【生物】基因工程（復習課件）-2023-2024學年高二生物下學期期中考點大串講（人教版2019選擇性必修3）

單元復習第3章

基因工程內容網絡課標要求生命觀念:1.探究DNA的物理與化學性質，進行DNA分子的提取與鑒定。2.結合實例，采用文字和圖示方式說明基因工程的基本操作程序。3.針對人類生產和生活的某一需求，嘗試提出初步的基因工程構想，完成初步設計。4.基于基因工程在農牧業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和食品工業(yè)應用的實例，說明基因工程給社會帶來的巨大進步。5.嘗試通過蛋白質工程技術，根據人類需要的蛋白質結構，設計改造某一蛋白質的設計流程。1.運用結構與功能觀說明基因工程的各種工具的特點。2.運用結構與功能觀等觀念理解PCR技術的過程、原理、條件等。3.說明基因的堿基排列順序—蛋白質的結構—蛋白質功能的關系。1.探究DNA的物理與化學性質，進行DNA分子的提取與鑒定。2.聯系當地生產、生活中的具體實例，思考用基因工程的方法解決實際問題,基于基因工程在各方面發(fā)展的前景，理性看待基因工程的安全性。3.嘗試運用逆向思維分析和解決問題?？茖W思維、科學探究:社會責任:考點CONTENTS01DNA的粗提取及鑒定02DNA重組技術03基因工程的基本操作程序04基因工程的應用05蛋白質工程的原理和應用PART01DNA的粗提取及鑒定考點一：DNA的粗提取及鑒定原理一原理二原理三思路

：DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當的物理或化學方法對它們進行提取DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精DNA能溶于物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液在一定溫度下，DNA被二苯胺試劑染成藍色一、實驗原理：二、實驗材料及用具：DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。1.選材：不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA2.試劑：試劑研磨液體積分數為95%的酒精二苯胺2mol/L的NaCl溶液

蒸餾水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現配現用研磨液成分作用SDS使蛋白質變性EDTA抑制DNA酶Tris-HCl緩沖液穩(wěn)定DNA考點一：DNA的粗提取及鑒定三、實驗步驟：1.破碎細胞——稱取

，切碎，放入研缽，倒入

，

研磨。洋蔥研磨液充分

研磨不充分，會使DNA分子不能從細胞核中釋放出來，從而使研磨液中的DNA含量較低，影響最終提取的DNA量。2.去除雜質——在漏斗中墊上

過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取

；或將研磨液倒入塑料離心管中離心，取

。紗布上清液上清液不可以用濾紙代替紗布。因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。3.DNA的粗提取——在上清液中加入體積相等的

溶液，靜置2~3min，溶液中出現的

就是粗提取的DNA。預冷的酒精白色絲狀物酒精作用：使蛋白質等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。預冷的酒精的優(yōu)點①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。考點一：DNA的粗提取及鑒定3.DNA的粗提取——用玻璃棒沿

攪拌，卷起

，并用濾紙吸去上面的水分：或將溶液倒入塑料離心管中離心，取

晾干。一個方向沉淀物絲狀物為什么要用玻璃棒沿一個方向緩慢攪拌？

避免破壞DNA4.DNA的鑒定——將絲狀物或沉淀物溶于

溶液中，加入

試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。二苯胺2mol/L的NaCl空白對照組：

在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min。加入2mol/L氯化鈉溶液不加入絲狀物加入4mL二苯胺試劑加入2mol/L氯化鈉溶液加入絲狀物加入4mL二苯胺試劑實驗組對照組水浴加熱——看提取物顏色——看與二苯胺反應顏色的深淺DNA純度

DNA的量考點一：DNA的粗提取及鑒定例1．關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是（）A．粗提取的DNA中可能含有蛋白質B．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色D．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀D考點一：DNA的粗提取及鑒定6．“DNA粗提取與鑒定”實驗需要對材料進行選擇、處理。為了提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物，下列對實驗材料的選擇和處理，正確的是（

）A．以豬成熟紅細胞為實驗材料時，可在濾液中加入適量的木瓜蛋白酶B．以菜花為實驗材料時，在研磨過程中可加入適量的纖維素酶C．以植物葉片為實驗材料時，一般使用體積分數為50%的預冷酒精提取DNAD．以香蕉為實驗材料時，將研磨液在4℃的冰箱中放置幾分鐘后，取沉淀物進行離心BPART02DNA重組技術考點二：重組DNA技術（限制性內切核酸酶——“分子手術刀”）主要是原核生物來源種類數千種限制酶不是一種酶，而是一類酶特點（1）識別雙鏈DNA分子特定核苷酸序列（2）斷開磷酸二酯鍵識別序列長度一般為4~8個或其他數量的核苷酸，最常見的為6個核苷酸。專一性TGCCGTAA5'3'5'3'結果形成黏性末端或平末端考點二：重組DNA技術（限制性內切核酸酶——“分子手術刀”）限制酶的命名

EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個字母R型菌株從中分離的第一個限制酶例如：流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindIHindIIHindIII限制酶的選擇技巧

圖甲

圖乙根據目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類①應選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ；②不能選擇切割位點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ；③為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切割位點)根據質粒的特點確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保產生相同的黏性末端；②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標記基因；如果所選酶的切割位點不止一個，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復制起點區(qū)，則切割重組后的片段進入受體細胞后不能自主復制考點二：重組DNA技術（DNA連接酶——“分子縫合針”）種類來源大腸桿菌T4噬菌體作用差別只連接____________縫合___________和____________E.coli

DNA連接酶T4DNA連接酶黏性末端黏性末端平末端（效率較低）都能將雙鏈DNA片段“縫合“起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵?？键c二：重組DNA技術（限制性內切核酸酶——“分子手術刀”）DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實質化學本質不同點模板作用對象作用結果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復制在兩個DNA片段間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸連接到已有DNA片段，形成磷酸二酯鍵考點二：重組DNA技術（限制性內切核酸酶——“分子手術刀”）名稱作用部位作用結果限制酶

DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯鍵堿基對之間的氫鍵將DNA切成兩個片段磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈考點二：重組DNA技術（基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”）載體的作用載體的必要條件載體的種①能夠在宿主細胞中復制并穩(wěn)定地保存。②具一個或多個限制酶切點，供外源DNA片段（目的基因）插入其中。③具有某些標記基因，便于進行鑒定和選擇。④必須是安全的，對受體細胞無害。①作為運載工具，將目的基因導入受體細胞中②在受體細胞內對目的基因進行大量復制①細菌的質粒：質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。②病毒：λ噬菌體衍生物、動植物病毒等?？键c二：重組DNA技術（基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”）01在基因工程中真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行人工改造的簡言之一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子經過人工改造特殊的標記基因

復制原點

啟動子

終止子

目的基因插入位點質粒的組成要素質粒02質?？键c二：重組DNA技術例3.某細菌質粒上有標記基因如圖所示，通過標記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉入成功。外源基因插入的位置不同，細菌在培養(yǎng)基上的生長情況也不同，如圖所示是外源基因插入位置(插入點有a、b、c)示意圖，請根據表中提供的細菌生長情況，推測①②③三種重組后細菌的外源基因插入點，正確的一組是（

）插入點細菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上的生長狀況細菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上的生長狀況①能生長能生長②能生長不能生長③不能生長能生長A.①是c；②是b；③是aB.①是a和b；②是a；③是bC.①是a和b；②是b；③是aD.①是c；②是a；③是bA考點二：重組DNA技術例4.DNA連接酶是重組DNA技術中常用的一種工具酶。下列相關敘述正確的是（

）A.能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵B.能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵D.DNA連接酶只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端C考點二：重組DNA技術限制酶DNA連接酶載體①對受體細胞無害；②有一個至多個限制酶切割位點；③有特殊的標記基因；④能自我復制或能整合到宿主DNA上。質粒、噬菌體、動植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種類：磷酸二酯鍵來源

：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來

PART03基因工程的基本操作程序考點三：基因工程的基本操作技術（①目的基因的篩選與獲取）（一）目的基因：主要指的是編碼蛋白質的基因概念：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。實例：與生物抗逆性、優(yōu)良品質、生產藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關的基因。（二）篩選合適目的基因：篩選方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選（三）利用PCR獲取和擴增目的基因：DNA半保留復制原理

體外操作環(huán)境對目的基因的核苷酸序列進行大量復制目的可在短時間內大量擴增目的基因優(yōu)點聚合酶鏈式反應全稱它是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。PCR參與的組分在PCR中的作用

前提條件高溫模板DNA4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶引物一定的緩沖溶液(Mg2＋)打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈主要是DNA單鏈或RNA,使耐高溫的DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸已知基因的核苷酸序列提供合適的酸堿度和離子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物通常為20~30個核苷酸。在細胞中為一段單鏈RNA，在PCR中為一段人工合成的單鏈DNA。(2)引物為DNA聚合酶提供了游離的3′端，使DNA聚合酶從3′端延伸子鏈。（DNA聚合酶不具有從頭合成子鏈的功能）

變性

復性

延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈?？键c三：基因工程的基本操作技術（①目的基因的篩選與獲取）5.PCR的結果

由于一個循環(huán)得到的產物又可以作為下一個循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式擴增（約為

，其中n為擴增循環(huán)的次數）。指數2n6.產物進行鑒定PCR過程可以在

中自動完成，完成以后，常采用

來鑒定PCR的產物瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增儀考點三：基因工程的基本操作技術（①目的基因的篩選與獲?。㏄CR技術與DNA復制過程比較比較項目細胞內DNA復制PCR技術區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所主要在細胞核內細胞外(主要在PCR擴增儀內)酶解旋酶、DNA聚合酶等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）溫度細胞內溫和條件控制溫度，需在不同溫度下進行結果合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因聯系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物開始進行互補鏈的合成考點三：基因工程的基本操作技術（①目的基因的篩選與獲?。├?.下列有關PCR技術的敘述,錯誤的是 (

)A.每一次循環(huán)后目的基因的數量可以增加一倍B.PCR反應過程中需要3個不同的溫度范圍C.PCR反應過程中加入的酶的顯著特性是耐高溫D.模板DNA和引物能在每一次擴增中重復使用D考點三：基因工程的基本操作技術（①目的基因的篩選與獲?。├?.在核酸分子雜交技術中,常常使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針(探針是指以放射性同位素、生物素或熒光染料等進行標記的已知核苷酸序列的核酸片段)。為了獲得B鏈作探針,可應用PCR技術進行擴增,應選擇的引物種類是(

)A.引物1與引物2 B.引物3與引物4C.引物2與引物3 D.引物1與引物4C考點三：基因工程的基本操作技術（①目的基因的篩選與獲?。├?．如圖為利用生物技術獲得生物新品種的過程，有關說法不正確的是（）A．a→b過程中一般用4種脫氧核苷酸為原料，并加入兩種引物B．b→c為轉基因綿羊的培育過程，常選用的受體細胞是受精卵C．a→b過程利用了DNA半保留復制的原理，需要使用RNA聚合酶D．b→d為轉基因植物的培育過程，其中④過程常用的方法是農桿菌轉化法C考點三：基因工程的基本操作技術（①目的基因的篩選與獲?。┛键c三：基因工程的基本操作技術（②基因表達載體的構建）（一）目的：①讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代;

（二）組成：質粒①啟動子基因的前端，RNA聚合酶識別和結合的部位；驅動基因轉錄出mRNA②終止子：限制酶切割位點基因的尾端，能終止mRNA的轉錄③標記基因作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來④復制原點⑤目的基因②使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。目的基因插入位點不是隨意的：基因表達載體需要啟動子與終止子的調控，所以目的基因應插入

，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。啟動子和終止子之間的部位考點三：基因工程的基本操作技術（②基因表達載體的構建）首先，用一定的限制酶切割載體，使它出現一個切口；01（三）構建過程：質粒限制酶限制酶切割位點限制酶限制酶切割位點獲取目的基因目的基因然后用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段02DNA連接酶重組DNA分子利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個重組DNA分子。03考點三：基因工程的基本操作技術（②基因表達載體的構建）單酶切用同一種限制酶或產生相同黏性末端的限制酶分別切割質粒和含有目的基因的DNA片段啟動子方向目的基因轉錄方向限制酶切割abcdDNA連接酶連接a、b、c、d四個黏性末端相同缺點一：在DNA連接酶的作用下，質粒被重新環(huán)化。DNA連接酶連接DNA連接酶連接在DNA連接酶的作用下，目的基因被環(huán)化。缺點二：反向連接重組DNAadca缺點三：在DNA連接酶的作用下，目的基因與質粒反向連接，造成目的基因不能正確表達。雙酶切用兩種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA片段。限制酶a切割abDNA連接酶連接限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割ab考點三：基因工程的基本操作技術（②基因表達載體的構建）A.NdeⅠ和BamHⅠB.NdeⅠ和XbaⅠC.XbaⅠ和BamHⅠD.EcoRⅠ和KpnⅠ例8.如圖為某質粒限制酶酶切圖譜。某基因不含圖中限制酶識別序列，為使該基因與該質粒構建重組質粒，切割目的基因和質粒時應該選擇哪兩種酶()A考點三：基因工程的基本操作技術（②基因表達載體的構建）例9.如圖甲、乙中標注了相關限制酶的酶切位點，下列關于培育轉基因大腸桿菌的敘述，錯誤的是（

）A.若通過PCR技術提取該目的基因應

該選用引物甲和引物丙B.圖1中的質粒用BclⅠ切割后，含有

2個游離的磷酸基團C.構建基因表達載體時為了防止目的

基因和質粒的自身環(huán)化，可以選用BamHⅠ和HindⅢ剪切D.在導入目的基因的受體細胞中，四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因不能同時表達C（1）花粉管通道法（我國科學家獨創(chuàng)）方法2：在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。方法1：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中適用生物：開花植物（2）農桿菌轉化法

轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。實質是基因重組。①農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力。Ti質粒上的T-DNA可以轉移到被侵染的受體細胞，并將其整合到該細胞染色體的DNA上。②原理：1.將目的基因導入植物細胞考點三：基因工程的基本操作技術（③將目的基因導入受體細胞）2.將目的基因導入動物細胞（1）常用方法：（2）受體細胞:顯微注射法受精卵①體積大，易操作。②易表現出全能性。（3)過程：構建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物考點三：基因工程的基本操作技術（③將目的基因導入受體細胞）3.將目的基因導入微生物細胞Ca2+處理法實例：利用轉基因大腸桿菌生產藥物Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子

Ca2+處理目的可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。受體細胞（1）原核細胞（常選擇大腸桿菌）（2）優(yōu)點：繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少，易于培養(yǎng)?？键c三：基因工程的基本操作技術（③將目的基因導入受體細胞）考點三：基因工程的基本操作技術（③將目的基因導入受體細胞）種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法；花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞DNA中→表達目的基因表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子考點三：基因工程的基本操作技術（③將目的基因導入受體細胞）A.圖中Ⅰ是質粒，步驟①需要用到限制酶和DNA連接酶B.圖中Ⅱ是含目的基因的重組質粒，步驟②是將重組質粒導入棉花細胞C.圖中Ⅲ是農桿菌，通過步驟③將目的基因導入植物細胞D.剔除培育成功的抗蟲棉體內的四環(huán)素抗性基因不會影響抗蟲基因的表達例10.如圖為科學家通過基因工程培育抗蟲棉時，從蘇云金桿菌中提取抗蟲基因“放入”棉花細胞中，與棉花的DNA分子“結合起來”而發(fā)揮作用的過程示意圖。以下相關說法不正確的是()B考點三：基因工程的基本操作技術（④目的基因的檢測與鑒定）目的：檢測目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性①檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質——“抗原—抗體雜交技術”2.個體生物學水平鑒定1.分子水平檢測抗性檢測：功能活性比較：PCR技術或分

子雜交技術抗蟲、抗病接種實驗；基因工程產品與天然產品的功能活性比較——檢測是否具有抗性以及抗性強度等如：胰島素注射到糖尿病模型小鼠考點三：基因工程的基本操作技術（④目的基因的檢測與鑒定）例11.人血白蛋白在臨床上被廣泛應用。我國科學家通過生物工程技術在水稻胚乳中提取到人血白蛋白，其流程如下圖所示。下列敘述正確的是（）A．PCR擴增時需要DNA模板、引物、耐高溫的RNA聚合酶等條件B．過程①需用農桿菌轉化法將人血白蛋白基因直接導入水稻胚乳細胞中C．過程①需將目的基因與胚乳中特異性表達基因的啟動子等調控元件重組D．過程②改變生長素和細胞分裂素的濃度及比例不影響細胞的脫分化過程C考點三：基因工程的基本操作技術（④目的基因的檢測與鑒定）例12.科研人員利用農桿菌轉化法將抗病毒蛋白基因C導入番木瓜，培育出轉基因抗病番木瓜，所用的Ti質粒如圖所示。下列敘述正確的是（

）A．該技術的原理是農桿菌的擬核DNA與番木瓜基因發(fā)生重組B．構建基因表達載體需要限制酶和耐高溫的DNA聚合酶C．可利用PCR技術篩選出含有抗病毒蛋白基因C的受體細胞D．可利用卡那霉素抗性基因檢測是否成功構建抗病毒番木瓜C考點三：基因工程的基本操作技術（⑤DNA片段的擴增及電泳鑒定）一、實驗原理（一）DNA體外擴增的原理：①PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器，一次PCR一般要經歷30次循環(huán)。②PCR擴增DNA片段還利用了DNA半保留復制的原理；PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。變性90?C延伸72?C退火50?C電泳鑒定原理DNA分子具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構像等有關。（二）DNA片段電泳鑒定原理：考點三：基因工程的基本操作技術（⑤DNA片段的擴增及電泳鑒定）二、實驗步驟（一）DNA片段擴增的具體過程：移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）。擴增：參照下表的參數，設置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。（二）PCR擴增產物電泳鑒定的具體過程：制備凝膠電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。進行電泳將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液(內含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳觀察鑒定取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。①融化：②倒模:③凝固:①加液：②加樣：③電泳：考點三：基因工程的基本操作技術（⑤DNA片段的擴增及電泳鑒定）例13.用PCR方法檢測轉基因植株是否成功導入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標準樣液(Marker)，10號為蒸餾水。PCR時加入的模板DNA如圖所示。據此做出分析不合理的是(

)A.PCR產物的分子大小在250至500bp之間B.3號樣品為不含目的基因的載體DNAC.9號樣品對應植株不是所需的轉基因植株D.10號的電泳結果能確定反應體系等對實驗結果沒有干擾B考點三：基因工程的基本操作技術（⑤DNA片段的擴增及電泳鑒定）A.該DNA最可能是線狀DNA分子B.兩種限制酶在該DNA上各有兩個酶切位點C.限制酶R1與R2的切點最短相距約200bpD.限制酶R1與R2的切點最長相距約800bp例14.在基因工程操作過程中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理某DNA，進行凝膠電泳檢測，結果如圖所示。以下相關敘述中，正確的是()CPART04基因工程的應用考點四：基因工程的應用考點四：基因工程的應用考點四：基因工程的應用考點四：基因工程的應用例15．下列有關基因工程應用的說法，錯誤的是（

）A．將外源生長激素基因導入動物體內可提高動物生長速率B．將必需氨基酸含量多的蛋白質基因導入農作物，提高農產品的品質C．利用基因工程技術，得到的乳腺生物反應器可以解決很多重要的藥品的生產問題D．用轉基因動物作為器官移植的供體時，由于導入的是調節(jié)因子，而不是目的基因，因此無法抑制抗原的合成D例16．科學研究發(fā)現的新技術，要變成實際應用，需要很多的實驗才能應用到實際中。早在2006年，兩個研究小組幾乎同時發(fā)現，將四個特定基因導入處于高度分化的體細胞(如成纖維細胞等)中，可誘導其形成具有胚胎干細胞樣分化潛能的誘導性多能干細胞。雖然至今這項技術還在深入研究，但這項先進技術的潛在應用前景是（

）考點四：基因工程的應用DA．突破干細胞定向分化的障礙

B．改造和優(yōu)化人類基因組結構C．克隆具有優(yōu)良品質的動物個體

D．解決異體組織/器官排斥難題考點四：基因工程的應用B例17．如圖是將目的基因導入大腸桿菌內制備“基因工程菌”的示意圖，其中引物1-4在含有目的基因的DNA上的結合位置如甲圖所示，限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ在質粒上的識別位點如乙圖所示。以下說法錯誤的是（）A．PCR第一輪循環(huán)的產物可作為第二輪反應的模板B．若已經合成了圖甲所示4種引物，應選擇引物2和3擴增目的基因C．過程①中應使用限制酶BamHⅠ切割質粒D．對于轉化失敗的大腸桿菌及其培養(yǎng)基應進行滅菌處理，以防其污染環(huán)境PART05蛋白質工程的原理和應用考點五：蛋白質工程的原理和應用（一）蛋白質工程概念：以蛋白質分子的結構規(guī)律及其與生物功能的關系作為基礎，通過改造或合成基因，來改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類生產和生活的需求?；A

操作方法及對象結果目的蛋白