組織化學(xué)技術(shù)酶組化

關(guān)于組織化學(xué)技術(shù)酶組化2024/4/81※特點：①在原位檢測②檢測酶的活性而不是酶分子本身酶的分類：按生物化學(xué)分類——六大類①氧化還原酶②轉(zhuǎn)移酶③水解酶④裂解酶⑤異構(gòu)酶⑥連接酶常用檢測方法1．沉淀法①金屬沉淀法：Ca++—Co++法；Pb法②偶聯(lián)法：重氮鹽法

③靛原法④四唑鹽法第2頁,共34頁，2024年2月25日，星期天22．后偶聯(lián)法Post-coupling（ACP）3．合成法4．底物膜法設(shè)計半透膜切片/孵育法★★★影響酶組化實驗的關(guān)鍵因素①酶活性的保存a）固定：酶組化的固定劑有教嚴格的限制，不同的酶適用不同的固定劑△抑制酶活性和細胞化學(xué)成分活性的重金屬鹽Hg、Cr、Pb等不能用做固定劑?！魃饔萌?/p>

第3頁,共34頁，2024年2月25日，星期天3b）取材：快捷，實驗準備充分。冰結(jié)切片應(yīng)先備液氮防止酶活性喪失。橫冷箱切片稍固定（丙酮∶氯仿=1∶1）4℃，5～10分鐘，但脂溶性蛋白脫落。②底物濃度A）量要足夠1∶20V/VB）孵育法只能用一次，配制時要適量（節(jié)儉）③PH和滲透壓應(yīng)以緩沖液調(diào)節(jié)④溫度控制與時間：室溫37℃（40min）4℃（5～10min）第4頁,共34頁，2024年2月25日，星期天4⑤捕獲劑亦要求一定濃度，要以反應(yīng)原位瞬時沉淀。⑥激活劑與抑制劑（對照）a）兩者的選擇都應(yīng)具有特異性。b）要有適當?shù)臐舛确秶邥r間：通過實驗自行摸索。任何配方都是一個很大的范圍（指時間），受多種因素的影響，因藥品的質(zhì)量、環(huán)境因素的變化而變化。故不可輕信之。⑧擴散：控制反應(yīng)速度，避免擴散（冰凍切片孵育尤應(yīng)注意）第5頁,共34頁，2024年2月25日，星期天5⑨對照：必須設(shè)立對照，以防非特異反應(yīng)。這對結(jié)果的解釋非常重要?！铩铩飳Y(jié)果的分析，應(yīng)考慮如下幾個問題：①經(jīng)過凍結(jié)或固定后組織細胞破壞，酶究竟能保留多少？②酶是否在原位？③反應(yīng)中多少酶起了作用？④酶的活性是否代表細胞生活時的活性？⑤沉淀的產(chǎn)物是否代表酶蛋白分子，時間延長，會不會改變？⑥是否有擴散移位第6頁,共34頁，2024年2月25日，星期天6

一、鈣—鈷法顯示堿性磷酸酶

AlkalinePhosphatase（ALP）〔原理〕以天然存在的β—甘油磷酸鈉為底物，經(jīng)酶水解釋放出磷酸，立即被鈣離子沉淀為磷酸鈣，再依次被置換為磷酸鈷和硫化鈷，最終產(chǎn)物為黑色的硫化鈷沉淀。反應(yīng)式如下：第7頁,共34頁，2024年2月25日，星期天7第8頁,共34頁，2024年2月25日，星期天〔方法〕標本：大白鼠腎、小腸恒冷溫箱切片（載片）厚6微米。固定：丙酮∶氯仿（1∶1）混合液。4℃2~5′①切片標本入下列孵育液中，37℃，5分鐘孵育液：3％β—甘油磷酸鈉6ml底物保2％巴比妥鈉6ml調(diào)PH證2％氯化鈣（無水）9ml沉淀劑新2％硫酸鎂6ml激活劑

鮮蒸餾水3ml30ml將孵育液混勻，若渾濁可過濾，調(diào)PH至9.4。第9頁,共34頁，2024年2月25日，星期天

②流水流水洗2分鐘后→入蒸餾水③入2％硝酸鈷，5分鐘（小腸可3分鐘）置換Ⅰ④流水洗5分鐘，入蒸餾水。⑤入0.5硫化胺，2分鐘。置換Ⅱ⑥流水洗10分鐘，入蒸餾水。⑦入Mayer氏蘇木精染液(復(fù)染核)1分鐘⑧流水洗5分鐘→蒸餾水。⑨甘油明膠或Apathy糖膠封固。

第10頁,共34頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果：腎小體（近端小管）刷狀緣、小腸絨毛紋狀緣和血管內(nèi)皮出現(xiàn)黑色的硫化鈷沉淀，顯示ALP活性強?！鰽LP為一種膜酶，廣泛存在于腎小管、小腸絨毛、膀胱、腎上腺、包曼氏囊、肝、脾、乳腺及卵巢等細胞膜，與細胞的吸收有關(guān)?！矊φ铡尝贌o底物孵育，以蒸餾水代替孵育液中的3％

β—甘油磷酸鈉，其余各步進行同上。第11頁,共34頁，2024年2月25日，星期天②加熱滅活酶活性。③加抑制劑，左旋咪唑0.1～1.0mmol/L〔注意事項〕①〔Ca2+〕要足量②硫化鈉（NH4）S配置成淡黃色，可提供

S2-〔滴2～3滴〕③用水將鈷離子洗凈，以防止出現(xiàn)假陽性。④有些組織中有色素（含鐵血黃素、黑色素）出現(xiàn)，可影響結(jié)果。★本法可用顯示：5—核苷酸酶、肌蛋白

ATPase、ALP第12頁,共34頁，2024年2月25日，星期天二、鉛法——顯示酸性磷酸酶

（Gomori，1950Lojda，1979）〔原理〕以β—甘油磷酸鈉為底物，在酸性PH下，被ACP水解，釋放出磷酸鹽，遇鉛離子則生成磷酸鉛沉淀。在被S2-置換，最終生成硫酸鉛棕色沉淀。反應(yīng)式如下：★酸性磷酸酶AcidPhosphatas（ACP）第13頁,共34頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共34頁，2024年2月25日，星期天※ACP的特性①PH4.5～5.5適宜②激活劑：Mn2+③抑制劑：NaF，有些ACP為Cu2+、酒石酸鹽、四氧嘧啶甲醛等抑制劑。〔ACP定位〕①溶酶體（顆粒狀）內(nèi)；②溶酶體外ACP存在于ER和胞液。③該酶活性高的器官：腎、肝、腸、脾、腎上腺。第15頁,共34頁，2024年2月25日，星期天〔方法〕標本：大白鼠腎、肝橫冷箱切片（載片），厚6微米。固定：冰凍片或橫冷箱切片。凍融，有時也可用甲醛，但影響活性。本實驗不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1）混合液，4℃，2～5min步驟：①將標本放于下列孵育液中37℃，10～15′

孵育液：0.1M醋酸緩沖液，PH5.215ml0.24％硝酸鉛15ml第16頁,共34頁，2024年2月25日，星期天3％β—甘油磷酸鈉3ml33ml

混勻，置37℃水浴中15～30分鐘后，過濾。②于37℃蒸餾水中洗2次，每次1分鐘。（溫蒸餾水洗）③入5％硫化胺，1～2分鐘。④流水沖洗3～5分鐘后，換蒸餾水。（可用Mayer蘇木素復(fù)染核）⑤用甘油明膠或Apathy氏糖膠封固。第17頁,共34頁，2024年2月25日，星期天〔結(jié)果〕酶活性部位→棕黑色硫化鉛沉淀。分布于腎近曲小管細胞核周圍，肝細胞毛細膽管周圍均有棕黑色顆粒?！矊φ铡撤跤簝?nèi)加0.01MNaF（13.9mg/33ml）→（—）〔注意事項〕①鉛離子的濃度→關(guān)鍵問題，沒有底物，有些組織吸附鉛離子（+），因此必須用NaF

抑制酶活性→排除假陽性反應(yīng)。②孵育時間不可過長，否則染色擴散或核染色。第18頁,共34頁，2024年2月25日，星期天［應(yīng)用范圍］“鉛法”適用于：ACP，5’--核苷酸酶G—6—P酶;膜ATPaseMito—ATPaseTTPase（硫胺素焦磷酸酶）三、偶氮偶聯(lián)法顯示ACP［原理］以奈酚的衍生物磷酸脂NaphtholAS—BLPhosphate為底物，在酸性PH（5.2）下，經(jīng)酸性磷酸酶水解釋放出NapholAS—BI，立即與六氮化對品紅偶聯(lián)，生成紅色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。第19頁,共34頁，2024年2月25日，星期天［方法］標本：大白鼠腎、肝橫冷箱切片（載片），厚6微米。不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1）混合液內(nèi)，4℃，2～5min①標本入下列孵育液，37℃，30～60分鐘。孵育液：磷酸奈酚AS—BI15mg

溶于二甲基亞砜0.6ml六氮化對品紅緩沖液30ml30.6ml

第20頁,共34頁，2024年2月25日，星期天充分混勻并過濾②蒸餾水洗③入Mayer蘇木精內(nèi)染1分鐘。④流水沖5分鐘后入蒸餾水。⑤用Apathy糖膠或甘油明膠封固。［結(jié)果］酶的活性部位呈紅色，核蘭色。分布于腎近端小管核周，肝毛細膽管周圍。※ACP是溶酶體的標志酶。※※六氮化對品紅液的配制（30ml）第21頁,共34頁，2024年2月25日，星期天①4％對品紅鹽酸溶液堿性品紅400mg

濃鹽酸2ml

蒸餾水8ml②4％NaNO3配好后于冰箱保存用時取1ml。①+②等量混勻（各取1ml），蓋嚴并置室溫靜止一分鐘，待混合液變?yōu)榈S色→倒入28ml2.72％醋酸鈉溶液，用1NNaOH調(diào)PH至5～5.5即成。第22頁,共34頁，2024年2月25日，星期天四、四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶

［對照］用抑制劑NaF濃度為10mmol/LCa2+濃度為10mmol/L［注意事項］①六氮鹽濃度不能太高②背景會略帶黃色［應(yīng)用范圍］本法用于ALP、ACP、非特異性脂酶。第23頁,共34頁，2024年2月25日，星期天［原理利用］利用H受體的H2，使四唑還原成甲月替：反應(yīng)式如下：第24頁,共34頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共34頁，2024年2月25日，星期天本實驗：以琥珀酸（鈉鹽）為底物，在酶的作用下脫氫，人工合成的硝基藍四唑（nitroBT）為受H體，其接受H后被還原成甲月替

呈紫色以代表琥珀酸脫氫酶的活性?！晁崦摎涿甘蔷€粒體的標志酶之一?！饕种莆铮罕猁}（競爭抑制），磷酸鹽，氯化物，蘇拉明草酰乙酸（競爭抑制）凡與-SH基化合的作用劑皆抑制其活性。［方法］第26頁,共34頁，2024年2月25日，星期天標本：大白鼠肝、腎或心肌。橫冷箱切片，后6微米不固定。步驟：①將標本放入下列孵育液中，37℃，約5分鐘。孵育液：nitroBT10mg0.1MPBS，PH7.810mlPMS（吩嗪硫酸甲酯）1mg

徐徐加溫，使其溶解，冷卻過濾。再加入琥珀酸鈉80mg②蒸餾水洗凈第27頁,共34頁，2024年2月25日，星期天③Apathy氏液糖膠封固［結(jié)果］酶活性部位成藍紫色沉淀。此標本內(nèi)所見藍紫色顆粒即線粒體。［對照］孵育液去底物，加入等量蒸餾水，同時孵育（—）［注意］①甲月替易溶于脂，反應(yīng)擴散時組織內(nèi)脂滴被染。②加入PMS（中間遞氫體）定位更加準確。③如果聚乙烯醇PVA，可以保護線粒體膜，使反應(yīng)局限在線粒體內(nèi)。［應(yīng)用范圍］適用于：甲胺氧化酶、乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶。第28頁,共34頁，2024年2月25日，星期天五、DAB法顯示過氧化物酶〔原理〕過氧化物酶分解H2O2的過程中，下面反應(yīng)不直接發(fā)生：AH2（供氫體）+H2O2→A（供氫體的氧化物）+2H2O2實驗可知，有稱為復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氫體）復(fù)合體生成，在復(fù)合體最后分解為酶和水時，游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學(xué)中所使用的供氫體應(yīng)是含有色原性基團的發(fā)色物質(zhì)，如奈酚和聯(lián)苯胺。第29頁,共34頁，2024年2月25日，星期天〔光鏡顯示方法〕（1）孵育液的配置：預(yù)孵育液：

DAB4HCL10mg

溶于蒸餾水5ml0.2M磷酸緩沖液（PH6.5）5mlFahimi孵育液:

DAB4HCL10ml

溶于蒸餾水5ml0.2M磷酸緩沖液（PH6.5～7.0）5ml第30頁,共34頁，2024年2月25日，星期天0.3％H2O20.1mlGraham—K孵育液：

DAB4HCL5mg0.05MT—H緩沖液（PH7.6）