金屬銥配合物Ir(bzq)2(DIPPA)PF6合成及其抗腫瘤活性研究

金屬銥配合物[Ir(bzq)2(DIPPA)]PF6合成及其抗腫瘤活性研究【摘要】目的：設(shè)計合成金屬銥配合物[Ir(bzq)2(DIPPA)]PF6及研究其抗腫瘤活性。方法：以DIPPA為配體，設(shè)計并合成了金屬銥配合物[Ir(bzq)2(DIPPA)]PF6，采用HR-MS、1HNMR，等方法對其進行表征，選取HCT116、LO2、B16、BEL-7402、A549、HepG2、Hela這七種細(xì)胞，用MTT法測定銥配合物對這7種細(xì)胞的毒性作用，通過細(xì)胞內(nèi)吞和細(xì)胞周期阻滯實驗，初步探索銥配合物對HCT116細(xì)胞的抗癌活性。結(jié)果：MTT體外毒性篩選實驗表明銥配合物對所選的腫瘤細(xì)胞具有明顯毒性，其中對HCT116細(xì)胞的毒性最強，因此將HCT116細(xì)胞作為后續(xù)實驗的研究對象。細(xì)胞內(nèi)吞實驗表明銥配合物能夠被HCT116細(xì)胞攝取，細(xì)胞周期實驗表明銥配合物將HCT116細(xì)胞的周期阻滯在S期。結(jié)論：銥配合物[Ir(bzq)2(DIPPA)]PF6具有抑制HCT116細(xì)胞增殖的作用，并將HCT116細(xì)胞生長阻滯于S期。【關(guān)鍵詞】銥配合物；細(xì)胞毒性；線粒體定位；抗癌活性SynthesisofMetalIridiumComplex[Ir(bzq)2(DIPPA)]PF6AntitumorActivityStudy[Abstract]Objective:Todesignandsynthesizethemetaliridiumcomplex[Ir(bzq)2(DIPPA)]PF6andtostudyitsantitumoractivity.Methods:UsingDIPPAasaligand,Designedandsynthesizedthemetaliridiumcomplex[Ir(bzq)2(DIPPA)]PF6,ByusingtheHR-MS,1HNMR,Andothermethodstocharacterthem.Subsequently,HCT116,LO2,B16,BEL-7402,A549,HepG2,Helawereselected,ThetoxiceffectsofiridiumcomplexesontheabovesevencellsweredeterminedbyMTTassay,Bythecellendocytosisandcellcyclearrestassay,InitiallyexploretheanticanceractivityofiridiumcomplexesinHCT116cells.Results:MTTinvitrotoxicityscreeningexperimentshowedthatiridiumcomplexesshowedobvioustoxicitytotheselectedtumorcells,whichwasthemosttoxictoHCT116cells,soHCT116cellswereusedasthefollowingexperiments.CellendocytosisexperimentsshowedthattheiridiumcomplexisefficientlyuptakenbyHCT116cells,andcellcycleexperimentsshowedthatiridiumcomplexesarrestthecycleofHCT116cellsinSphase.Conclusion:Iridiumcomplex[Ir(bzq)2(DIPPA)]PF6suppressesHCT116cellproliferationandblocksHCT116cellgrowthinSphase.[Keywords]IridiumComplexescytotoxicmitochondrial-localizedanticanceractivity目錄TOC\o"1-3"\h\u1前言 12實驗材料 前言隨著現(xiàn)代生活質(zhì)量的不斷提高，人們生活水平也隨之不斷改善，對健康問題也更加有所關(guān)注。雖然如今科學(xué)技術(shù)和醫(yī)療水平與從前相比已經(jīng)有了非常大的躍升，針對許多疑難雜癥的研究也已經(jīng)取得了較多突破，但由疾病給人們生活所帶來的影響仍然如懸掛在人們頭上的利刃一般揮之不去。迄今為止，癌癥仍然是全球難以解決的疾病難題之一。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)表明，到2025年，每年將有約2000萬例新確診的癌癥患者[1]。癌癥，又稱為惡性腫瘤，是一類極具復(fù)雜性和多樣性的疾病，惡性腫瘤的產(chǎn)生受多方面因素的影響，如遺傳因素、環(huán)境污染、不良的生活習(xí)慣等都和癌癥發(fā)病率不斷升高有著密切的關(guān)系，癌癥已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人們的生命健康[2]。全球的癌癥病例數(shù)仍然在上升，一直以來，癌癥的治療一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點，抗腫瘤藥物研究與開發(fā)也一直是癌癥治療的重中之重，針對各種腫瘤的藥物研發(fā)是迫在眉睫的任務(wù)。當(dāng)下，治療癌癥常用的手段主要包括手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)藥物治療及分子靶向治療等方法。迄今為止，臨床上最常見的治療手段仍然以高效的化學(xué)藥物治療為主，因為它具有療效高等特點。傳統(tǒng)化療藥物能夠殺死腫瘤細(xì)胞，減緩癌細(xì)胞的生長擴散，使患者的生存期得到了延長的同時能夠減輕患者的痛苦。分子靶向藥物是一種針對特定分子靶點的抗癌藥物，具有應(yīng)用范圍廣泛、治療效果好的優(yōu)點。然而，對于一些沒有明確靶點的腫瘤類型及患者，仍需依賴傳統(tǒng)化療藥物的治療方法。迄今為止，因化學(xué)治療藥物具有療效高等特點，已有150多種化學(xué)治療藥物應(yīng)用于臨床[3]。隨傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物使用的增多，傳統(tǒng)化療藥物的缺陷也逐漸不斷顯現(xiàn)，如在治療初期具有較好的治療效果，而在治療持續(xù)時間較長后導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥性，使得癌細(xì)胞無法徹底清除等。順鉑具有一些副作用，這促使人們?nèi)ラ_發(fā)出更好的鉑類藥物[4]?？ㄣK和奧沙利鉑雖然改善了順鉑本身的一些缺點，應(yīng)用也變得更加廣泛，但仍然無法完全克服組織毒性和腫瘤細(xì)胞耐藥性等特點。研究者們便又致力于研究具有低毒性、靶向性高、溶解度好的抗惡性腫瘤的金屬藥物，期望彌補鉑類金屬藥物的缺陷。在尋找新藥物的過程中，研究者們發(fā)現(xiàn)金屬銥化合物具有與鉑類藥物類似的功效，且毒性更低。由此，近年來，金屬銥化合物走進了廣大研究者們的視野中，國內(nèi)外許多科學(xué)家們紛紛投入到對金屬銥配合物的研究當(dāng)中。典型的銥配合物主要是由銥為核心和配體形成的配合物，發(fā)光性能與常見的有機熒光團相比有更長發(fā)光壽命，可通過改變配體來調(diào)控銥配合物的性能。由此它們得到人們的關(guān)注，被廣泛用于生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域[5]。雖然銥配合物作用機制比較復(fù)雜且仍無法準(zhǔn)確說明，但這并不妨礙廣大醫(yī)學(xué)工作者們將其視為一種極具抗腫瘤潛力的藥物來研究與開發(fā)。銥(Ⅲ)配合物能靶向多種細(xì)胞組織并影響其結(jié)構(gòu)和功能，表現(xiàn)出獨特的抗腫瘤活性，是目前金屬抗腫瘤藥物特別是PDT光敏劑方向的研究熱點[6]。雖然目前金屬銥配合物的抗腫瘤機制還不能被完全闡明，但這并不妨礙廣大研究者們將其作為一種潛在的抗腫瘤藥物而對其進行更加深入的研究。多聯(lián)吡啶環(huán)金屬銥(III)配合物具有優(yōu)異的發(fā)光和抗腫瘤性能。設(shè)計合成了一種多聯(lián)吡啶配體PhbpyOH，利用該配體制備了銥(III)配合物Ir-NNC，紫外滴定實驗和分子對接模擬結(jié)果表明，配合物Ir-NNC能進入DNA的小溝區(qū)，配合物可與BSA的ⅠB亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)的谷氨酸和天冬氨酸發(fā)生氫鍵結(jié)合[7]。以乙基香蘭素、1,10-菲羅啉、2-苯基吡啶和三氯化銥為原料，設(shè)計合成了一種新型的基于陽離子型銥配合物的熒光探針(LIr)，用熒光光譜法研究了探針LIr對黏度的響應(yīng)性質(zhì)，結(jié)果表明探針LIr識別黏度具有專一性，其熒光強度可增強約140倍，由于探針LIr對細(xì)胞的毒性較低，可將其應(yīng)用于細(xì)胞成像研究[8]。Ma等人將銥化合物與兩性聚合物PS-PEG-COOH結(jié)合，制備出了納米銥化合物，經(jīng)進一步的研究發(fā)現(xiàn)，該化合物能作用于癌細(xì)胞的線粒體內(nèi)使ROS含量升高，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。Kuang等報道了以蒽醌三聯(lián)吡啶衍生物作為主配體的銥配合物，該配合物在雙光子PDT治療厭氧腫瘤方面具有良好的應(yīng)用前景[10]。以上均說明了金屬銥配合物具有良好的應(yīng)用前景，越來越多的作用靶點和作用機制被闡明也為銥及其配合物的抗腫瘤活性研究帶來了眾多可能，雖然銥配合物在抗癌領(lǐng)域的研究還處在初級階段，但其在未來的應(yīng)用前景非常廣闊。綜上所述，鉑類生物抗癌活性的研究發(fā)現(xiàn)以及臨床應(yīng)用給了我們研究金屬化合物抗癌帶來了啟示，同時在治療基礎(chǔ)上為了解決鉑類藥物的不足，研發(fā)設(shè)計了多種金屬配合物銥配合物在抗腫瘤領(lǐng)域領(lǐng)域的應(yīng)用前景可謂是非常廣闊。本文正是基于銥配合物的廣闊應(yīng)用前景下，合成銥配合物[Ir(bzq)2(DIPPA)]PF6，通過對一系列細(xì)胞的體外毒性篩選，并通過進一步的實驗探究其抗癌作用。與此同時，期待未來可得到療效更好、副作用更小的抗腫瘤藥物。實驗材料2.1實驗試劑生物化學(xué)試劑購買廠商實驗細(xì)胞株AmericantypeculturecollectionDMEM培養(yǎng)基美國Gibco公司新生牛血清廣州瑞舒生物有限公司胎牛血清美國Gibco公司胰蛋白酶廣州瑞舒生物有限公司MTTBeyotime公司Ttiyon-100美國MP公司RNaseABeyotime公司JC-1試劑盒Beyotime公司ROS試劑盒Beyotime公司DHE試劑盒Beyotime公司NO試劑盒Beyotime公司PI廣州康龍生物科技有限公司PVDF膜廣州康龍生物科技有限公司AnnexinV-FITC/PI試劑盒Beyotime公司BCA工作液北京索萊寶科技有限公司W(wǎng)B一抗CellSignalingTechnology公司W(wǎng)B二抗廣州瑞舒生物有限公司超敏型ECL試劑盒AffinityBiosciences結(jié)晶紫珠海嘉億生物科技有限公司IrCl3·H2O昆明鉑銳金屬材料有限公司二氯甲烷廣州化學(xué)試劑廠甲醇廣州化學(xué)試劑廠丙酮廣州化學(xué)試劑廠DMSO廣州化學(xué)試劑廠六氟磷酸胺上海笛柏生物科技有限公司濃硫酸廣州化學(xué)試劑廠濃硝酸廣州化學(xué)試劑廠注：沒有額外的說明，所有購買的試劑均為分析純，可直接使用。2.2實驗儀器實驗儀器儀器型號生產(chǎn)廠家超凈工作臺SJ-CJ-2FD蘇潔醫(yī)療器械有限公司二氧化碳培養(yǎng)箱371美國熱電賽默飛光學(xué)生物顯微鏡CKX31-A11RC奧林巴斯公司低溫高速離心機TGL-16M上海盧湘儀儀器有限公司高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)ImageXpressMcroXLSMOLECULARDEVICES磁力攪拌器RCTIKA儀器設(shè)備有限公司流式細(xì)胞儀A00-1-1102貝克曼庫爾特生物有限公司電熱鼓風(fēng)干燥箱DHG-9140A上海朗儀器設(shè)備廠移液槍F2賽默飛世爾科技有限公司多功能酶標(biāo)儀SpectraMaxM5e美國MolecularDevices公司顯微鏡CKX31-A11RC奧林巴斯公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RV10digitalV德國IKA公司實驗方法3.1配體及配合物的合成3.1.1配體及配合物合成路線配體DIPPA及金屬銥配合物合成路線見圖1圖SEQ圖\*ARABIC1配體DIPPA及金屬銥配合物合成路線3.1.2配體DIPPA的合成稱取0.198g（1mmol）的原料2-氨基-4，6-二氯嘧啶-5-甲醛和5，6-二氨基-1,10-鄰二氮菲0.210g（1mmol），將原料于電子天平精確稱量好后置于三頸燒瓶中，加入10ml乙醇充分?jǐn)嚢?，加熱回流反?yīng)24h，并在反應(yīng)過程中要根據(jù)反映情況進行補液，每次加入5-10ml乙醇溶液，待反應(yīng)結(jié)束并冷卻至室溫，通過真空旋蒸干燥后得到深棕色粉末。3.1.3[Ir(bzq)2(DIPPA)]PF6的合成氬氣保護狀態(tài)下，取原料cis-[Ir(bzq)2Cl]20.234g(0.2mmol)和配體DIPPA0.152g(0.4mmol)，溶解在30ml二氯甲烷和15ml甲醇溶液，加熱回流反應(yīng)6h，待反應(yīng)冷卻至室溫，向三頸燒瓶加入六氟磷酸銨（過量），充分?jǐn)嚢?0min，反應(yīng)完全后對反應(yīng)溶液進行抽濾得顏色較深的棕色溶液，將該溶液收集到燒杯中去除液體后得到棕色粉末。對所得產(chǎn)物進行進一步的純化，用中性氧化鋁柱層析（二氯甲烷/丙酮，6:1開始梯度洗脫，v/v），收集其中的黃帶溶液，濃縮得到純的產(chǎn)物。Yield:77%.C43H25Cl2IrN9PF6HRMS(CH3CN):m/z=930.1227([M-PF6]+).1HNMR(DMSO-d6,500MHz):9.13(q,1H),9.07(d,1H,J=8.25Hz),8.51(d,2H,J=8.85Hz),8.11-8.09(m,3H),8.02-7.97(m,6H),7.88(d,2H,J=8.85Hz),7.58(d,3H,J=7.90Hz),7.44-7.41(m,2H),7.22(t,2H,J=7.55Hz),6.28(d,2H,J=7.00Hz).3.2金屬配合物體外抗腫瘤機制研究方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)本實驗所需細(xì)胞株包括HCT116、LO2、B16、BEL-7402、A549、HepG2、Hela。培養(yǎng)箱環(huán)境條件為37oC、95%相對濕度，二氧化碳濃度恒定為5%。采用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清（FBS）,細(xì)胞密度生長至約80%時說明進入傳代狀態(tài)，取生長良好的對數(shù)期細(xì)胞進行后續(xù)實驗。（上述均為貼壁細(xì)胞，傳代時可先用胰酶消化，待細(xì)胞可從培養(yǎng)瓶壁大塊脫落后，再用等量培養(yǎng)液終止消化，吹打細(xì)胞使其完全離壁即可。）3.2.2體外細(xì)胞毒性試驗體外活性檢測是篩選抗腫瘤藥物的重要方法[11]?？鼓[瘤藥物體外篩選方法有許多，最常見的包括流式細(xì)胞儀法、同位素滲入法、MTT比色法、ATP熒光法和SRB法[12]。MTT比色法可快速、準(zhǔn)確地檢測活細(xì)胞的數(shù)量，且操作簡單、重復(fù)性強，因此，它已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒性、細(xì)菌活力檢測和抗癌藥物活性篩選等領(lǐng)域，取得了良好的效果[13]。MTT比色法是利用活細(xì)胞線粒體產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶將噻唑藍(lán)還原為水不溶性藍(lán)紫色甲臜晶體并沉積在細(xì)胞中，用二甲亞砜溶解甲臜，測量溶液在一定波長下的光吸收值，光吸收值與活細(xì)胞數(shù)量成正比，而死細(xì)胞則無此功能[14]?？筛鶕?jù)公式計算出金屬銥配合物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。操作步驟：操作前所有實驗儀器都要滅菌消毒。在無菌工作臺上，選取具有良好生長狀態(tài)的細(xì)胞接種到96孔板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞匯合度約70%，更換培養(yǎng)液。將銥配合物原液稀釋成6個梯度濃度，每組設(shè)6個平行孔，將配制好的樣液分別加入到6組中，使每個孔板濃度達到，用DMSO作對照，排除其它外界因素對本實驗造成的干擾。將96孔板置于培養(yǎng)箱中培育48h。棄舊液，各孔中倒入90μL培養(yǎng)液和10μLMTT染色液(5mg/mL)，充分混合后在培養(yǎng)箱中孵育4h。倒掉舊液后在各孔中放100μLDMSO。為確保甲臜全部溶解，本實驗使用了微量振蕩器，時間約10分鐘，至甲臜晶體完全溶解，最后再用酶聯(lián)免疫檢測儀測定在490nm波長下每孔的光吸收值，用下面公式中進行細(xì)胞存活率計算：以金屬銥配合物的濃度和細(xì)胞存活率分別為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算細(xì)胞存活率為50%時所對應(yīng)的金屬銥配合物濃度（IC50）。3.2.3細(xì)胞內(nèi)吞本實驗通過ImageXpressMcroXLS定性檢測分析細(xì)胞對金屬銥配合物的攝取程度。操作步驟：操作前所有實驗儀器均需要滅菌消毒。取生長狀態(tài)良好的HCT116細(xì)胞接種到12孔板，細(xì)胞貼壁后加入濃度為IC50的金屬銥配合物放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。然后棄去培養(yǎng)液，用PBS潤洗2-3遍，加入75%乙醇(300μL/孔)固定約20min。緩沖液洗滌2遍，用Hoechst染液在36oC下避光染色30min。緩沖液洗滌2遍，避光上機拍照檢測。3.2.4細(xì)胞凋亡檢測原理：采用AnnexinV-FITC-PI染液雙染法對正常生長的細(xì)胞進行染色，然后利用流式細(xì)胞儀檢測[15]即可得到早凋細(xì)胞（LR)，晚凋細(xì)胞（UR），壞死細(xì)胞(UL)及正常細(xì)胞(LL)之間的比例關(guān)系。操作步驟：操作前所有實驗儀器均需要滅菌消毒。在無菌工作臺上，將生長狀態(tài)良好的HCT116細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)目約3×106，培養(yǎng)箱中培育24h,待孔板中的細(xì)胞生長至80%匯合的理想狀態(tài)。實驗組加入IC50的銥配合物，設(shè)置空白對照組，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。緩沖液洗滌兩次，胰液消化，收集細(xì)胞懸液，離心機離心5min(轉(zhuǎn)速1000)，棄上清液，緩沖液洗滌細(xì)胞兩遍。避光環(huán)境下依次向樣品中加入195μL膜聯(lián)結(jié)合液，8μLAnnexinV-FITC及11μLPI，混懸均勻，避光培養(yǎng)15min。混合均勻后倒入流式管中，用流式細(xì)胞儀進行檢測。3.2.5線粒體定位原理：線粒體是一種具有半自主性的細(xì)胞器。許多研究結(jié)果表明一些藥物能夠?qū)⒕€粒體作為治療疾病的靶點，進行研發(fā)新的治療藥物，從而取得較為良好的治療效果。如原阿片堿能利用線粒體凋亡途徑來抑制肝癌細(xì)胞[16]?？梢娋€粒體可作為治療癌癥的一個關(guān)鍵靶點，可對其進行更加深入的研究，研發(fā)潛在抗癌藥物。許多小分子熒光染料，如JC-1、Mito-TrackerRed（MTR）等商用染料，已用于細(xì)胞成像[17]。操作步驟：操作前所有實驗儀器均需要滅菌消毒。取生長良好的細(xì)胞接種于12孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。加入IC50的銥配合物作用4h。接著PBS洗滌2遍，每孔加入200μL稀釋后的MitoTrackerRed染液，于37oC條件下避光染色30min。PBS洗滌2遍，避光上機拍照。3.2.6線粒體膜電位變化檢測原理：JC-1是一種應(yīng)用于檢測高等動物細(xì)胞線粒體膜電位變化的染料，在細(xì)胞內(nèi)以紅色聚合物和綠色單體這兩種形式存在。可通過熒光顏色的變化情況檢測線粒體膜電位變化[18]。操作步驟:操作前所有實驗儀器均需要滅菌消毒。選取具有良好生長狀態(tài)的細(xì)胞接種于12孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。然后加入IC50的銥配合物作用24h。緩沖液洗滌2遍，向陽性孔提前30min加入250μL稀釋后的cccp(細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑)染色半小時，洗滌兩次，再每孔加入200μL稀釋后的JC-1染液(雙蒸水：5×緩沖液：JC-1＝160：40：1)，避光上機拍照。3.2.7細(xì)胞周期檢測通常將細(xì)胞周期分為G0、G1、S、G2、M共計五個子周期。分裂間期由G1、S和G2期組成，分裂期由G0、M期組成。某些細(xì)胞受到來自體內(nèi)或外界環(huán)境的刺激時，會出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象[19]。利用75%乙醇的高滲透性，可迅速透過細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)部，再用碘化丙啶（PI）染色。通過流式細(xì)胞儀測定，即得出細(xì)胞處于各生長周期的占比。PI可透過破損的細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合后發(fā)出紅色熒光，熒光強度與DNA含量正相關(guān)[20]。操作步驟：操作前所有實驗儀器均需要滅菌消毒。在無菌工作臺上，選取具有良好生長狀態(tài)的HCT116細(xì)胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞生長密度約80%。將金屬銥配合物加入實驗組，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。將細(xì)胞用緩沖液洗5次，然后用胰蛋白酶消化，最后離心。收集細(xì)胞，用PI染色，避光上機拍照。實驗結(jié)果4.1MTT法體外細(xì)胞毒性試驗本實驗采用MTT比色法，用合成的金屬銥配合物對上述7種細(xì)胞進行金屬銥配合物的體外毒性篩選實驗，篩選結(jié)果見表1。表1銥配合物的IC50(μM）篩選結(jié)果由表1可知，金屬銥配合物對A549、B16、HCT116三種癌細(xì)胞的IC50值較小，說明該金屬銥配合物對這些細(xì)胞均有一定的抑制作用。IC50值越小，說明金屬銥配合物的抗癌作用越好。此外，該金屬銥配合物對LO2細(xì)胞的IC50值較大，說明金屬銥配合物對人正常肝臟細(xì)胞影響較小。由于該金屬銥配合物對HCT116細(xì)胞較敏感，所以選用此細(xì)胞作為后續(xù)抗癌活性研究的細(xì)胞培養(yǎng)對象。4.2細(xì)胞內(nèi)吞試驗圖2細(xì)胞內(nèi)吞熒光由圖2可知，Hoechst染料進入細(xì)胞后可發(fā)出藍(lán)色熒光，HCT116細(xì)胞經(jīng)過金屬銥配合物處理后可發(fā)出明顯的綠色熒光，并且能夠與Hoechst染料發(fā)出的藍(lán)色熒光相疊加。此實驗結(jié)果表明，本實驗所研究的金屬銥配合物能被細(xì)胞有效攝取，從而能夠在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮活性抑制作用。4.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡圖3銥配合物作用24h后HCT116細(xì)胞凋亡百分比由圖3可知，空白對照組中正常細(xì)胞占95.3%、早凋細(xì)胞占2.43%、晚凋細(xì)胞占2.13%。加入金屬銥配合物作用24h后，正常細(xì)胞下降至84.4%，早凋細(xì)胞和晚凋細(xì)胞分別上升至12.3%和3.17%。由實驗結(jié)果表明，與空白組相比，實驗組的細(xì)胞凋亡率都有了較明顯的提高，這說明本實驗的金屬銥配合物可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡。4.4線粒體定位為了探究該金屬銥配合物是否作用于HCT116細(xì)胞的線粒體，本實驗對其在細(xì)胞內(nèi)線粒體的定位進行了定性分析。圖4線粒體定位熒光如圖4所示，紅色熒光為線粒體定位探針標(biāo)記的熒光，綠色熒光為金屬銥配合物本身自發(fā)的熒光，二者熒光重疊表明該金屬銥配合物能夠定位于細(xì)胞線粒體，并以線粒體為靶點從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗癌活性作用。4.5線粒體膜電位變化檢測當(dāng)細(xì)胞活性下降時，線粒體通透性增加。JC-1是一種能夠特異性標(biāo)記去極化線粒體的染料。通過紅、綠熒光的比值來衡量線粒體去極化的比例，從而確定該金屬銥配合物是否可使線粒體的膜電位發(fā)生變化而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。圖5金屬銥配合物作用24h后的線粒體膜電位變化圖如圖5所示，空白組紅色熒光較強，而金屬銥配合物的實驗組的綠色熒光顯著增強，實驗結(jié)果表明，該金屬銥配合物能作用于細(xì)胞線粒體，使線粒體膜電位下降，破壞線粒體的正常功能，從而導(dǎo)致HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡。4.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期阻滯為了探究該金屬銥配合物在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時能否抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，對該金屬銥配合物作用HCT116細(xì)胞后的細(xì)胞周期進行檢測。圖6細(xì)胞周期阻滯觀察圖6可知，在空白組中S期中的細(xì)胞百分比為17.17%，G0/G1期的細(xì)胞百分比為71.67%，G2/M期的細(xì)胞百分比為11.16%；用IC50濃度的金屬銥配合物作用24h后，G0/G1期的細(xì)胞百分比為67.0%，G2/M期的細(xì)胞百分比為7.64%，S期細(xì)胞百分比為25.29%，增長量為8.12%。由以上結(jié)果可知，該金屬銥配合物主要將細(xì)胞生長周期阻滯在S期，從而抑制癌細(xì)胞生長。結(jié)論本實驗中，以5，6-二氨基-1,10-鄰二氮菲為原料合成的配體DIPPA，通過與前體化合物進行反應(yīng)，最終合成了該金屬銥配合物，對其進行純化，采用HR-MS、1HNMR等方法對其進行表征。為了檢測金屬銥配合物在體外抑制癌細(xì)胞的活性效果，對所選取的7種細(xì)胞進行了MTT比色法體外細(xì)胞毒性試驗，根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，金屬銥配合物對所選取的幾種癌細(xì)胞均有一定的抑制作用，其中，HCT116細(xì)胞的IC50最小，說明金屬銥配合物對該細(xì)胞抑制活性最強，故選擇HCT116細(xì)胞作為后續(xù)進行抗腫瘤活性檢測實驗。在細(xì)胞內(nèi)吞實驗中，由于細(xì)胞核染料Hoechst及金屬銥配合物自身所發(fā)出熒光的不同，可發(fā)現(xiàn)金屬銥配合物能夠被細(xì)胞攝取從而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。線粒體定位實驗表明，該金屬銥配合物可定位于線粒體，使線粒體膜電位降低，從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡；此外，銥配合物作用于癌細(xì)胞后，早凋細(xì)胞和晚凋細(xì)胞百分比明顯升高，表明金屬銥配合物能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期實驗表明銥配合物將細(xì)胞分裂周期阻滯在S期，從而有效抑制癌細(xì)胞的生長。通過一系列的實驗結(jié)果證明，金屬銥配合物具有較好的抗腫瘤活性，可作為HCT116癌細(xì)胞的潛在抗癌藥物被進一步研究。參考文獻FerlayJacques,SoerjomataramIsabelle,DikshitRajesh,etal.CancerIncidenceandMortalityWorldwide:Sources,methodsandmajorpatternsinGLOBOCAN2012.[J].Internationaljournalofcancer,2015,136(5).秦靜波，李竹青，孟翔鶴，等.大健康背景下中醫(yī)體質(zhì)學(xué)在惡性腫瘤防治中應(yīng)用的思考[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2021,44(09):818-823.徐焦，蒙凌華，卿晨.傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀與發(fā)展[J].藥學(xué)學(xué)報，2021,56(06):1551-1561.王冬博，聶晶，武慧娜，等.鉑類抗腫瘤藥物耐藥機制的研究進展和應(yīng)對策略[J].藥學(xué)實踐雜志，2022,40(04):302-308.田甜.基于金屬銥(Ⅲ)配合物熒光探針的應(yīng)用及研究進展[J].江西化工，2022,38(02):64-70.顧順心，姜琴，施鵬飛.發(fā)光銥(Ⅲ)配合物抗腫瘤活性研究及應(yīng)用[J].化學(xué)進展，2022,34(09):1957-1971.顧順心，姜琴，施鵬飛.多聯(lián)吡啶銥(Ⅲ)配合物的合成?發(fā)光及DNA/BSA結(jié)合活性[J].江蘇海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2022,31(01):70-78.祝梓琳，范中賢，繆夢昭，等.銥(Ⅲ)配合物乏氧腫瘤光動力治療[J].化學(xué)進展，2021,33(0