fā)育成一完整植株的過程。植物的組織在人工培養(yǎng)條件下，原來已經(jīng)分化停止生長的細(xì)胞，可以重新分裂，形成沒有組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)，即愈傷組織，這一過程稱為“脫分化作用”。而已經(jīng)“脫分化”的愈傷組織，在一定條件下，又能重新分化形成輸導(dǎo)系統(tǒng)以及根和芽等組織和器官，這一過程稱為“再分化作用”。植物激素在“再分化”過程中起著重要作用，生長素和細(xì)胞分裂素的比例，決定了根和芽的分化。培養(yǎng)基、植物激素、滅菌等基本實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)極為重要！續(xù)二、五大類植物激素在組織培養(yǎng)中的作用①生長素；②赤霉素；③細(xì)胞分裂素；④乙烯；⑤脫落酸不定根形成的關(guān)鍵是其原基的形成,是一個(gè)受激素調(diào)控的復(fù)雜過程,生長素起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。介紹生長素、乙烯、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸和其它植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在不定根形成中的作用,并討論了它們之間的相互關(guān)系。1、生長素：吲哚乙酸促進(jìn)植物伸長

2、脫落酸：與葉子的衰老、果實(shí)的脫落等有關(guān)

3、乙烯：促進(jìn)果實(shí)成熟還有生長調(diào)節(jié)劑

4、細(xì)胞分裂素：調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生長和發(fā)育促進(jìn)細(xì)胞分裂

5、赤霉素（GA）

：是廣泛存在的一類植物激素?？纱碳と~和芽的生長。

續(xù)二、細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素（cytokinin;kinetin）從玉米或其他植物中分離到的一種N6-異戊烯腺嘌呤。在植物根部產(chǎn)生的一類促進(jìn)胞質(zhì)分裂的物質(zhì)，促進(jìn)多種組織的分化和生長。與植物生長素有協(xié)同作用。調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生長和發(fā)育的植物激素。在促進(jìn)細(xì)胞分裂中起活化作用，也包含在細(xì)胞生長和分化及其他相關(guān)的生理活動(dòng)過程中，如激動(dòng)素、玉米素等。細(xì)胞分裂素別名：6-BA；6-芐氨基腺嘌呤

三、雪蓮高產(chǎn)黃酮細(xì)胞系的篩選

植物細(xì)胞培養(yǎng)物這些細(xì)胞在核型、結(jié)構(gòu)和大小上各不相同，其代謝狀態(tài)和合成次生代謝物的能力差別也很大。因此，可以利用細(xì)胞的異質(zhì)及變異性篩選出所需要的細(xì)胞系。高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選，通常在愈傷組織團(tuán)、單細(xì)胞克隆或原生質(zhì)體水平上進(jìn)行篩選。最簡(jiǎn)單的方法是當(dāng)目的產(chǎn)物為色素類化合物，可以用目視來判斷和篩選。用目視法從水母雪蓮中篩選出比親本高5-6倍的高產(chǎn)黃酮細(xì)胞系。然而并不是所有的細(xì)胞和組織都象含色素的細(xì)胞那樣給人以視覺的直觀的標(biāo)準(zhǔn)，因此單干細(xì)胞中跡量代謝物測(cè)定的技術(shù)成為高產(chǎn)細(xì)胞系篩選的關(guān)鍵問題，從而出現(xiàn)了放射免疫測(cè)定法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法、瓊脂小塊法。續(xù)三、雪蓮愈傷組織篩選后的紅色高產(chǎn)系

四、雪蓮細(xì)胞的固體、懸浮培養(yǎng)（搖床、發(fā)酵罐）

愈傷組織在外植體上形成以后，應(yīng)及時(shí)從外植體上分離下來，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。一般情況下，從外植體上分離的愈傷組織須經(jīng)過4～6周的培養(yǎng)才能得到充分的發(fā)育。為了增殖發(fā)育良好的愈傷組織，繼代培養(yǎng)是有效的措施。在良好的培養(yǎng)條件下，愈傷組織可繼代一年以上而不喪失分化能力。影響愈傷組織繼代培養(yǎng)的主要因素是激素。為協(xié)調(diào)繼代培養(yǎng)中既要維持愈傷組織增殖生長良好、又要保持愈傷組織的分化能力的矛盾，就必須篩選最佳的激素濃度。續(xù)四植物細(xì)胞系的懸浮培養(yǎng)利用固體瓊脂培養(yǎng)基對(duì)植物的離體組織進(jìn)行培養(yǎng)的方法已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。但這種方法在某些方面還存在一些缺點(diǎn)，如植物的愈傷組織在生長過程中的營養(yǎng)成分、植物組織產(chǎn)生的代謝物質(zhì)呈現(xiàn)一個(gè)梯度分布，而利用液體培養(yǎng)基則可以克服這一缺點(diǎn)，我們可以通過震蕩培養(yǎng)或向培養(yǎng)基中通氣用以改善培養(yǎng)基中氧氣的供應(yīng)。植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是指將植物細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中能夠保持良好的分散狀態(tài)。這些小的細(xì)胞聚合體通常來自植物的愈傷組織。

四、雪蓮細(xì)胞的固體、懸浮培養(yǎng)（搖床、發(fā)酵罐）

水母雪蓮細(xì)胞固體和懸浮培養(yǎng)特點(diǎn)

微生物細(xì)胞

植物細(xì)胞

大小小

比微生物大10-100倍

細(xì)胞壁

無

有

生長形態(tài)學(xué)

單細(xì)胞或菌絲體粘連

細(xì)胞通常5-1000個(gè)粘連成塊，有時(shí)更大

接種密度要求大小生長速度

快（以小時(shí)計(jì)）

慢（以天計(jì)）

通氣要求

高

低

對(duì)剪切力的敏感性

能抗耐

敏感

續(xù)四、微生物細(xì)胞與植物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)上的差異

續(xù)四、雪蓮細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)（2升的生物反應(yīng)器）

續(xù)四、植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)溶氧的影響

在植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，溶氧對(duì)細(xì)胞的生長和代謝有很大的影響，同時(shí)，在培養(yǎng)條件中溶氧也是最復(fù)雜的因素之一，溶氧有一定的極限，過高或過低都會(huì)影響到細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成，特別是在高密度培養(yǎng)時(shí)，供氧不足往往可能是限制產(chǎn)量的主要因素之一，因此溶氧參數(shù)的調(diào)控對(duì)于植物細(xì)胞培養(yǎng)十分關(guān)鍵。如氧分壓對(duì)三七培養(yǎng)細(xì)胞生長以及人參皂苷和多糖合成的影響，發(fā)現(xiàn)高的氧分壓抑制細(xì)胞生長，同時(shí)也不利于產(chǎn)物的合成。續(xù)四、剪切力對(duì)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響植物細(xì)胞因其個(gè)體大、細(xì)胞壁僵脆和具有大的液泡而對(duì)剪切敏感，成為植物細(xì)胞培養(yǎng)放大的一個(gè)主要限制因素.

弄清植物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)體系流體力學(xué)敏感性的調(diào)控機(jī)理，對(duì)植物細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)合理的反應(yīng)器和優(yōu)化操作條件具有重要的作用。植物細(xì)胞對(duì)流體力學(xué)環(huán)境的響應(yīng)依賴于所施加條件的時(shí)間和強(qiáng)度以及細(xì)胞本身的生理特性。在實(shí)際的反應(yīng)器培養(yǎng)中尚無法定量剪切力與細(xì)胞生理響應(yīng)之間的關(guān)系.

.

續(xù)四、細(xì)胞聚集體對(duì)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

在懸浮培養(yǎng)中,一個(gè)成功的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系必須滿足懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物分散性好,細(xì)胞團(tuán)較小,一般由幾十個(gè)以下的細(xì)胞組成，很少有完全由單細(xì)胞組成的懸浮細(xì)胞系；二是均一性好,細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同,懸浮系外觀為大小均一的小顆粒,在倒置顯微鏡下觀察為體積和形狀大致相同的細(xì)胞團(tuán)。聚集體的大小與繼代條件、環(huán)境條件、反應(yīng)器構(gòu)型、培養(yǎng)基組成有關(guān)。當(dāng)然，不同植物種類形成的聚集體大小不同，如水母雪蓮（S.medusa）細(xì)胞的聚集體為1~5mm，大部分在0.5~3mm。五、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化

培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物和動(dòng)物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機(jī)鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。有的培養(yǎng)基還含有抗菌素和色素，用于單種微生物培養(yǎng)和鑒定。續(xù)五培養(yǎng)基的分類（1）為適合多種植物的細(xì)胞生長及次生代謝產(chǎn)物含量的提高，許多不同種類的培養(yǎng)基被發(fā)展了。按培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)進(jìn)行分類:

液體培養(yǎng)基：一類呈液態(tài)的培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基：一類外觀呈固態(tài)的培養(yǎng)基。根據(jù)性質(zhì)又分為

半固體培養(yǎng)基：指在液體培養(yǎng)基中加入少量的凝固劑而配制成的半固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。

脫水培養(yǎng)基：又稱預(yù)制干燥培養(yǎng)基，指含有除水分外的一切成分的商品培養(yǎng)基。

續(xù)五培養(yǎng)基主要成分（2）大多數(shù)培養(yǎng)基的成分是由無機(jī)營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機(jī)附加物等五類物質(zhì)組成的。無機(jī)營養(yǎng)物主要由大量元素和微量元素兩部分組成，大量元素中，氮源通常有硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中用硝態(tài)氮的較多，也有將硝態(tài)氮和銨態(tài)氮混合使用的。生長調(diào)節(jié)包括：(1)植物生長素。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。(2)細(xì)胞分裂素。如玉米素（Zt）、6-芐基嘌呤（6-BA或BAP）和激動(dòng)素（Kt）。(3)赤霉素。使用的赤霉素只有一種，赤霉酸（GA3）

續(xù)五植物細(xì)胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基（3）用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分基本上與整個(gè)植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)細(xì)胞、組織和器官的培養(yǎng)基需要滿足各自的特殊要求。根據(jù)特定的植物種類和培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)基的基本營養(yǎng)成分可作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。基本培養(yǎng)基也就是通常所說的培養(yǎng)基，主要有MS、White、B5、N6、改良MS、Nitsh、Miller、SH等。完全培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)。如植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)添加物等。續(xù)五培養(yǎng)基制備母液（4）為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對(duì)幾十種化學(xué)藥品進(jìn)行稱量，應(yīng)該將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量10倍、100倍或1000倍稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做母液。這樣，每次配制培養(yǎng)基時(shí)，取其總量的1/10、1/100、1/1000，加以稀釋，即成培養(yǎng)液。(1)大量元素；(2)微量元素；(3)鐵鹽；(4)有機(jī)物質(zhì)；(5)植物激素。注意：生長素類，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。

續(xù)五培養(yǎng)基的保存（5）培養(yǎng)基配制完畢后，應(yīng)立即滅菌。培養(yǎng)基通常應(yīng)在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在高壓蒸汽滅菌鍋120℃條件下，滅菌20分鐘。經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基應(yīng)置于10℃下保存，特別是含有生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基，在4～5℃低溫下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培養(yǎng)基，要在配制后的一周內(nèi)使用完，其它培養(yǎng)基最多也不應(yīng)超過一個(gè)月。在多數(shù)情況下，應(yīng)在消毒后兩周內(nèi)用完。(1)防塵；已經(jīng)滅好菌的培養(yǎng)基要注意防塵；(2)避光：備用培養(yǎng)基應(yīng)貯于光線較暗處，因?yàn)檫胚嵋宜岬饶承┪镔|(zhì)易見光分解；(3)定期更新。

六、誘導(dǎo)子技術(shù)在雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用誘導(dǎo)子是一類特殊的觸發(fā)因子，它能夠開啟代謝過程中酶的活性，因而能夠增加次生代謝物的含量，有時(shí)甚至可以誘導(dǎo)出新的化合物。誘導(dǎo)子是來自生物的化合物。內(nèi)生誘導(dǎo)子（endogenouselicitor）：來自植物細(xì)胞分子真菌誘導(dǎo)子（fungalelicitor）：來自微生物分子，是一類能引起植物細(xì)胞合成積累次生代謝物活性的物質(zhì)。誘導(dǎo)子對(duì)植物具有專一性，在生產(chǎn)次生代謝物時(shí)就要選擇一種適宜的誘導(dǎo)子。續(xù)六、誘導(dǎo)子種類及篩選誘導(dǎo)子:

能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生防御反應(yīng)的物質(zhì)。種類：

內(nèi)源與外源誘導(dǎo)子； 生物與非生物誘導(dǎo)子； 特異與非特異誘導(dǎo)子。 篩選原則： 近緣細(xì)胞系；同類代謝物；信號(hào)分子。續(xù)六、茉莉酸甲酯（MJ）在細(xì)胞培養(yǎng)體系中的應(yīng)用

MJ為內(nèi)源的非特異性生物誘導(dǎo)子； MJ能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中苯丙氨酸裂解酶(PAL)的重新轉(zhuǎn)錄，刺激黃酮類物質(zhì)的積累。續(xù)六、雪蓮細(xì)胞的生長動(dòng)態(tài)及黃酮產(chǎn)量變化曲線

續(xù)六、MJ影響雪蓮細(xì)胞的生物量MJ對(duì)雪蓮細(xì)胞PAL活性的影響

七、毛狀根培養(yǎng)技術(shù)在雪蓮中的應(yīng)用

毛狀根：又稱發(fā)狀根，發(fā)根。整體植株或某一器官、組織（包括愈傷組織）、單個(gè)細(xì)胞，甚至原生質(zhì)體受到發(fā)根農(nóng)桿菌的感染所產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象，是細(xì)胞中質(zhì)粒的T-DNA插入寄主細(xì)胞核基因組而得到的表現(xiàn)型，主要是在感染部位上或附近能產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物-毛狀根。毛狀根培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：生物合成能力強(qiáng)、穩(wěn)定性高、生長快影響毛狀根生長及次生代謝物形成的因素：常量元素、微量元素、碳源、pH值、光照、溫度、生長調(diào)節(jié)劑或激素。續(xù)七、毛狀根培養(yǎng)技術(shù)毛狀根培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)：來源于單個(gè)細(xì)胞、生長迅速（>10倍）、激素自養(yǎng)、再生容易、次生代謝物質(zhì)合成穩(wěn)定且含量高；2.本試驗(yàn)所用菌種：A4、R1000、R1601和LBA9402。毛狀根篩選路線續(xù)七、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間影響R1601侵染頻率*基本培養(yǎng)基：N6+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5.6-5.8。外植體類型為新疆雪蓮葉片。

續(xù)七、菌種及外植體類型影響毛狀根轉(zhuǎn)化效率續(xù)七、新疆雪蓮毛狀根PCR檢測(cè)（A）和Southernblot分析（B）

續(xù)七、新疆雪蓮毛狀根中冠癭堿紙層析分析

續(xù)七、野生雪蓮和雪蓮培養(yǎng)物有效成份含量比較

單位：mg/gdw續(xù)七、培養(yǎng)基類型影響新疆雪蓮毛狀根(HR1601)

生長及紫丁香甙的積累氮源濃度對(duì)水母雪蓮毛狀根生長及黃酮類化合物生物合成的影響氨/硝對(duì)水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響碳源對(duì)水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響碳源對(duì)水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響GA3對(duì)水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響激素組合對(duì)水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響Temperature(℃)

溫度對(duì)水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響pH對(duì)水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響搖床轉(zhuǎn)速對(duì)水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響光周期對(duì)水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響接種對(duì)照優(yōu)化MJ(茉莉酸甲酯methyl-jasmonate)添加時(shí)間對(duì)水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響SA(水楊酸salicylicacid）濃度對(duì)雪蓮毛狀根生長及黃酮類化合物生物合成的影響SA添加時(shí)間對(duì)水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響MJ與SA組合對(duì)水母雪蓮毛狀根生長及黃酮類化合物生物合成的影響小結(jié)1.R1601，根段(預(yù)培養(yǎng)2天)，誘導(dǎo)頻率83%；2.Ri質(zhì)粒的T-DNA已整合到植物基因組并表達(dá)；3.HR1601根系生物量（MS，28d），16倍；總黃酮含量為88.6mg/gdw，紫丁香甙含量43.5mg/gdw，分別為野生新疆雪蓮的2.5倍和87倍。

八、轉(zhuǎn)基因技術(shù)在雪蓮中的應(yīng)用

通過對(duì)次生代謝合成關(guān)鍵酶基因的異位表達(dá)可以產(chǎn)生不同種類的次生代謝產(chǎn)物或提高含量。研究有效次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑，可以人為地對(duì)這些化學(xué)成分的合成進(jìn)行生物調(diào)控，有利于定向合成所需要的化學(xué)成分

。如，日本科學(xué)家Hashimoto等將天仙子胺6-β-羥基化酶基因通過Ri質(zhì)粒導(dǎo)入茛菪毛根中，茛菪胺含量提高了5倍（Hashimotoetal，1993）

續(xù)八、查爾酮異構(gòu)酶基因過表達(dá)對(duì)新疆雪蓮

類黃酮生物合成的調(diào)控

Smchi基因轉(zhuǎn)化新疆雪蓮毛狀根提高黃酮類物質(zhì)生物合成的研究研究內(nèi)容

①新疆雪蓮試管苗生根培養(yǎng)③毛狀根培養(yǎng)條件優(yōu)化④轉(zhuǎn)基因新疆雪蓮毛狀根的PCR檢測(cè)⑤轉(zhuǎn)基因新疆雪蓮毛狀根的PCR-Southern檢測(cè)⑥轉(zhuǎn)基因新疆雪蓮毛狀根的生長能力⑦轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根根系的總黃酮和芹菜素的生產(chǎn)⑧Smchi基因表達(dá)和CHI酶活性分析②發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導(dǎo)新疆雪蓮遺傳轉(zhuǎn)化體系建立及優(yōu)化轉(zhuǎn)基因新疆雪蓮毛狀根的生長能力

(g/L)(g/L)Freshweight(g/L)

Dryweight(g/L)051015C60C57C52C46C41C35C31C29C27C20C18C17C12C7C1Control050100150C60C57C52C46C41C35C31C29C27C20C18C17C12C7C1Control不同新疆雪蓮毛狀根根系的芹菜素和黃酮含量

(mg/L)(mg/L)

Flavonoids(mg/L)Apigenin(mg/L)0.010.020.030.040.0C60C57C52