3.2.2基因工程的基本操作程序課件-高二下學期生物人教版選擇性必修3

1、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代（復制）。2、使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。二、基因表達載體的構(gòu)建——核心問題：

基因能直接進入細胞嗎？最常用的載體是？基因表達載體的作用？不能，必須借助載體質(zhì)粒，小型環(huán)狀雙鏈DNA分子表達：轉(zhuǎn)錄和翻譯轉(zhuǎn)錄條件：啟動子、終止子基因產(chǎn)物：蛋白質(zhì)是否有活性？自主復制基因表達載體的組成——五部分用于篩選重組DNA分子抗生素抗性基因、熒光蛋白基因位置：基因上游作用：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動轉(zhuǎn)錄位置：基因下游作用：終止轉(zhuǎn)錄插入外源DNA注意：①載體與表達載體的區(qū)別：表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：限制酶DNA連接酶③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。（1）啟動子①本質(zhì)一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的____片段②位置位于基因的_____，緊挨_____________③功能*___________________________________________④特殊類型_______________⑤誘導型啟動子的特點

___________________________________________DNA上游轉(zhuǎn)錄的起始位點RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA誘導型啟動子當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達（2）終止子①本質(zhì)一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的____片段②位置位于基因的_____③功能*________________________DNA下游使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)位置功能補充：啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰的堿基mRNA上三個相鄰的堿基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號（不編碼氨基酸）旁欄思考題2.將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？

有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物的總DNA提取出來，花粉管通道法導入受體植物，沒有進行基因表達載體的構(gòu)建。這種方法針對性差，完全靠運氣也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。4.基因表達載體的構(gòu)建過程用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個切口同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段產(chǎn)生相同的末端利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體切口處，這樣就形成了一個重組DNA分子思考：1.切割載體和切割含有目的基因的DNA片段的限制酶應符合什么條件？為什么？2.用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，一定會形成重組DNA分子嗎？3.用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，可能有幾種產(chǎn)物（只考慮兩兩連接）？應為同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶；產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端，以便通過DNA連接酶連接；不一定，載體和目的基因都可能出現(xiàn)自身環(huán)化；三種：載體-載體、目的基因-目的基因、載體-目的基因思考：4.用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，形成的“載體-目的基因”產(chǎn)物一定符合要求嗎？5.如何避免上述問題？6.將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？不一定，目的基因可能反向連接到質(zhì)粒上

同時用兩種限制酶切割含目的基因的DNA片段和載體（使得目的基因的一端與載體一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端與載體另一端的黏性末端相同）

這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w細胞思考：因此，同一種限制酶切割獲得的目的基因和載體混合后加DNA連接酶會出現(xiàn)的連接方式有（僅考慮兩兩連接）：自連兩兩連接目的基因自身環(huán)化載體自身環(huán)化目的基因與目的基因連接載體與載體連接目的基因與載體連接使用一種DNA限制酶進行切割，共有幾種連接情況？選擇2種不同的限制酶同時對目的基因和質(zhì)粒切割，減少自連情況出現(xiàn)；載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1如何解決這一問題？《報》44期P36《金》P91點撥提升P9511、如何防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？雙酶切-G-CTTAA2AATTC-------------------AG-------------------TCTAGGATCT-A-目的基因用酶1和酶2切，則載體也應該用酶1和酶2切酶切后的兩端黏性末端不同《報》44期P36【金】某一質(zhì)粒載體如圖所示，有人將此質(zhì)粒用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：(2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是______________；并且________和________的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是________________________。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________的固體培養(yǎng)基。二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長含有質(zhì)粒載體含有目的基因的重組質(zhì)粒二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長四環(huán)素

由于不同轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品所需要的目的基因不同，受體細胞又有植物、動物、微生物之分，因此基因表達載體的構(gòu)建方法不是千篇一律的,將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法也不是完全相同的。將目的基因?qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎麑⒛康幕驅(qū)胫参锛毎ǚ酃芡ǖ婪ㄞr(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2+處理法三、將目的基因?qū)胧荏w細胞基因槍法（二）將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法1.“轉(zhuǎn)化”概念*______________________________________________________*此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組；2.農(nóng)桿菌特點①能在自然條件下侵染_________和________，而對大多數(shù)__________沒有侵染能力；③隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種

植物也取得了成功。目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程雙子葉植物裸子植物單子葉植物單子葉②農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有______，當它侵染植物細胞后，能將______上的______（___________）____到被侵染的細胞，并且將其______________________；④轉(zhuǎn)入了目的基因的植物細胞，通過

技術可培育出轉(zhuǎn)基因植株，其原理是

。植物組織培養(yǎng)植物細胞具有全能性構(gòu)建基因表達載體Ti質(zhì)粒目的基因含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導入植物細胞目的基因插入染色體DNA中植物細胞植物組織培養(yǎng)表現(xiàn)出新性狀的植株Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA轉(zhuǎn)移整合到該細胞的染色體DNA上思考：該過程經(jīng)過__次拼接、__次導入？①第一次拼接___________________________②第二次拼接______________________________________________________③第一次導入___________________________④第二次導入___________________________將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導入農(nóng)桿菌含目的基因的T-DNA導入受體細胞（非人工操作）《報》44期P33、44.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的具體操作①可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片(即______）_____________，然后___________，并__________；*受體細胞為_______②可以將____直接____在______________中一段時間，然后培養(yǎng)____并獲得____，再進行_____、_____等；*受體細胞為_______外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化細胞再生成植株花序浸沒含有農(nóng)桿菌的溶液植株種子篩選鑒定體細胞受精卵①

是我國的科學家獨創(chuàng)的一種方法。我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是這種方法培育出來的。②操作方法：可以用微量注射器把含有目的基因的DNA溶液直接注入到

。也可以在植物受粉后的一段時間后，剪掉柱頭，將DNA溶液滴注到柱頭切面，使目的基因借助

進入胚囊。1.

花粉管通道法子房花粉管通道法花粉管通道花粉管通道法導入外源DNA操作簡便、直接將目的基因?qū)胧芫眩瑹o需組織培養(yǎng)技術即可獲得植株。（三）將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射法1.受體細胞______2.過程受精卵構(gòu)建基因表達載體并提純利用顯微注射將表達載體注入動物的受精卵中體外胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物*受精卵容易表現(xiàn)出全能性（四）將目的基因?qū)胛⑸锛毎狢a2+處理法1.受體細胞常用________作為受體細胞，其中以_______最廣泛2.原核生物的優(yōu)點

________________________________________3.Ca2+處理法（感受態(tài)細胞法）的一般過程原核生物大腸桿菌繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少、易于培養(yǎng)Ca2+處理大腸桿菌使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達載體導入其中*感受態(tài)細胞*一般利用溫度變化導入原核生物作為受體細胞產(chǎn)生真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，因為其缺少高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器對蛋白質(zhì)加工思考：當真核生物的基因以原核生物作為受體細胞時：1.若無法獲得該蛋白，原因可能是什么？2.以上情況如何解決？3.若可以獲得該蛋白，但是蛋白質(zhì)無活性，原因可能是？4.以上情況如何解決？真核生物的基因有內(nèi)含子，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對應的RNA序列的機制，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對應的RNA序列不能被切除，因此無法表達出該蛋白使用cDNA作為目的基因或使用酵母菌等真核生物作為受體細胞原核生物缺少高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，無法對真核生物的蛋白質(zhì)進行正確的加工人工體外再加工或使用酵母菌等真核生物作為受體細胞實例了解—利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)三.將目的基因?qū)胧荏w細胞1.轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)_____和_____的過程受體細胞維持穩(wěn)定表達①轉(zhuǎn)基因植物用

；②轉(zhuǎn)基因動物用

(一般不能用體細胞)；原因是：

。③微生物常用

等。微生物作為受體細胞的優(yōu)點是

。④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等則受體細胞為

，

原因是

；⑤一定不能用哺乳動物成熟的紅細胞，原因是

。真核細胞分泌蛋白等需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等的加工2.受體細胞的選擇：受精卵有發(fā)育的全能性無核，無器，不能合成蛋白質(zhì)體細胞(葉、芽、根)或受精卵受精卵大腸桿菌、酵母菌繁殖快，單細胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)操作受體生物植物動物微生物受體細胞導入方法受精卵體細胞受精卵細胞/個體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術用Ca2+處理成感受態(tài)細胞《金》P9410、14問題探討1.標記基因篩選呈陽性一定能確定轉(zhuǎn)基因生物培育成功了嗎？2.導入的基因表達載體一定能維持穩(wěn)定和表達出遺傳特性嗎？1.不一定，導入的還可能是空載體、載體-載體連接物，標記基因篩選也是呈陽性，因此僅憑標記基因有無，無法完全確定轉(zhuǎn)基因生物是否培育成功；2.也不一定，需要進行目的基因的檢測與鑒定；類型步驟檢測內(nèi)容方法分子檢測第一步轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA第三步目的基因是否翻譯形成蛋白質(zhì)個體水平鑒定抗性檢測：

；功能活性檢測：

。四、目的基因的檢測與鑒定PCR擴增PCR擴增抗原-抗體雜交技術抗蟲或抗病的接種實驗基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性比較1.目的①檢查目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性；②檢查轉(zhuǎn)基因生物是否培育成功；補充思考：4.如何利用PCR技術檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA？①提取受體細胞的DNA，設計一對引物，可以一個與染色體DNA互補結(jié)合，另一個引物與目的基因互補結(jié)合，這樣只有以重組DNA為模板才能獲得擴增產(chǎn)物（也可以都跟目的基因互補結(jié)合，這樣只有含有目的基因，才能獲得擴增產(chǎn)物），之后再進行電泳檢測；②提取受體細胞的mRNA，進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，用上述方法進行PCR擴增，之后再進行電泳檢測；

分子雜交技術：在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA或mRNA雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因插入成功或轉(zhuǎn)錄出mRNA分子水平的檢測1.檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法：PCR擴增或DNA分子雜交技術M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果DNA分子雜交（Southern-blot)流程圖DNA分子雜交結(jié)果圖原理：堿基互補配對若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因插入成功2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法：PCR擴增或分子雜交技術RNA分子雜交(NorthernBlot)流程圖Bt基因在抗蟲棉中的表達從左至右依次是苗期葉片、花鈴期葉片，苞葉，花，雌雄蕊和鈴殼分子水平的檢測原理：堿基互補配對若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法：抗原-抗體雜交技術蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原雜交轉(zhuǎn)基因生物抗體抗原抗原-抗體雜交帶原理：抗原抗體特異性結(jié)合

從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應的抗體進行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質(zhì)抗原采摘抗蟲棉的葉子飼喂棉鈴蟲，觀察抗蟲效果。個體生物學水平的鑒定抗蟲接種實驗2.個體生物學水平的鑒定具體有哪些做法？轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）感染（抗病接種實驗）未侵染上病斑鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進行功能活性比較功能、活性正常四、目的基因的檢測與鑒定類型檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子水平檢測目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的DNA上DNA分子雜交（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個體水平鑒定

包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。《金》P948、9、12受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，即產(chǎn)生目的蛋白，才能說明目的基因完成了表達。目的基因的表達即產(chǎn)生目的蛋白，而蛋白質(zhì)是通過DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯得到的，因此要檢測目的基因是否成功表達，可以用抗原—抗體雜交（分子水平）或抗性實驗（個體水平）的方法?；蛱结樦荒軝z測出相關基因或mRNA,不能檢測出蛋白質(zhì)，因此應用基因探針不能檢測目的基因是否成功表達。補充思考：3.以上幾種方法的順序是如何的？（1）科學家在培育“黃金大米”時，將ctrⅠ和psy基因?qū)牒琾mi基因的質(zhì)粒中，構(gòu)建了質(zhì)粒pSYN12424。該項研究的目的基因是

，標記基因是

，質(zhì)粒pSYN12424的作用是______。ctrⅠ基因和psy基因pmi基因?qū)⒛康幕蛩腿胨炯毎?）在構(gòu)建質(zhì)粒載體時，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的識別序列？為什么？不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識別序列，限制酶可能將它切斷。（一）實驗原理1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理①PCR利用了DNA的______原理，通過________來控制__________________，PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠___________的儀器②PCR擴增DNA片段還利用了____________的原理；③一次PCR一般要經(jīng)歷___次循環(huán)；熱變性調(diào)節(jié)溫度DNA雙鏈的解聚與結(jié)合自動調(diào)控溫度DNA半保留復制30*復性時不一定均為引物與DNA模板結(jié)合，也存在DNA解開的兩條單鏈的結(jié)合，因此一般在PCR實驗中引物的投入量遠大于產(chǎn)物量（但不能隨意加大濃度）；五、DNA片段的擴增及電泳鑒定2.DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有___________，在一定的___下，這些基團可以帶上______________，在_____的作用下，這些________會_____________________________，這個過程就是_____；②PCR的產(chǎn)物一般通過_____________來鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與_____________、______________________________________等有關*；④凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為_____的______下被檢測出來?？山怆x的基團pH正電荷或負電荷電場帶電分子向著與它所帶電荷相反的電極移動電泳瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度DNA分子的大小和構(gòu)象（遷移速率與之呈負相關）染色300nm紫外燈（EB染色）較小的DNA片段在凝膠中的移動相對容易，較大的DNA片段移動難。當電泳結(jié)束時，比較DNA樣品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(標準)，這些已知大小的片段稱為DNA分子量標準樣。（二）材料用具1.試劑①無菌水、瓊脂糖②電泳緩沖液（TAE或TBE）③凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑——溴酚藍）④核酸染料（常用核酸染料為EB即溴化乙錠）⑤PCR反應體系的配方PCR反應體系的配方10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28-33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1-2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5-10μL總體積50μL2.用具①PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增）②微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）（三）方法步驟1.DNA片段的擴增移液用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分離心待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）反應參照下表的參數(shù)，設置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。循環(huán)程序變性復性延伸預變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃