限進性納米粒子薄膜卷柱固相萃取聯(lián)合高效液相色譜測定大鼠血漿中去氫吳茱萸堿和檸檬苦素

限進性納米粒子薄膜卷柱固相萃取聯(lián)合高效液相色譜測定大鼠血漿中去氫吳茱萸堿和檸檬苦素【摘要】目的：建立一種限進性固相萃取聯(lián)合高效液相色譜快速、準確地測定大鼠血漿中去氫吳茱萸堿和檸檬苦素含量的新方法。方法：本實驗利用課題組前期制備的限進性納米粒子薄膜卷柱對大鼠血漿進行前處理，萃取并富集血樣中的去氫吳茱萸堿和檸檬苦素，后續(xù)采用HPLC-UV進行檢測。色譜條件：WondasilC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：0.1%磷酸-水（A）、甲醇（B）、乙腈（C）；采用梯度洗脫，時間程序：0~15min：68~28%（A），17~37%（B），15~35%（C）），15~25min：維持28%（A）、37%（B）、35%（C）不變；進樣量20μL，流速1.0mL/min，檢測波長：去氫吳茱萸堿366nm，檸檬苦素208nm。結果：去氫吳茱萸堿標準曲線為A=99.304c+3.356，相關系數(shù)R=0.9992，線性范圍：0.118~11.8μg/mL。檸檬苦素標準曲線為A=5.8048c+0.6346，相關系數(shù)R=0.9991，線性范圍：0.114~11.4μg/mL。采用2個濃度水平（1和5μg/mL）的混合血漿工作液為樣品進行方法學驗證。去氫吳茱萸堿日內濃度測定值RSD5.99~6.93%，相對回收率89.4~100%，面積絕對回收率78.3~88.0%；日間濃度測定值RSD1.95~3.69%，濃度相對回收率90.8~94.7%，面積絕對回收率85.8~91.7%。檸檬苦素日內濃度測定值RSD2.78~14.4%，濃度相對回收率76.5~84.8%，面積絕對回收率57.6-75.5%；日間濃度測定值RSD11.3~11.6%，濃度相對回收率64.8~76.8%，面積絕對回收率67.0~87.2%?！娟P鍵詞】限進性納米粒子；薄膜卷柱；固相萃??；高效液相色譜；血漿；去氫吳茱萸堿和檸檬苦素

DeterminationofDehydroevodiamineandLimonininRatPlasmabyRestrictedNanoparticleFilmRollColumnSolidPhaseExtractionCombinedwithHPLC[Abstract]Objective:Toestablishanewmethodforrapidandaccuratedeterminationofdehydroevodiamineandlimonininratplasmabyrestrictedsolidphaseextractioncombinedwithhighperformanceliquidchromatography.Methods:Inthiswork,weusedthelimitednanoparticlefilmcoilcolumnpreparedbyourresearchgrouptopretreatratplasma,extractingandenrichingdehydroevodiamineandlimoninfromplasmasamples,followedbyHPLC-UVanalysisoftheobtainedextracts.Chromatographicconditions:WondasilC18column(4.6mm×250mm,5μm);mobilephase:0.1%phosphoricacid-water(A),methanol(B),acetonitrile(C);thegradientelutionprocedure:0-12min:68~28%(A),17~37%(B),15~35%(C)),15~25min:maintaining28%(A),37%(B),35%(C);theinjectionvolumewas20μL,v=1.0mL/min,λ=366nm(dehydroevodiamine)and208nm(limonin).Results：ThecalibrationcurvewasdetectedfordehydroevodiamineasA=99.304c+3.356(R=0.9992)withagoodlinearrelationshipovertherangeof0.118~11.84μg/ml.ThecalibrationcurveoflimoninwasdetectedasA=5.8048c+0.6346(R=0.9991)withagoodlinearrelationshipovertherangeof0.114~11.4μg/mL.Theconstructedmethodswerevalidatedbydetectingthecombinedplasmaworkingsolutionsattwolevelsresults(1and5μg/mL).Fordehydroevodiamine,theintradayandinter-dayconcentrationrelativerecoveryrateswereseparatelydetectedas89.4~100%(RSD5.99~6.93%)and90.8~94.7%(RSD1.95~3.69%),withtheareaabsoluterecoveryratesdetectedseparatelyas78.3~88.0%and85.8~91.7%.Forlimonin,theintradayandinter-dayconcentrationrelativerecoveryrateswereseparatelydetectedas76.5~84.8%(RSD2.78~14.4%)and76.5~84.8%(RSD11.3~11.6%),withtheareaabsoluterecoveryratesdetectedseparatelyas57.6-75.5%and67.0~87.2%.[Keywords]RestrictivenanoparticlesThinfilmrollcolumnSolidphaseextractionHighperformanceliquidchromatographyPlasmaDehydroevodiamineandlimonin

目錄1前言 前言吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodiarutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸Euodiarutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實[1]。主產于貴州、湖南、云南、四川等地。《本草綱目》中記載，吳茱萸能解郁郁結，治酸飲，厥陰痰飲頭痛，陰道腹痛，疝氣，血痢，口腔瘡瘍。2020年版《中國藥典》中記載：吳茱萸性味辛、苦，熱；有小毒。吳茱萸歸肝、脾、胃、腎經?？缮⒑雇?，降逆止嘔，助陽止瀉；用于厥陰頭痛，寒疝腹痛，寒濕腳氣，脘腹脹痛，嘔吐吞酸，五更泄瀉等癥?，F(xiàn)代藥理表明，吳茱萸可鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗氧化，對心血管系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等均具有生理活性[2]。吳茱萸主要含有揮發(fā)油、生物堿、黃酮、苦味素等活性成分。研究表明，生物堿是其主要有效成分，包括去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿等[3]，具有抗腫瘤、保護心血管系統(tǒng)、保護神經、抗炎、抗菌等多種藥理作用[4]。苦味素也是吳茱萸的主要活性成分之一，包括吳茱萸苦素、檸檬苦素等，具有抗腫瘤、保肝、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎、神經保護等作用[6]。去氫吳茱萸堿作為吳茱萸中的主要活性成分之一，具有擴張血管的作用，能抑制膽堿酯酶活性，抑制干擾素(IFN)和脂多糖(LPS)誘導的大鼠巨噬細胞NO的產生，麻醉小鼠血壓[7]。去氫吳茱萸堿對阿爾茨海默病(AD)模型大鼠的空間記憶和tau蛋白磷酸化有預防作用，其機理可能是腦組織海馬內β淀粉樣肽的生成和機體抗氧化作用的增強[8,9]；且其可改善阿爾茨海默癥模型小鼠的記憶障礙和應激引起的認知障礙，被認為是改善阿爾茨海默癥的候選化合物之一[10]，具有一定的開發(fā)應用前景。檸檬苦素是一類具有獨特結構的高度氧化的四降三萜類化合物，具有廣泛的藥理作用，包括抗癌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌抗病毒、抗氧化、保肝等特性。藥理學研究表明，吳茱萸中的生物堿成分可導致肝損傷[5]，這可能是吳茱萸藥材具有小毒的原因之一。此外，檸檬苦素也被證實一定程度上會導致肝毒性、腎毒性和遺傳損傷，其對肝臟代謝酶有復雜的影響[11]。因此，建立一種高效便捷的分析方法快速、準確檢測血漿中去氫吳茱萸堿和檸檬苦素的含量，有利于對兩者的吸收代謝過程及作用機制進行深入研究，對后續(xù)臨床藥理研究、臨床治療藥物監(jiān)測等均具有重要意義和價值。1.1去氫吳茱萸堿和檸檬苦素的檢測方法目前，已報道的有關吳茱萸活性成分檢測的分析方法以液相色譜法為主。借助色譜強大的分離功能，能夠實現(xiàn)多個中藥有效成分的分離與分析，故液相色譜法已經成為中藥材多組分分析、以及體內中藥多組分同時分析的首選工具。1.1.1高效液相色譜法(HPLC-UV)HPLC系統(tǒng)中，流動相攜帶著樣品溶液在高壓輸液泵作用下被泵入裝有固定相的色譜柱內。在柱管內，利用樣品中各個組分在固液兩相間作用力的不同形成差速遷移，從而實現(xiàn)柱內各組分分離后可以分別進入檢測器進行檢測。高效液相色譜法具有流速快、檢測器檢測靈敏度高、分離功能強大等諸多優(yōu)點，尤其適用于復雜組分樣品的檢測。是目前藥物分析最常用的檢測手段。張敏[12]等通過優(yōu)化HPLC條件，建立一種去氫吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸堿以及吳茱萸新堿同時測定的方法，并對其進行系統(tǒng)驗證，從而為吳茱萸質量標準的改良研究提供初步的研究依據(jù)，并為吳茱萸及其飲片的防治提供可靠信息。1.1.2液質聯(lián)用法（HPLC-MS）HPLC-MS采用液相色譜為分離系統(tǒng)，質譜作為檢測系統(tǒng)。樣品在質譜儀中與流動相分離，電離后，離子碎片經質譜的質量分析器按質量數(shù)分開，通過檢測器得到質譜圖。與通常的HPLC儀器不同，液相色譜-質譜聯(lián)用則是采用質譜替代紫外檢測。由于質譜的檢測靈敏度通常遠高于紫外檢測器，因而HPLC-MS具有遠比HPLC-UV更低的檢測限。此外，質譜技術的不斷發(fā)展，利用質譜分析數(shù)據(jù)可以獲得很多的有關待測組分的碎片信息和分子離子峰信息，因而液質聯(lián)用儀頻繁用于目標成分的定性分析。HPLC-MS體現(xiàn)了色譜和質譜的優(yōu)勢互補，它結合了色譜對復雜樣品的高分離能力和質譜的高選擇性、高靈敏度，以及能夠提供相對分子和結構信息等優(yōu)點。被廣泛應用在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領域。楊雁芳[13]等建立了大鼠腦脊液和腦組織中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和去氫吳茱萸堿同時測定的HPLC-MS方法。測定結果表明，三個生物堿成分均能快速吸收進入腦脊液并分布到腦組織，并能快速清除，吳茱萸堿在腦干和小腦分布最多，而吳茱萸次堿和去氫吳茱萸堿分別在腦干、小腦和海馬分布最多。UHPLC-MS是一種利用液相色譜作為質譜儀分離復雜化學成分的進樣系統(tǒng)，使復雜的化學組分得到分離；利用質譜作為檢測器進行定量和定性分析。一級質譜有時會受到儀器分辨率的影響，給定的質荷比不能準確定性，對于相同分子量的不同分子，當儀器分辨率不夠高時，很難區(qū)分它們。而二次質譜可以看到目標物體的一些碎片，并可以分析其結構，可以在一定程度上降低噪聲，提高信噪比，提高靈敏度，從而節(jié)省預處理步驟，提高結果的準確性。UHPLC-MS結合了HPLC的高效分離能力和MS的高靈敏度、強特異性，該分離檢測技術具有應用范圍廣、分離能力強、靈敏度高、速度快、自動化程度高等特點。目前已成為有機物，特別是藥物分析的重要方法之一。趙文燕[14]等建立了一種能高效、快速測定去氫吳茱萸堿和檸檬苦素等含量的方法，且重復性好，特異性強，靈敏度高，經過多元統(tǒng)計集成，能有效區(qū)分吳茱萸粗品和不同的炮制品，為吳茱萸不同飲片的鑒別和質量分析提供了一定的科學參考。程宇欣[15]等用該方法對吳茱萸水提物中生物堿，檸檬苦素等27種化合物給藥后，對大鼠體內原成分及其代謝產物進行了定性分析。研究對吳茱萸水提物中各種成分的體內代謝情況有了初步的了解，為進一步闡明吳茱萸中的有效物質奠定了基礎。1.2生物樣品前處理的方法生物樣品通常需要進行前處理后方可進行后續(xù)色譜檢測。前處理的目的就是在不破壞目標成分的前提下，用適當?shù)姆椒ㄌ崛?、濃縮樣品中的目標成分，同時盡可能除去基質等雜質成分，以減少其對色譜分析的干擾，保證檢測的靈敏度、準確性和可靠性。經過多年來的發(fā)展，血樣前處理的技術得到了極大的提升。目前常用的血樣前處理技術有蛋白沉淀法、液-液萃取法、固相萃取法等。以下著重介紹當前常用血樣前處理方法的特點及其技術現(xiàn)狀。1.2.1液-液萃取法（LLE）液-液萃取法的原理是利用樣品中不同組分在兩種不混溶溶劑中溶解度的差異，來達到分離、提取或者純化的目的。例如，以苯為溶劑從煤焦油中分離苯酚，以異丙醚為溶劑從稀乙酸溶液中回收乙酸等。其優(yōu)點是應用范圍廣，技術成熟，處理樣品量較大。但其缺點也很明顯，主要有：操作繁瑣，耗時長，不易實現(xiàn)自動化，消耗大量有機溶劑，在提取臟水樣品時會發(fā)生乳化或沉淀現(xiàn)象，萃取多個目標組分時不能確保萃取劑對所有組分都有理想的萃取效率。孫習鵬[16]等測定大鼠血漿及組織中多柔比星含量時，為了降低有機試劑的毒性和用量，將血漿與內標樣品混合，逐步加入乙醇和二氯甲烷渦旋混勻方式進行血漿樣品前處理，利用高效液相法測定多柔比星的藥物濃度。1.2.2蛋白沉淀法（PPT）蛋白沉淀法的原理是利用溶劑降低蛋白質的溶解度，使蛋白質凝聚而從溶液中析出。然后高速離心，使蛋白質沉積于底部，待測組分則聚集于上清液中。蛋白沉淀的最主要的優(yōu)勢就是操作簡便、成本低、易于實施。但是此方法主要是針對蛋白基質成分的去除，其它內源性雜質并沒有去除掉，而且在得到的上清液中依然會殘留大量蛋白微粒，多次進樣檢測后可能會沉積于色譜柱表面，從而影響其使用壽命。郭志磊[17]等利用高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度時，血樣與內標樣品混合液中加入甲醇渦旋振蕩，以此方式進行樣品前處理。1.2.3固相萃取法（SPE）SPE通過細顆粒細小的多孔固相吸附劑定量吸附樣品中的分析物，用另一種體積較小的溶劑洗脫，或用熱解吸來解吸分析物，達到分離富集分析物的目的。鑒于當前絕大多數(shù)藥物成分都有較強疏水性，SPE目前主要是采用疏水性萃取材料，故需要沉淀蛋白后才能進行上樣萃取。其優(yōu)點是便于收集組分進行無相分離操作，可處理體積小的樣品，但含有膠體或固體小顆粒的復雜樣品會堵塞固定相的微孔結構，造成色譜柱的損失；使穿透容量和體積固定相的萃取回收率的降低以及固定相的選擇性不高。楊培[18]等采用甲醇活化后的C18固相萃取柱測定血樣中芍藥苷和梔子苷的藥物濃度，避免了磷脂對樣品的干擾。1.2.4限進性固相萃取法（RAM-SPE）限進固相萃?。≧AM-SPE）材料與SPE材料的不同之處在于，RAM-SPE材料的外表面除了吸附目標化合物所用的官能團外，還通過親水性修飾，具有阻斷和干擾大分子的功能，可以防止大分子蛋白質的非特異性吸附，避免SPE萃取材料因蛋白質吸附而帶來的萃取效率降低的問題。同時，疏水性目標藥物分子可以滲透穿過外部的親水限進功能層進入底層與疏水功能集團發(fā)生相互作用，從而保留在SPE萃取材料表面。因此，采用RAM直接處理血漿樣品，不僅簡化了血樣的預處理步驟，節(jié)省了時間，還提高了提取回收率。Oliveira[19]等制備了一種新型具有限進功能的分子印跡聚合物材料，用于萃取人尿液中的雌激素。陳佩純[20]、周經緯[21]等基于實現(xiàn)直接、便捷、高效的大鼠血漿樣品前處理的目標,開展了新型表面限進性(RA)固相萃取(SPE)薄膜卷微柱材料的制備研究，用于直接萃取血樣中的甘草黃酮類、馬錢子生物堿等中藥活性成分。Melissa[22]等通過RAM材料解決了當使用C18固相萃取從蛋白質中分離MHC肽時,高度疏水的肽在樣品制備過程中丟失的問題。1.3研究思路目前，有關去氫吳茱萸堿和檸檬苦素的血樣分析的研究文獻中，血樣前處理方法主要為液液萃取法[23,24]、蛋白沉淀[25,26]等，這些方法不僅需要大量有機試劑，而且還會導致樣品的損失與污染。分析基質復雜的生物樣品如唾液、尿液、血漿、血清等需要快速、精確、穩(wěn)定的前處理方法。所以，本實驗研究擬采用限進性固相萃取方法，可直接、快速處理血漿樣品，得到“清潔”的色譜供試樣品進色譜檢測。據(jù)此建立RAM-HPLC方法，快速準確分析大鼠血漿樣品中的去氫吳茱萸堿和檸檬苦素。RAM材料采用指導老師課題組制備的限進性功能化納米粒子修飾的薄膜卷柱。納米顆粒材料粒徑小，表面積大，可有效增加萃取柱的比表面積，提高提取富集效率。薄膜卷柱至于1mL聚丙烯醫(yī)用注射器內，手動抽吸、排液完成上樣、淋洗、洗脫操作。本論文實驗研究建立的RAM-HPLC分析方法有望應用其它中藥活性成分的體內分析，未來可作為相關（臨床）藥理、臨床治療藥物監(jiān)測、新藥開發(fā)研究提供有效分析工具。

2材料與方法2.1儀器與試劑本實驗研究所用到的儀器與試劑材料分別見表2-1和表2-2。表2-1儀器儀器型號高效液相色譜儀色譜柱液相進樣針電子天平氮吹儀臺式高速小型離心機超聲波清洗器斡旋震蕩儀1mL醫(yī)用注射器Agilent1200SeriesWondasilC18，4.6mm×250mm，5μm迪馬公司，710SNR，100μL日本島津，AUW220D型北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司，UGC-12T大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司，D2012plus昆山市超聲儀器有限公司，KQ3200型MX-S浙江歐健醫(yī)用器械有限公司表2-2試劑與材料試劑與材料規(guī)格去氫吳茱萸堿標準品檸檬苦素標準品甲醇乙腈磷酸純凈水甲酸乙酸乙酯磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉限進性薄膜卷柱成都瑞芬思生物科技有限公司成都瑞芬思生物科技有限公司AR，天津市科密歐化學試劑有限公司GR，默克公司AR，天津市大茂化學試劑廠屈臣氏AR，廣州牌化學試劑AR，廣州牌化學試劑AR，天津市科密歐化學試劑有限公司AR，天津市科密歐化學試劑有限公司課題組制備2.2HPLC條件色譜柱：WondasilC18，4.6mm×250mm，5μm；流動相組成：0.1%磷酸-水（A），甲醇（B），乙腈（C）；梯度洗脫程序：0～15min：68%-28%（A），17%-37%（B），15%-35%（C））；15～25min：維持28%（A）、37%（B）、35%（C）不變；柱溫：室溫，進樣體積：20μL，流速：1.0mL/min，檢測波長：去氫吳茱萸堿366nm，檸檬苦素208nm。2.3溶液配制2.3.1混合標準品儲備液的配制稱取標準品去氫吳茱萸堿（DHE）2.96mg、吳茱萸堿（EVO）2.82mg、檸檬苦素（LIM）2.85mg、吳茱萸次堿（RUT）2.34mg一起裝入5mL容量瓶中，用甲醇定容，得整體濃度為500μg/mL水平的混合標準品儲備液。各成分實際濃度如表2-3所示：表2-3混合標準品儲備液各成分濃度成分濃度（μg/mL）去氫吳茱萸堿（DHE）檸檬苦素（LIM）吳茱萸堿（EVO）吳茱萸次堿（RUT）5925705644682.3.2混合標準品工作液的配制取一定體積500μg/mL濃度水平混標儲備液，用甲醇稀釋到200μg/mL濃度水平混標工作液（DHE：237g/mL，LIM：228μg/mL）作為中間混標儲備液。由此中間混標工作液分別用一定量甲醇按比例稀釋，可得到一系列混標工作液。對應實際濃度如表2-4：表2-4混標工作液成分實際濃度（單位：μg/mL）混標濃度水平DHELIM1004020105511847.423.711.85.922.371.180.5920.1180.059211445.622.811.45.702.281.140.5700.1140.05702.3.3混合標準品血漿工作液的配制取50μL40μg/mL濃度水平的混標液，加入150μL血漿，得10μg/mL（DHE11.8μg/mL、LIM11.4μg/mL）血漿工作液。按照相同方法，分別配制以下不同濃度水平的血漿工作液：5μg/mL（DHE：5.92μg/mL、LIM：5.70μg/mL、EVO：5.64μg/mL、RUT：4.68μg/mL）,1μg/mL（DHE：1.18μg/mL、LIM：1.14μg/mL、EVO：1.13μg/mL、RUT：0.936μg/mL），0.5μg/mL（DHE：0.592μg/mL、LIM：0.570μg/mL、EVO：0.564μg/mL、RUT：0.468μg/mL），0.1μg/mL（DHE：0.118μg/mL、LIM：0.114μg/mL、EVO：0.113μg/mL、RUT：0.0936μg/mL）。2.3.4磷酸緩沖鹽溶液（PBS）的配制稱取一定量的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉分別于50mL容量瓶中，純水定容至刻度，得10mmol/L對應溶液。取一定量磷酸氫二鈉置于燒杯，在攪拌狀態(tài)下緩慢加入磷酸二氫鈉，直至pH計顯示溶液pH為4.0，同法可配制系列pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。2.4最佳固相萃取操作步驟將課題組制備的RAM薄膜材料卷成小柱，置于1mL注射器中，組裝成RAM-SPE裝置，標準溶液/血漿工作液置于EP管中，手動控制柱塞抽吸、排液完成SPE操作。經過實驗優(yōu)化后得到的最佳SPE操作條件如下：活化：1×1000μL甲醇，1×1000μL純水，1×1000μLPBSpH=7，分別抽吸5次上樣：200μL血漿工作液+400μLPBSpH=7，抽吸10次淋洗：1×1000μL純水，抽吸5次洗脫：2×500μL0.5%氨水-甲醇:乙酸乙酯=1:1，分別抽吸7次用課題組制備的RAM薄膜卷柱置于1mL一次性醫(yī)用注射器中，組裝成便捷SPE裝置。將SPE裝置針尖置于不同溶液中，進行抽吸排液操作，依次完成上述各操作步驟，將最終的洗脫液合并，室溫下用氮氣吹干，然后用200μL甲醇復溶，斡旋混勻，得到色譜供試品，取20μL進樣進行HPLC檢測。2.5SPE操作條件評價指標用洗脫回收率ω回收（%）評價SPE操作條件的好壞。其計算公式如下：ω回收(%)=A（2-4-1）其中，A萃取為洗脫液吹干、復溶后得到的色譜供試品檢測的峰面積，A標為等濃度標準品色譜峰面積。2.6精密度與準確度評價指標配制低濃度1.0μg/mL（DHE：1.18μg/mL，LIM：1.14μg/mL）、高濃度5.0μg/mL（DHE：5.92μg/mL，LIM：5.70μg/mL）水平的血漿工作液作為上樣液，經SPE操作后進行HPLC檢測，記錄DHE、LIM峰面積。同一天內，間隔4個小時連續(xù)測定中、高濃度血漿工作液各三組，計算其日內精密度與準確度。連續(xù)三天同一時間測定中、高濃度血漿工作液各一組，計算其日間精密度與準確度。計算公式如下：ω濃度=c（2-5-1）ω面積=A測（2-5-2）其中，ω濃度為濃度相對回收率，ω面積為面積絕對回收率，所測得的峰面積代入至工作曲線可得c測，c標為混合標準品中DHE、LIM的濃度，A測為血漿工作液經SPE處理所得色譜供試品溶液的色譜峰面積，A標為同濃度混合標準品所測得的峰面積。

3結果與討論3.1HPLC分析條件的建立高效液相色譜高效液相色譜高分辨率液相色譜氣相色譜理論是20世紀60年代末在經典液相色譜的基礎上提出來的，它與傳統(tǒng)液相色譜的不同之處在于填料顆粒均勻，小顆粒柱效高但強度高，攜帶流動相要求高壓，故又稱高壓液相色譜，因其速度快又稱高速液相色譜。高效液相色譜應用范圍廣泛，對樣品適用范圍廣，不受對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點、極性、離子化合物和大分子物質都可以使用高效液相色譜(HPLC)進行測定，彌補了氣相色譜的不足。此外，HPLC中梯度洗脫可以縮短總色譜周期，提高分離效率，改善峰型和提高靈敏度。目前，氣相色譜分析約占已知有機化合物的20%左右，高效液相色譜不受樣品溫度和沸點的限制，80%需要高效液相色譜，使其具有更廣闊的應用前景。本論文實驗研究屬于指導老師的吳茱萸活性成分體內分析課題研究的一部分。HPLC-UV分析條件的建立以同時檢測吳茱萸中的去氫吳茱萸堿（DHE）、檸檬苦素（LIM）、吳茱萸堿（EVO）、吳茱萸次堿（RUT）四種成分為目標。DHE、LIM兩個最大吸收峰不同，選擇最大吸收峰可提高檢測結果準確性和良好的數(shù)據(jù)結果。DHE與LIM最大吸收波長分別在366nm和208nm左右，兩者均有一定極性，故而在HPLC中可以通過調節(jié)流動相的極性實現(xiàn)對二者的分離并得到最大檢測靈敏度（見下圖3-1）。RUTLIMARUTLIMAEVO16.7615.23DHE7.23611.88L16.7615.23DHE7.23611.88LIMEVORUT圖3-1混合標準品、血漿工作液色譜圖A：10μg/mL混合標準品（DHE：11.8μg/mL，LIM：11.4μg/mL，EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）；B：經固相萃取的10μg/mL血漿工作液（DHE：11.8μg/mL，LIM：11.4μg/mL，EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）3.2SPE吸附原理在吳茱萸的化學成分中，生物堿類是其第一大化合物。去氫吳茱萸堿(DHE)屬于吲哚喹唑啉類季胺型生物堿（見下圖3-2），具有中等極性及一定的堿性，且DHE具有較強的疏水性，可溶于甲醇、乙醇等有機溶劑中。吳茱萸中萜類化合物以苦味素為主，是吳茱萸中第二大類化合物，檸檬苦素（LIM）微溶于水和乙醚，溶于乙醇、冰醋酸等溶劑，具有較強的疏水性。本實驗根據(jù)DHE和LIM均具有較強疏水性這一特性，以強疏水性的苯環(huán)為功能集團，得以最大程度將這兩種成分吸附保留在萃取介質表面。DehydroevodiamineLimominDehydroevodiamineLimomin圖3-2去氫吳茱萸堿(DHE)和檸檬苦素（LIM）本實驗研究采用的RAM-SPE薄膜卷柱是由課題組研究生先期制備。該薄膜卷柱是將表面接枝有苯甲基疏水性功能基團的SiO2納米粒子通過親水性高分子鏈固定在高分子薄膜表面制得。親水高分子鏈起到限進功能層作用，可將血漿中蛋白等大分子阻隔在外，抑制其吸附在薄膜表面，而DHE、LIM等小分子則可滲入親水限進層，進入疏水層與功能基團（苯甲基）發(fā)生相互作用從而被吸附于薄膜上。然而這種疏水相互作用并非不可逆，通過改變上樣液pH、洗脫液成分等條件可破壞這種相互作用，進而達到把待測組分洗脫下來的目的。3.3SPE操作條件考察SPE初始操作條件如下：活化：1×1000μL甲醇，1×1000μL純水，分別抽吸5次上樣：200μL10μg/mL血漿工作液，抽吸8次淋洗：1×1000μL純水，抽吸5次洗脫：2×500μL1%甲酸-甲醇:乙酸乙酯=1:1，分別抽吸7次上述步驟結束后，合并兩份洗脫液，室溫下N2吹干，殘渣用200μL甲醇溶解，振蕩，超聲，取20μL進液相色譜檢測。由此條件出發(fā)逐一考察上樣、淋洗、洗脫條件。采用10μg/mL濃度水平的血漿工作液作為樣品，改變其中某一條件時，其他條件不變，每個條件平行測定三次計算平均值。3.3.1上樣條件考察DHE和LIM都有一定的極性，而且DHE具有一定堿性，上樣液pH值會對疏水性相互作用產生影響，進而導致吸附效率的變化。因此，實驗中專門考察了上樣液pH值的影響。由圖3-3可知，堿性條件下兩者的最終回收率好于酸性條件。在pH=7、8條件下，DHE和LIM洗脫回收率最高。因為該萃取柱要同時萃取四種成分（DHE、LIM、EVO、RUT），綜合考慮四種成分的萃取回收率，最終確定上樣pH條件為：200μL血漿工作液+400μLPBS（pH=7）。圖3-3緩沖溶液pH考察注：1.ω回收(%)=(A測/A標)×100%。2.只改變上樣液中緩沖溶液pH，其余條件不變。接著又對上樣抽吸次數(shù)的效果進行了考察、由圖3-4可知，，DHE抽吸次數(shù)為10次時最終的洗脫回收率最好（84.1%）；LIM抽吸次數(shù)為11次時洗脫效果最好（73.0%）。綜合考慮另外兩種成分洗脫情況，最終確定抽吸次數(shù)為10次。圖3-4上樣抽吸次數(shù)考察注：1.ω回收(%)=(A測/A標)×100%。2.只改變上樣液抽吸次數(shù)，上述已確定的條件與其余未測定條件均不變。3.3.2淋洗條件考察由圖3-5列出了對淋洗體積的考察結果。DHE淋洗體積為2mL純水時洗脫效果最好（90.7%），LIM淋洗體積為0mL時洗脫效果最好（90.8%）。綜合其他兩種成分洗脫效果，發(fā)現(xiàn)淋洗體積為0mL時洗脫效果最好。但若無淋洗步驟，薄膜卷柱親水層殘留吸附的大分子蛋白無法洗脫下來，容易導致薄膜卷柱壓力變大。這樣不僅對實驗結果造成較大誤差，還會造成SPE薄膜堵塞，大大降低其使用壽命，故而淋洗體積條件確定為1mL純水，抽吸5次。圖3-5淋洗液體積考察注：1.ω回收(%)=(A測/A標)×100%。2.只改變淋洗液體積，上述已確定的條件與其余未測定條件均不變。3.3.3洗脫條件考察分析DHE、LIM、EVO、RUT四者分子結構可以看出，都呈現(xiàn)多個環(huán)狀結構的分子，故都有較強疏水性，洗脫劑的選擇應以破壞其與苯環(huán)的疏水性相互作用力為主。此外，DHE、EVO、RUT都屬于生物堿，具有N原子，可以接受氫質子形成氫鍵，所以帶有氫原子的有機溶劑可以考慮作為洗脫劑。另外，LIM屬于內脂，分子結構中含有多個內酯環(huán)狀結構，DHE、EVO、RUT也都含有羰基，故含有酯鍵基團的有機溶劑應有一定洗脫效果。分別對洗脫液種類、組成、體積、以及洗脫次數(shù)對洗脫回收率的影響進行了考察（測定結果見圖3-6）。首先比較了，甲醇與乙腈的洗脫效果。從表中數(shù)據(jù)可看出，相同條件下（洗脫液體積為500μL×2，抽吸次數(shù)7次），DHE乙腈洗脫回收率要好于甲醇，而LIM的則是兩種溶劑洗脫效果相同，另外EVO、RUT洗脫效果均為甲醇優(yōu)于乙腈，故而選擇甲醇。以甲醇為基礎，考察添加乙酸乙酯的洗脫效果。從表中數(shù)據(jù)可看出，添加了乙酸乙酯后的洗脫效率要好于單純使用甲醇，且隨著添加量增多，洗脫回收率不斷增大。在乙酸乙酯添加比例為50%時，LIM洗脫回收率達到最大（66.6%），此時DHE也達到了81.0%，綜合考慮EVO、RUT的洗脫情況，最終確定乙酸乙酯添加比例為50%（v/v）。鑒于除了LIM外，其它三種成分均為生物堿，因此實驗中分別在1:1（v/v）的甲醇/乙酸乙酯洗脫液中分別添加0.5%、1.0%的甲酸（氨水），考察洗脫液酸堿性的影響。從圖表中數(shù)據(jù)可看，0.5%氨水-乙酸乙酯:甲醇=1:1這一條件DHE和LIM的洗脫效果最好，分別為100.9%、59.3%。其中DHE洗脫率大于100%，原因可能是薄膜卷柱前期使用時未清洗干凈，故而造成數(shù)據(jù)偏大。綜合考慮四種成分的洗脫效果，最終確定洗脫液組成為：0.5%氨水-乙酸乙酯:甲醇=1:1。圖3-6洗脫液種類考察注：1.ω回收(%)=(A測/A標)×100%。2.只改變洗脫液種類，上述已確定的條件與其余未測定條件均不變。其次考察了洗脫液抽吸次數(shù)對洗脫效果的影響。由圖3-7可知，DHE和LIM洗脫效果最好均為抽吸次數(shù)7次，分別為105.4%、58.9%。其中DHE在抽吸次數(shù)7次和10次時洗脫率均大于100%，而在抽吸次數(shù)9次時小于100%（94.3%），且LIM洗脫率逐漸降低，推測可能為混標中其他成分轉變?yōu)镈HE，導致結果異常。綜合考慮四種成分的情況，最終洗脫抽吸次數(shù)選擇為：洗脫抽吸次數(shù)7次。圖3-7洗脫抽吸次數(shù)考察注：1.ω回收(%)=(A測/A標)×100%。2.只改變洗脫抽吸次數(shù)，上述已確定的條件與其余未測定條件均不變。最后考察了洗脫液體積對洗脫效果的影響。由圖3-8可知，對洗脫液體積的考察中，DHE和LIM洗脫效果最好均為500μL×2，分別為105.4%、58.9%。圖3-8洗脫液體積考察注：1.ω回收(%)=(A測/A標)×100%。2.只改變洗脫抽吸次數(shù)，上述已確定的條件不變。綜合上述考察實驗結果，最終確定最佳SPE操作條件為：活化：1×1000μL甲醇，1×1000μL純水，1×1000μLPBSpH=7，抽吸5次上樣：200μL10μm/mL血漿工作液+400μLPBSpH=7，抽吸10次淋洗：1×1000μL純水，抽吸5次洗脫：2×500μL0.5%氨水-甲醇:乙酸乙酯=1:1，分別抽吸7次為防止血漿樣品中蛋白沉積堵塞薄膜卷柱，導致其壽命降低，上樣前血漿樣品使用離心機5000轉高速離心5min，取上清液進行上樣。根據(jù)上述步驟進行SPE操作后，合并兩份洗脫液，使用N2吹干后，加入200μL甲醇進行復溶，斡旋振蕩混勻，取20μL進行液相色譜檢測。3.4方法學驗證3.4.1工作曲線的測定將配制得到的系列濃度血漿工作液按優(yōu)化的SPE操作條件進行前處理后，所得供試品進行HPLC檢測，以DHE和LIM的濃度為橫坐標x，其對應的峰面積為縱坐標y作線性回歸。表3-1和圖3-9分別列出了DHE和LIM的混合血漿工作液測定數(shù)據(jù)和工作曲線圖。去氫吳茱萸堿標準曲線為A=99.304c+3.356，相關系數(shù)R=0.9992，在0.118μg/mL～11.8μg/mL呈良好線性關系。檸檬苦素標準曲線為A=5.8048c+0.6346，相關系數(shù)R=0.9991，在0.114μg/mL～11.4μg/mL呈良好線性關系。表3-1DHE和LIM工作曲線測定結果cDHE（μg/mL）ADHEcLIM（μg/mL）ALIM0.1180.5921.185.9211.812.379.5122.4560.41193.50.1140.5701.145.7011.403.99.13367AA圖3-9DHE和LIM標準曲線注：A：DHE標準曲線圖；B：LIM標準曲線圖3.4.2日內、日間精密度測定本實驗分別對1μg/mL和5μg/mL兩個濃度水平的血樣工作液進行檢測，考察方法準確度和精密度。采用日內、日間濃度相對回收率（%）來評估本方法的準確度，相對標準偏差RSD（%）來評估本方法的精密度。表3-2DHE準確性和精密度加入量（μg/mL）日內日間c測（μg/mL）RSD(%)ω濃度(%)ω面積(%)c測（μg/mL）RSD(%)ω濃度(%)ω面積(%)1.181.325.9989.488.01.301.9590.891.75.925.926.93100994.785.8注：ω濃度(%)=(c測/c標)×100%，ω面積(%)=(A測/A標)×100%。如表3-2所示，去氫吳茱萸堿日內RSD值在5.99%-6.93%，日間RSD值在1.95%-3.69%，均符合體內藥物分析的要求（RSD≤15%）。日內濃度相對回收率在89.4%-100%，面積絕對回收率在78.3%-88.0%；日間濃度相對回收率在90.8%-94.7%，面積絕對回收率在85.8%-91.7%。表3-3LIM準確性和精密度加入量（μg/mL）日內日間c測（μg/mL）RSD(%)ω濃度(%)ω面積(%)c測（μg/mL）RSD(%)ω濃度(%)ω面積(%)1.141.4914.476.557.61.7611.664.887.25.706.722.7884.875.57.4211.376.867.0注：ω濃度(%)=(c測/c標)×100%，ω面積(%)=(A測/A標)×100%。如表3-3所示，檸檬苦素日內RSD值在2.78%-14.4%，日間RSD在11.3%-11.6%，基本符合體內藥物分析要求。日內濃度相對回收率在76.5%-84.8%，面積絕對回收率在57.6%-75.5%；日間濃度相對回收率在64.8%-76.8%，面積絕對回收率在67.0%-87.2%，兩者基本達到體內藥物分析的要求。濃度測定結果的準確度和精密度均符合藥典相關規(guī)定，但兩者的面積絕對回收率，特別是LIM的面積絕對回收率偏低，可能是柱子表面負載量偏低，導致其對LIM吸附性不夠強。這說明柱子的制備條件還需要進一步優(yōu)化。

4結論本實驗探討了以限進性納米粒子薄膜卷柱對大鼠血漿進行前處理萃取并富集血樣中的去氫吳茱萸堿和檸檬苦素的效果。實驗考察優(yōu)化了SPE操作條件，測定了工作曲線方程，并進行了2個濃度水平的日內日間精密度和準確度考察。根據(jù)實驗結果可以看出，去氫吳茱萸堿和檸檬苦素的工作曲線均呈良好的線性關系，其精密度和準確度符合藥典體內藥物分析的規(guī)定。薄膜卷柱對兩種成分的萃取面積絕對回收率偏低（尤其是檸檬苦素），推測可能是薄膜卷柱負載量偏低導致，此外也可能跟SPE的抽吸排液操作不均勻有關。后續(xù)需要在這些方面加以改進。

參考文獻[1]中國藥典2020年版.一部[S].2020:178.[2]倪曉婷,李兆星,陳晨等.吳茱萸的化學成分與生物活性研究進展[J].中南藥學,2022,20(03):657-667.[3]魏舒婷,劉元乾,黃堅等.吳茱萸化學成分、藥效及肝毒性的研究進展[J].世界中醫(yī)藥,2020,15(23):3580-3585+3592.[4]M.Li,C.Wang.Traditionaluses,phytochemistry,pharmacology,pharmacokineticsandtoxicologyofthefruitofTetradiumruticarpum:Areview[J].JournalofEthnopharmacology,2020,263:113231.[5]孫向明,胡揚,溫靜等.吳茱萸致肝毒性部位在大鼠體內的多樣性分析[J].質譜學報,2021,42(06):1113-1126.[6]尤文挺,王灑,何龍等.檸檬苦素單體的藥理活性研究進展[J].中藥材,2017,40(01):242-246.[7]崔曉秋.吳茱萸化學成分研究[D].長春:吉林農業(yè)大學,2004.[8]彭均華.去氫吳茱萸堿在Alzheimer樣tau蛋白過度磷酸化中的保護作用及其機制[D].武漢:華中科技大學,2007.[9]張常娥,王曉麗,趙燦國等.去氫吳茱萸堿對D-半乳糖大鼠學習記憶障礙的預防作用及其機制[J].廣東醫(yī)學,2012,33(16):2395-2397.[10]尚曉慶.去氫吳茱萸堿新型固態(tài)形式的制備、表征及評價[D].太原:山西醫(yī)科大學,2021.[11]S.Fan,C.Zhang,T.Luo,etal.Limonin:AReviewofItsPharmacology,Toxicity,andPharmacokinetics[J].Molecules,2019,24(20):3679.[12]張敏,董嘉皓,李斐等.高效液相色譜法同時測定吳茱萸醇提物中4種生物堿[J].醫(yī)藥導報,2019,38(09):1203-1207.[13]楊雁芳,張伊楠,張友波等.液質聯(lián)用法測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿在大鼠腦脊液和腦組織中的分布（英文）[J].中國藥學,2022,31(01):13-22.[14]趙文燕,張安然,王蟬等.基于UPLC-MS/M