細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定

關(guān)于細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、細(xì)菌的分離1、從混雜微生物中獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱為分離。

2、分離的目的在于從被檢材料中、或者從污染的眾多雜菌中分離出純的病原菌。第2頁,共15頁，2024年2月25日，星期天1)病料采集

病料：疑似細(xì)菌性疾病的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物以魚為例，常見癥狀：體色發(fā)黑，體表潰爛、充血、粘液增多，鰓、鰭破損，內(nèi)臟紅腫，腹水，眼球凸出或渾濁，肛門紅腫等等?；铙w病料→應(yīng)考慮病原在疾病發(fā)展過程中的部位（上述癥狀）病料死后→應(yīng)立即采集，越早越好第3頁,共15頁，2024年2月25日，星期天魚的解剖結(jié)構(gòu)：第4頁,共15頁，2024年2月25日，星期天

第5頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2）無菌操作無菌操作是指在環(huán)境中一切有生命活動(dòng)的微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞及其芽孢或孢子都不存在的狀態(tài)。微生物研究過程中，既要避免各種外界的微生物進(jìn)入操作對(duì)象又要杜絕操作對(duì)象污染周圍環(huán)境的操作技術(shù)。無菌操作是對(duì)微生物學(xué)工作者最基本的要求，必須經(jīng)過嚴(yán)格訓(xùn)練才能形成無菌操作素養(yǎng)。不論何種情況下，頭腦中都應(yīng)該有這個(gè)概念。無菌操作貫穿于整個(gè)分離過程，例如：病料的采集、器材的準(zhǔn)備、具體的操作。所用器械及物品均應(yīng)事先滅菌備用，金屬器具包裝后高壓滅菌或煮沸30min，玻璃器皿可高壓滅菌也可干熱滅菌，膠皮塞、培養(yǎng)基等則要高壓滅菌。第6頁,共15頁，2024年2月25日，星期天3）細(xì)菌分離工具：接種環(huán)（接種前后都要嚴(yán)格過火滅菌）接種環(huán)境：無菌操作臺(tái)接種方法：平板劃線*以左手持平板，中指、無名指和小指托著平板底,拇指和食指打開上蓋，使蓋與底成30o角，以便劃線。*右手握接種環(huán)，先滅菌鉑絲部分，待絲燒紅后，再于火焰上滅菌金屬棒部分。把接種環(huán)上的病料涂在培養(yǎng)基一側(cè)，一般作5-8次劃線。將環(huán)上的多余細(xì)菌材料燒掉后，從第1次劃線引出第2次劃線；再從第2次劃線引出第3次劃線，如此反復(fù)3-4次劃線后，即可把整個(gè)平板表面劃滿，注意每一次劃線只能與上一次劃線重疊，這樣就可在最后的1-2次劃線上出現(xiàn)多量的單個(gè)菌落，以便進(jìn)行純培養(yǎng)。第7頁,共15頁，2024年2月25日，星期天具體操作：取病料，將體表的泥沙等雜物用清水沖洗干凈取干凈托盤，將病料置于托盤中托盤置于工作臺(tái)上，接種前準(zhǔn)備好酒精燈、接種環(huán)、酒精棉球、解剖刀、剪刀、鑷子等。事先作好準(zhǔn)備工作，把所用的物品器械擺好解剖病料，將接種環(huán)燒紅冷卻后接觸病變部位，平板劃線。如體表創(chuàng)傷潰爛部位，病變內(nèi)臟。腹水可直接涂布平板平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況（注意：操作臺(tái)在使用前后都需要用酒精棉球擦拭臺(tái)面，保持操作臺(tái)的整潔）第8頁,共15頁，2024年2月25日，星期天二、細(xì)菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基：培養(yǎng)基是指由人工方法配合而成的，用于微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存菌種用的混合營(yíng)養(yǎng)制品。培養(yǎng)基的種類①基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖需要的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分（普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂）②加富培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如血液/血清、酵母浸膏或生長(zhǎng)因子等）；用以培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高的微生物（2216E）③選擇培養(yǎng)基：利用細(xì)菌對(duì)某種或某些化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同；在培養(yǎng)基中加入這類物質(zhì)，利于所需分離的細(xì)菌生長(zhǎng)，而抑制不需要的細(xì)菌生長(zhǎng)，從而達(dá)到分離某種微生物的目的。（中國(guó)科學(xué)院海洋研究所專利：一種定量檢測(cè)鰻弧菌的選擇性培養(yǎng)基及其制備）【利用鰻弧菌對(duì)氨芐青霉素的抗性】④鑒別培養(yǎng)基：是一類含有某種特定化合物或試劑的培養(yǎng)基。某種細(xì)菌在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，能與這種特定化合物或試劑發(fā)生某種明顯的特征性反應(yīng)；從而達(dá)到區(qū)分不同的微生物。（TCBS）第9頁,共15頁，2024年2月25日，星期天

病料在接種培養(yǎng)基后，經(jīng)過一段時(shí)間，應(yīng)檢查其生長(zhǎng)狀況。首先用肉眼檢查有無細(xì)菌生長(zhǎng)；若有，則需進(jìn)一步檢查菌落是否純一。形態(tài)特征包括：大小、形狀、突起或扁平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）、顏色（紅色、灰白色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等多數(shù)情況下，沿劃線生長(zhǎng)較多的菌落，是待檢病原菌的可能性較大；少數(shù)零散分布或不在劃線上生長(zhǎng)的菌落，多為雜菌。為慎重起見，可挑選若干個(gè)可疑菌落分別進(jìn)行劃線，進(jìn)一步純化培養(yǎng)如果需要擴(kuò)大培養(yǎng)，可挑取單菌落接種至液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)第10頁,共15頁，2024年2月25日，星期天三、細(xì)菌的鑒定一）傳統(tǒng)方法：常規(guī)宏觀菌落形態(tài)學(xué)觀察,主要觀察菌落在其適合的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況。細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)學(xué)觀察,即通過顯微鏡觀察。形態(tài)學(xué)鑒定輔以生化試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中具有重要的意義（生化鑒定管、藥敏實(shí)驗(yàn)等）二）儀器的自動(dòng)化鑒定：VITEK系統(tǒng)、MIDI系統(tǒng)、BIOLOG系統(tǒng)、SENSITITRE系統(tǒng)、AUTOSCEPTOR系統(tǒng)以及MICROSCAN系統(tǒng)等（ATBExpression）三）分子生物學(xué)方法:基因測(cè)序、指紋圖譜技術(shù)、基因探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、GC含量測(cè)定等第11頁,共15頁，2024年2月25日，星期天生化鑒定管

各種細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物或多或少地各有區(qū)別，可供鑒別細(xì)菌之用第12頁,共15頁，2024年2月25日，星期天ATBExpression：自動(dòng)化微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)

第13頁,共15頁，2024年2月25日，星期天分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)鑒定目前比較流行的主要是核酸檢測(cè)技術(shù),包括基因測(cè)序、指紋圖譜技術(shù)、基因探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、GC含量測(cè)定等。