熒光分光光度計的原理及應用

關于熒光分光光度計的原理及應用2024/4/72024/4/7一、分子熒光的產生1.電子激發(fā)態(tài)的多重度單重激發(fā)態(tài)S：電子自旋方向和處于基態(tài)軌道的電子配對。第一節(jié)熒光分光光度法原理三重激發(fā)態(tài)T：電子自旋方向和處于基態(tài)軌道的電子平行。第2頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2024/4/72.分子能級與躍遷基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射。激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；磷光內轉移外轉移系間跨越延遲熒光傳遞途徑輻射躍遷熒光振動弛預無輻射躍遷第3頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2024/4/7S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2內轉換振動弛豫第4頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2024/4/7二、激發(fā)光譜與熒光光譜1.熒光的激發(fā)光譜曲線

固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與激發(fā)光波長的關系曲線（圖中曲線I

）。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大；第5頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2024/4/72.熒光光譜

固定激發(fā)光波長,化合物發(fā)射的熒光強度與發(fā)射光波長關系曲線(圖中曲線II)。問題：熒光(磷光)的激發(fā)光波長如何選擇？Stokes位移：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長。第6頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2024/4/7三、熒光強度和溶液濃度的關系1定量依據

熒光強度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率

：

If=

Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)

If=

I0(1-10-lc)=

I0(1-e-2.3lc)

濃度很低時，將括號項近似處理后：

If

=2.3

I0lc

=Kc

（濃度高時如何？）第7頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2024/4/7標準曲線法定量：配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度；比較法定量：在線性范圍內，測定標樣和試樣的熒光強度，比較。2定量方法三、熒光強度和溶液濃度的關系第8頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2024/4/7四、熒光、磷光分析方法的特點（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級；為什么？分光光度法所檢測的是兩個較大的信號的微小差別，熒光光度法檢測的是很小背景值上的熒光強度。（2）選擇性強既可依據特征發(fā)射光譜，又可根據特征吸收光譜；（3）試樣量少（4）可提供比較多的物理參數(shù)缺點：應用范圍小。第9頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2024/4/7第二節(jié)熒光分光光度計的組成

測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器成直角。

基本流程如圖：單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器；光源：氙燈?和高壓汞燈，染料激光器檢測器：光電倍增管。第10頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2024/4/7儀

器

光

路

圖問題：參考光電管作用？第11頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2024/4/7第三節(jié)熒光分析法的應用(1)無機化合物的分析與有機試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫熒光法測定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定(2)生物與有機化合物的分析見表第12頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2024/4/7第13頁,共15頁，2024